Las membranas celulares están muy llenas debido a la presencia de proteínas y azúcares incrustados. Demostramos imágenes de moléculas individuales en bicapas lipídicas sintéticas apiñadas soportadas. Esta plataforma es útil para investigar el efecto del hacinamiento en las reacciones biomoleculares de membrana, a nivel molecular.
El protocolo explica el análisis de unión, difusión y ensamblaje de biomoléculas de membrana. El éxito en el experimento depende de una limpieza rigurosa del sustrato, evitando daños a la bicapa y manteniendo una alta relación señal/ruido en imágenes de moléculas individuales. Demostrando el procedimiento conmigo están Aditya Upasani y Vishwesh Haricharan Rai, estudiantes graduados del laboratorio.
Comience colocando el portaobjetos de acrílico tratado con plasma sobre papel de seda limpio. Despegue la cinta cortada con láser de doble cara y péguela a la corredera. Con una punta de pipeta, aplana la cinta para evitar fugas de un canal a otro.
Cierre la cámara colocando el cubreobjetos tratado con plasma sobre el portaobjetos con cinta adhesiva. Con la punta de una pipeta, presione suavemente el deslizamiento de la cubierta en las regiones pegadas con cinta adhesiva para que el canal sea hermético. Si utiliza portaobjetos de vidrio, selle los bordes con resina epoxi.
Almacene las cámaras de imágenes microfluídicas preparadas durante una o dos semanas en condiciones de desecación. Tome un vial de vidrio previamente limpio con solución de piraña y agregue la solución de cloroformo de POPC y DOPE-PEG (2000) a la fracción molar deseada de lípidos PEG 2000 para obtener la concentración final de lípidos de tres milimolares, después de agregar el tampón. Del mismo modo, se pueden preparar otras composiciones de membrana de lípidos.
A continuación, seque el cloroformo del vial con una corriente suave de nitrógeno con un pequeño remolino para que los lípidos deseados se cubran uniformemente en la superficie del vial. Elimine el cloroformo residual manteniendo el vial en un desecador al vacío durante una hora. Luego agregue un mililitro de PBS al vial e incube durante la noche a 37 grados centígrados.
Después de la incubación durante la noche, vorete suavemente el vial durante uno o dos minutos hasta que la solución se vuelva turbia y lechosa. Ahora transfiera 100 microlitros de esta solución a un pequeño tubo centrífugo de 500 microlitros. Para generar pequeñas vesículas unilamelares de 50 a 100 nanómetros de diámetro, sonicar la solución durante aproximadamente una hora en un sonicador de baño.
Al final de la sonicación, la solución se volverá clara, si la solución sigue siendo turbia, sonicar durante 30 minutos adicionales. Luego agregue cloruro de calcio a las vesículas sonicadas a una concentración final de 30 milimolares en la solución lipídica. Corte una punta de micropipeta para inyectar la solución de muestra de modo que quepa bien en el orificio.
Mezcle la solución lipídica e inyéctela a través de uno de los orificios de la cámara de imágenes. Limpie el exceso de solución que sale de la cámara desde la salida con pañuelo limpio para evitar la contaminación de los canales adyacentes. Prepare una cámara de humidificación colocando tejido húmedo en el extremo de un tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Coloque el portaobjetos en el tubo y cierre la tapa del tubo. Coloque el tubo de lado y deje este conjunto en una cámara humidificada durante 90 minutos, preferiblemente en una incubadora a 37 grados centígrados. Lave bien la cámara con una gran cantidad de tampón PBS, evitando que entren burbujas de aire en la cámara durante el lavado, ya que esto puede generar defectos en la membrana.
Antes de realizar cualquier experimento sobre movilidad y ensamblaje, alinee el microscopio TIRF preparando una muestra de perlas fluorescentes y añadiéndolas al canal microfluídico a bajas concentraciones de modo que las manchas fluorescentes de perlas individuales no se superpongan en las imágenes. Primero, visualice las cuentas en modo de epifluorescencia. Mientras la iluminación está en modo de epifluorescencia, mueva el espejo M5 sentado en una etapa de traslación de tal manera que el haz que sale del objetivo se doble hasta que se logre la configuración de reflexión interna total.
