Name: preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging
Uploaded: 2014-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
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Los autores no tienen reconocimientos.

1. Mica y Preparación Diapositivas <ol><li> Lugar N º 1 ½ (0,17 mm) en cubreobjetos gradilla de tinción. </li><li> Someter a ultrasonidos durante 30 min en 2% de detergente a 60 ° C. </li><li> Lavar 20 veces con agua desionizada. </li><li> Retirar los portaobjetos usando pinzas y secar con aire comprimido o nitrógeno. </li><li> Cortar la hoja de mica en 10 x 10 mm piezas cuadradas con unas tijeras o cuchilla de afeitar. </li><li> Corte cada pedazo de mica en 2-3 foliolos delgados utilizando una hoja de afeitar. NOTA: Este paso requiere el uso de la hoja afilada. </li></ol> 2. Asamblea Mica y la Cámara de montaje <ol><li> Limpio portaobjetos de vidrio microscópico con etanol. </li><li> Pegamento folleto de mica cortado en el paso de 1,6 a portaobjetos de vidrio utilizando adhesivo óptico. Se aconseja adhesivo de baja viscosidad, para difundir mejor la caída y la cola de la mica. </li><li> Curar bajo la lámpara UV, 10 min. NOTA: El adhesivo se curó con luz UV con un máximo de absorción en el intervalo de 350 a 380 nm y la energía recomendada required para el curado total es de 4,5 J / cm 2. Sin embargo, diferentes fuentes de luz se pueden utilizar para este paso (ver materiales proporcionados por proveedor del adhesivo). </li><li> Exponer una superficie de mica limpio mediante la eliminación de las primeras capas con cinta Scotch. </li><li> Coloque una pequeña gota (~ 20 m) de adhesivo óptico sobre la superficie de mica. NOTA: En este paso, se aconseja alto pegamento viscosidad con bajo nivel de autofluorescencia. Nuestra experiencia ha demostrado que el uso de combinación de baja (paso 2.2) y los adhesivos de alta viscosidad aumenta significativamente la eficacia de la escisión mica (paso 2.7). </li><li> Coloque suavemente el cubreobjetos recién limpiada en la gota de adhesivo, evitando las burbujas de aire, dejar reposar durante 1 minuto. </li><li> Curar bajo la lámpara UV, 10 min. NOTA: después de este paso, el sándwich de lámina de vidrio, mica y cubreobjetos se puede almacenar durante un período relativamente largo de tiempo (hasta varias semanas). Continúe con el siguiente paso justo antes de la preparación efectiva SLB, para asegurarse de que la superficie de la mica es fresco. NOTA: Adhesivo se cura por la luz UV con la máxima absorción en el intervalo de 350 a 380 nm y la energía recomendada necesaria para el curado completo es 4.5J/cm 2. Sin embargo, diferentes fuentes de luz se pueden utilizar para este paso (ver materiales proporcionados por proveedor del adhesivo). </li><li> Usando un cuchillo exacto, desmontar suavemente el cubreobjetos de portaobjetos de vidrio lateral como se muestra en el video. En la mayoría de los casos, una capa delgada y plana de la mica permanecerá unido a la cubreobjetos. Mica adjunta a portaobjetos de vidrio pueden ser reutilizados (repita desde el paso 2.4). </li><li> Compruebe la calidad de la superficie a simple vista o bajo un microscopio de disección, para asegurarse de que la capa de mica está todavía pegada a la cubreobjetos y no se ha eliminado completamente durante la división en el paso 2.8. Haciendo un pequeño rasguño con una pinza o aguja de disección ayudará a distinguir entre el adhesivo que tiene una consistencia de forma detectable diferente de mica. </li><li> Retire el sello de goma de un ml frasco tapa 1,5 y pegar la tapa boca abajo a la superficie utilizando ópticaadhesivo o esmalte de uñas, y curar con lámpara UV, o dejar secar al aire 10 minutos, respectivamente. NOTA: Si se prepara la muestra para su uso simultáneo óptica (TIRFM o confocal) con imágenes de AFM, un ml frasco tapa 1.5 puede ser demasiado pequeño para montar la cabeza AFM en la platina del microscopio. En ese caso, la tapa podría ser sustituida por cualquier junta tórica de plástico con un diámetro más grande, adecuada para el montaje de la cabeza de AFM. En caso de que el experimento requiere quitar la tapa sin dañar la superficie de la mica, grasa de silicona se puede utilizar en lugar de pegamento o esmalte de uñas. </li></ol> 3. Apoyado bicapa lipídica (SLB) Formación <ol><li> Coloque solución de liposomas recién preparada en la cámara con la superficie. El volumen mínimo requerido para la formación de SLB es ~ 30 l. NOTA: Para más detalles sobre el liposoma y la formación de SLB, se refieren a los protocolos publicados, como por ejemplo, bolsa y otros, 2014 15.. </li><li> Proceda con la formación de SLB con el protocolo deseado. Durante la incubación yde formación de imágenes, la cámara se puede colocar en un bloque de calor o platina del microscopio calentado para mantener la temperatura necesaria para mantener los lípidos que se utilizan por encima de su temperatura de fusión. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un método para la preparación de superficies lisas y finas de mica para la deposición de bicapa de lípidos y formación de imágenes de alta resolución. La técnica requiere habilidades manuales mínimas, limitadas principalmente a la desmontaje cuidadoso de la sándwich de vidrio-mica y vidrio (paso 2.8), que es crítico para la obtención de una superficie de mica de alta calidad. Inspección de la mica recién escindido siempre se requiere en este punto, ya que es posible para la mica se desprenda del adhesivo óptico sin escindir, dejando las áreas expuestas de adhesivo óptico. Eso podría resultar en el depósito no deseado de la bicapa de adhesivo en lugar de en la mica. La superficie de mica preparada según el método descrito es, con pocas excepciones paralelas a la superficie cubreobjetos, a juzgar por la alta calidad y uniformidad de imagen óptica que obtuvimos; por lo tanto, no vemos la necesidad de una verificación adicional. El último paso en el montaje de la cámara se puede personalizar. El tutorial de vídeo muestra una1,5 ml tapa de plástico vial de vidrio que se utiliza como una cámara, sin embargo esto puede ser sustituido con cualquier objeto de forma similar y dimensiones deseadas, por ejemplo, para formación de imágenes AFM-TIRFM/confocal simultánea, donde la muestra con su soporte tiene que encajar en la cabeza AFM . Montaje de una cámara de encargo se pueden saltar, si la imagen se va a realizar utilizando un estándar, 35 mm cámara de la celda de metal. En este caso, sin embargo, un 25 milímetros de vidrio cubierta redonda tiene que ser usado, y un volumen mucho más grande de solución de liposomas se requiere para la formación SLB. Los resultados presentados aquí muestran que la única molécula de formación de imágenes y de seguimiento se puede hacer fácilmente en superficies de mica extremadamente planas lo suficientemente delgadas para ser susceptibles de formación de imágenes TIRFM, de acuerdo con el protocolo descrito para la preparación de la superficie. La misma preparación se puede aplicar a otras técnicas, incluyendo la microscopía óptica de alta resolución, tales como espectroscopia de correlación de fluorescencia de reflexión interna total (TIR-FCS). Es importante destacar que, SLBS Prepared de la misma manera (o incluso las mismas muestras exactas) puede ser utilizado en ambas configuraciones experimentales, un criterio esencial para la comparación directa de los resultados obtenidos usando diferentes métodos, por ejemplo, AFM, SMT, FCS, y FRAP.

