קרומי התאים צפופים מאוד בשל נוכחותם של חלבונים וסוכרים משובצים. אנו מדגימים הדמיה של מולקולה בודדת על דו-שכבתי שומנים סינתטיים נתמכים בצפיפות. פלטפורמה זו שימושית לחקר השפעת הצפיפות על תגובות ביומולקולריות של ממברנות, ברמה המולקולרית.
הפרוטוקול מסביר את ניתוח הקשירה, הדיפוזיה וההרכבה של ביומולקולות ממברנה. ההצלחה בניסוי תלויה בניקוי קפדני של המצע, הימנעות מפגיעה בדו-שכבה ושמירה על יחס אות לרעש גבוה בהדמיה של מולקולה בודדת. המדגימים איתי את הנוהל הם אדיטיה אופאסאני, ווישוואש האריצ'ראן ראי, סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה.
התחילו בהנחת שקופית האקרילית המטופלת בפלזמה על נייר טישו נקי. מקלפים את סרט החיתוך הדו-צדדי בלייזר ומדביקים אותו לשקופית. באמצעות קצה פיפטה, שטחו את הקלטת כדי למנוע דליפה מערוץ אחד למשנהו.
סגור את התא על-ידי הנחת הכיסוי המטופל בפלזמה על השקופית המודבקת. בעזרת קצה פיפטה, לחצו בעדינות על המכסה באזורים המודבקים כדי להדק את מי התעלה. אם משתמשים בזכוכית מחליקים אוטמים את הקצוות באמצעות שרף אפוקסי.
אחסנו את תאי ההדמיה המיקרופלואידיים שהוכנו למשך שבוע עד שבועיים בתנאי ייבוש. קח בקבוקון זכוכית שניקה מראש באמצעות תמיסת פיראנה, והוסף תמיסת כלורופורם של POPC ו- DOPE-PEG (2000) בחלק השומה הרצוי של ליפידים PEG 2000 כדי לקבל את ריכוז השומנים הסופי של שלושה מילימולר, לאחר הוספת החיץ. באופן דומה ניתן להכין הרכבי ממברנה אחרים של שומנים.
לאחר מכן, ייבשו את הכלורופורם מהבקבוקון באמצעות זרם עדין של חנקן עם מערבולת קטנה, כך שהשומנים הרצויים מצופים באופן אחיד על פני השטח של הבקבוקון. יש להסיר את שאריות הכלורופורם על ידי שמירת הבקבוקון במייבש ואקום למשך שעה. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של PBS לבקבוקון ומדגרים לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר דגירה של לילה, מערבבים בעדינות את הבקבוקון במשך דקה עד שתיים עד שהתמיסה הופכת עכורה וחלבית. עכשיו להעביר 100 microliters של פתרון זה לתוך צינור צנטריפוגה קטן 500 מיקרוליטר. כדי לייצר שלפוחיות חד-עיניות קטנות בקוטר 50 עד 100 ננומטר, סוניקו את התמיסה למשך כשעה בסוניק אמבטיה.
בסוף הסוניקציה התמיסה תתבהר, אם התמיסה עדיין עכורה אז סוניקטור למשך 30 דקות נוספות. לאחר מכן הוסיפו סידן כלורי לשלפוחית הסוניקטית לריכוז סופי של 30 מילימולאר בתמיסת השומנים. חותכים קצה מיקרו פיפטה כדי להזריק את תמיסת הדגימה כך שהיא תיכנס לחור בחוזקה.
מערבבים את תמיסת השומנים ומזריקים אותה דרך אחד החורים בתא ההדמיה. נגב את הפתרון העודף שיוצא מהתא מהשקע עם רקמה נקייה כדי למנוע זיהום של ערוצים סמוכים. הכן תא לחות על ידי הצבת רקמה רטובה בקצה צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.
הנח את המגלשה בצינור וסגור את מכסה הצינור. הניחו את הצינור לצדדים והשאירו את ההרכבה הזו בתא לח למשך 90 דקות, רצוי באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. לשטוף את התא ביסודיות עם כמות גדולה של חיץ PBS, מניעת בועות אוויר להיכנס לתא בזמן הכביסה, כמו זה יכול ליצור פגמים בממברנה.
לפני ביצוע ניסוי כלשהו על ניידות והרכבה, יישר את מיקרוסקופ TIRF על ידי הכנת דגימת חרוזים פלואורסצנטיים והוספתם לתעלה המיקרופלואידית בריכוזים נמוכים, כך שכתמי פלואורסצנט מחרוזים בודדים אינם חופפים בתמונות. ראשית, דמיינו את החרוזים במצב אפיפלואורסצנטי. בעוד שהתאורה נמצאת במצב אפיפלואורסצנטי, הזיזו את מראה ה-M5 היושבת על במת תרגום כך שהקרן היוצאת מהמטרה תתכופף עד להשגת תצורת השתקפות פנימית כוללת.