Para verificar si se ha logrado la iluminación TIR, compruebe que solo las perlas de la superficie son visibles cuando el campo evanescente TIR ilumina la muestra de cuentas y no se observan perlas flotantes libres lejos de la superficie. Al comienzo del experimento, ajuste la potencia del láser en el plano focal posterior del objetivo a cinco a 10 milivatios para evitar la fotodestrucción de los fluoróforos. Mantenga el portaobjetos en la etapa del microscopio y concéntrese primero en la membrana desnuda, pequeños rastros de impurezas en las membranas lipídicas son suficientes para visualizar la membrana.
Inyecte la muestra con una micropipeta en la cámara de imágenes recubierta de PEG SLB. Para medir la cinética de unión de moléculas individuales, use una bomba de jeringa para hacer fluir las biomoléculas marcadas a través de los orificios de entrada hacia la cámara microfluídica a una velocidad de flujo de 50 a 500 microlitros por minuto. Para grabar 5.000 fotogramas a 25 a 50 fotogramas por segundo, defina los parámetros de adquisición de vídeo necesarios.
Comience la adquisición de películas y adquiera más de 5, 000 cuadros bajo flujo continuo desde la bomba de la jeringa hasta que no haya un aumento adicional en la aparición de nuevas manchas en la superficie de la membrana, y analice la cinética de unión como se describe en el manuscrito. Para el seguimiento de partículas individuales, agregue las biomoléculas marcadas a bajas concentraciones al canal utilizando una micropipeta. Para garantizar la alta fidelidad de las pistas recuperadas de los conjuntos de datos, optimice la concentración a una densidad de menos de 0,1 partículas por micrómetro cuadrado, de modo que las partículas individuales rara vez se crucen.
Si es necesario, incube la cámara en un ambiente humidificador y lávela con el tampón antes de la toma de imágenes. Para el análisis de trayectoria de una sola partícula, adquiera de 200 a 500 fotogramas a 10 a 100 fotogramas por segundo y mantenga la lente del objetivo enfocada en el plano bicapa con una deriva mínima de la etapa durante la adquisición de la imagen. Para medir subunidades, agregue la concentración relevante de biomoléculas marcadas a la cámara de imágenes microfluídicas e incube el portaobjetos en una cámara de humidificación a la temperatura deseada durante el tiempo requerido.
Antes de tomar imágenes, lave la cámara de imágenes con un tampón. Coloque el portaobjetos en un microscopio y ajuste el enfoque para visualizar las moléculas etiquetadas. Ajuste la potencia del láser a un nivel en el que el blanqueamiento del fluoróforo se produzca gradualmente.
Idealmente, para cada complejo ensamblado, controle la potencia del láser para mantener la velocidad de paso de blanqueo fotográfico entre 10 y 20 cuadros de distancia como se describe en el manuscrito, y adquiera las imágenes hasta que todas las moléculas estén completamente fotoblanqueadas. Realice una medición de ensamblaje dependiente del tiempo iniciando la adquisición de películas tan pronto como la muestra se introduzca en la cámara y adquiriendo nuevas películas de fotoblanqueo a intervalos de tiempo fijos después de la unión de membrana de diferentes segmentos del PEG SLB. La unión de citolisina A a las membranas lipídicas con cinco moles por ciento DOPE-PEG (2000) mostró una mayor densidad de partículas y alcanzó la saturación.
Una función de decaimiento exponencial ajustada a las partículas unidas da la constante de tiempo para la unión a la membrana de citolisina A. Sin ningún polímero PEG en la membrana, la mayoría de los trazadores mostraron difusión restringida en SLB. Pequeños niveles de PEG 2000 en la bicapa de membrana se elevaron lejos de la superficie subyacente, permitiendo que las moléculas trazadoras se difundieran sin restricciones superficiales.
Sin embargo, se observa un confinamiento extremo a una alta concentración de PEG en la membrana bicapa. La distribución de ISD2 para la difusión del trazador de ADN lipofílico en dos membranas lipídicas PEG 2000 diferentes mostró una disminución de la movilidad a altas concentraciones de PEG. Después de incubar en la abarrotada membrana de bicapa lipídica, la citolisina A mostró muchos pasos distintos de fotoblanqueo, lo que sugiere la formación de varios intermedios de ensamblaje.
Después de corregir la eficiencia del marcado, la distribución final de oligómeros mostró la especie dodecamérica Cytolysin A como la estructura dominante. El ensamblaje de unión a proteínas de membrana y otras reacciones deben llevarse a cabo en entornos apropiados de apiñamiento de membrana. Se debe prestar atención a la limpieza de la cámara de imágenes, evitando interrumpir la bicapa y configurando el microscopio TIRF.