El objetivo general del presente protocolo es mostrar un método para la preparación de superficies de mica de alta resolución de imagen de mica apoyados bicapas lipídicas (SLBS) mediante microscopía óptica total de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) o microscopía confocal, que también se podría combinar con la fuerza atómica microscopía (AFM). SLBS son un modelo ampliamente utilizado para numerosos estudios de la agrupación de lípidos, la separación de fases, la dinámica de componentes de la bicapa o sus interacciones con péptidos, proteínas u otros compuestos 1-5. Diferentes sustratos pueden ser utilizados para la formación de SLB (es decir, vidrio, mica, dióxido de silicio, polímeros) dependiendo de la naturaleza del estudio 4,6-8. Estudios de membrana típicos se basan en técnicas de formación de imágenes basada en microscopía, tales como TIRFM y AFM. Por lo tanto, para obtener imágenes TIRFM, una superficie de vidrio es una opción típica porque el vidrio es transparente. Preparación de vidrio es relativamente fácil, y la calidad de los resultados es principalmentedeterminado por la superficie de limpieza a fondo antes de la deposición de las vesículas de lípidos. AFM, debido a su elevada resolución axial requiere superficies de mica. La mica es un mineral de silicato, con cerca de clivaje basal perfecto. Así, el recién exfoliados mica es atómicamente plana, lo que permite la observación de las diferencias de altura de la membrana, incluso a escala sub-nanométrica 9. Los estudios de difusión utilizando métodos tales como la espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), sola molécula de seguimiento (SMT), y la recuperación de la fluorescencia después de photobleaching (FRAP) mostraron sin embargo, que la dinámica de la membrana de lípidos dependen en gran medida del tipo de superficie sobre la que se depositan, en el que el vidrio y la mica puede dar resultados muy variables 10,11. Estas diferencias incluyen no sólo los coeficientes de difusión de las sondas de membrana, sino también la detección de poblaciones separadas de las partículas que se difunden con diferentes tasas, y posiblemente la conmutación entre diferentes estados. Por lo tanto,la comparación directa de los resultados obtenidos utilizando técnicas TIRFM y AFM es a menudo problemática, a menos que la misma superficie (en este caso la mica) se utiliza. Aunque hay algunos estudios en los que se llevó a cabo TIRFM y AFM de imágenes bicapa en la misma superficie de mica 12,13, mica se utiliza muy poco para la microscopía óptica, sobre todo debido a problemas de manejo. Preparación Mica requiere de corte a mano en folletos delgadas, que luego se pegan a la cubreobjetos usando adhesivo óptico 12. Este método, sin embargo requiere un poco de práctica para lograr resultados satisfactorios. Además, las superficies obtenidas son a menudo ondulado y grueso, lo que dificulta su uso con distancia de trabajo bajo, lentes de alta apertura numérica. Superficies de mica preparados como se describe en este protocolo son muy delgadas (~ 220 m, incluyendo el espesor cubreobjetos de 170 m) y extremadamente plana, evitando &quot;ondulación&quot;, que es fundamental para la imagen de alta resolución con éxito. Se pueden utilizarpara TIRFM o confocal configuraciones. Por otra parte, las mismas muestras se pueden transferir a AFM, e incluso reflejados simultáneamente con TIRFM / confocal y AFM. La combinación de estas dos técnicas permite la correlación directa de comportamiento de la difusión con la estructura 14 de la membrana bicapa. Debido a que las superficies de mica están recién troceados, que estén limpias y no requieren mucho tiempo, poco reproducibles, y los procedimientos de limpieza potencialmente peligrosos (protocolos de limpieza de vidrio por lo general incluyen productos químicos como solución Piranha, ácido sulfúrico, hidróxido de sodio / potasio). Montaje de una pequeña cámara, también se describe en el protocolo, reduce el volumen de vesículas necesarios para la formación de bicapa eficaz a menos de 50 l. Finalmente, todo el proceso de montaje de superficie no es mucho tiempo (preparación tarda menos de 30 min), y no requiere un alto grado de habilidad manual, al igual que la escisión de mica convencional y encolado.