כדי לוודא אם הושגה תאורת TIR, בדוק שרק החרוזים על פני השטח נראים כאשר שדה האוורור של TIR מאיר את דגימת החרוזים ולא נצפו חרוזים צפים חופשיים הרחק מהמשטח. בתחילת הניסוי, הגדר את עוצמת הלייזר במישור המוקד האחורי של המטרה לחמישה עד 10 מילי-וואט כדי למנוע הרס פוטו של הפלואורופורים. שמור את השקופית על שלב המיקרוסקופ והתמקד תחילה בקרום החשוף, עקבות קטנים של זיהומים בקרומי השומנים מספיקים כדי לדמיין את הממברנה.
הזרקת הדגימה באמצעות מיקרו פיפטה לתוך תא ההדמיה המצופה PEG SLB. למדידת קינטיקה של קשירת מולקולה בודדת, השתמש במשאבת מזרק כדי להזרים את הביומולקולות המסומנות דרך חורי הכניסה לתא המיקרופלואידי בקצב זרימה של 50 עד 500 מיקרוליטר לדקה. כדי להקליט 5, 000 מסגרות ב 25 עד 50 מסגרות לשנייה, הגדר את הפרמטרים הנדרשים לרכישת סרטים.
התחל לרכוש סרטים ולרכוש יותר מ -5, 000 מסגרות תחת זרימה מתמשכת ממשאבת המזרק עד שאין עלייה נוספת בהופעת כתמים חדשים על פני הממברנה, ולנתח את הקינטיקה המחייבת כמתואר בכתב היד. למעקב אחר חלקיקים בודדים הוסיפו את הביומולקולות המסומנות בריכוזים נמוכים לתעלה באמצעות מיקרו פיפטה. כדי להבטיח את הנאמנות הגבוהה של המסלולים שהתאוששו ממערכי הנתונים, מטב את הריכוז לצפיפות של פחות מ-0.1 חלקיקים למיקרומטר מרובע, כך שחלקיקים בודדים כמעט ולא חוצים נתיבים.
במידת הצורך, לדגור את התא בסביבה מרטיבה ולשטוף עם החיץ לפני ההדמיה. לניתוח מסלול של חלקיקים בודדים, רכשו 200 עד 500 פריימים בקצב של 10 עד 100 פריימים לשנייה ושמרו על העדשה האובייקטיבית הממוקדת במישור הדו-שכבתי עם סחף שלב מינימלי במהלך רכישת התמונה. למדידת תת-יחידות, הוסיפו את הריכוז הרלוונטי של ביומולקולות מסומנות לתא ההדמיה המיקרופלואידי, ודגרו את השקופית בתא אדים בטמפרטורה הרצויה למשך הזמן הנדרש.
לפני ההדמיה, לשטוף את תא ההדמיה עם חיץ. מקם את השקופית על מיקרוסקופ והתאם את המיקוד כדי להמחיש את המולקולות המסומנות. הגדר את כוח הלייזר לרמה שבה הלבנה של הפלואורופור מתרחשת בהדרגה.
באופן אידיאלי עבור כל שליטה מורכבת שהורכבה, עוצמת הלייזר שומרת על קצב שלב הלבנת התמונות בין 10 ל-20 פריימים זה מזה כמתואר בכתב היד, ורוכשת את התמונות עד שכל המולקולות מולבנות לחלוטין. בצע מדידת הרכבה תלוית זמן על ידי התחלת רכישת סרטים ברגע שהדגימה מוכנסת לתא ורכישת סרטי הלבנת תמונות חדשים במרווחי זמן קבועים לאחר קשירת הממברנה ממקטעים שונים של PEG SLB. קשירת ציטוליזין A לממברנות שומניות עם חמישה אחוזי שומה DOPE-PEG(2000) הציגה צפיפות חלקיקים מוגברת והשגת רוויה.
פונקציית דעיכה מעריכית המתאימה לחלקיקים המאוגדים נותנת את קבוע הזמן לקשירת קרום ציטוליזין A. ללא כל פולימר PEG בממברנה, רוב העוקבים הציגו דיפוזיה מוגבלת על SLBs. רמות קטנות של PEG 2000 בממברנה דו-שכבתית הוסרו מהמשטח התחתון, מה שאפשר למולקולות העקיבה להתפזר ללא מגבלות פני השטח.
עם זאת, כליאה קיצונית נצפתה בריכוז גבוה של PEG בקרום הדו-שכבתי. התפלגות ISD2 לדיפוזיה של מעקב DNA ליפופילי בשני ממברנות שומנים שונות מסוג PEG 2000 הראתה ירידה בניידות בריכוזים גבוהים של PEG. לאחר דגירה על הממברנה הדו-שכבתית הצפופה של השומנים, ציטוליזין A הציג צעדי הלבנה רבים ומובחנים, מה שמרמז על היווצרותם של מתווכי הרכבה שונים.
לאחר תיקון יעילות הסימון, ההתפלגות הסופית של האוליגומרים הראתה את המין ציטוליזין A הדודקמרי כמבנה הדומיננטי. הרכבה של חלבון ממברנה ותגובות אחרות צריכות להתבצע בסביבות צפיפות ממברנה מתאימות. יש לשים לב לניקוי תא ההדמיה, הימנעות משיבוש הדו-שכבתי והקמת מיקרוסקופ TIRF.