<table><tbody><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15051</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5</td><td>Marienfeld</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850357</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III (detergent)</td><td>Hellma Analytics</td><td>320.003</td><td></td></tr><tr><td>Mica V-1 Grade</td><td>SPI Suppliers</td><td>1872-CA</td><td></td></tr><tr><td>Optical Adhesive (high viscosity)</td><td>Norland Products</td><td>NOA63</td><td></td></tr><tr><td>Optical Adhesive (low viscosity)</td><td>Norland Products</td><td>NOA60</td><td></td></tr><tr><td>Sphingomyelin-ATTO647N</td><td>AttoTec</td><td>AD 647N-171</td><td></td></tr><tr><td>UV lamp</td><td>Synoptics Ltd.</td><td>GelVue GVM20</td><td>The lamp was set to 100% power</td></tr></tbody></table>

preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging

Bicapas lipídicas soportadas (SLBS) son ampliamente utilizados como modelo para el estudio de propiedades de la membrana (separación de fases, la agrupación, la dinámica) y su interacción con otros compuestos, como los fármacos o péptidos. Sin embargo las características SLB difieren dependiendo del soporte utilizado. Técnicas utilizadas comúnmente para SLB óptica y mediciones son microscopía de fluorescencia de una sola molécula, de FCS y microscopía de fuerza atómica (AFM). Debido a que la mayoría de los estudios de formación de imágenes ópticas se llevan a cabo en un soporte de vidrio, mientras que AFM requiere una superficie extremadamente plana (generalmente de mica), los resultados de estas técnicas no se pueden comparar directamente, ya que las propiedades de carga y la suavidad de estos materiales influyen fuertemente en la difusión. Desafortunadamente, el alto nivel de destreza manual necesaria para el corte y pegado de láminas finas de mica para el portaobjetos de vidrio presenta un obstáculo para el uso rutinario de la mica para la preparación SLB. Aunque esto sería el método de elección, tales mica preparadosuperficies con frecuencia terminan siendo desigual (ondulado) y difícil de la imagen, especialmente con la pequeña distancia de trabajo, lentes de alta apertura numérica. Aquí presentamos un método simple y reproducible para la preparación de superficies planas delgadas de mica para la deposición de vesículas de lípidos y preparación SLB. Además, nuestra cámara por encargo requiere sólo pequeñas cantidades de vesículas para la formación de SLB. Los resultados del procedimiento general en la producción eficiente, simple y barato de superficies bicapa de lípidos de alta calidad que son directamente comparables a los utilizados en los estudios de AFM.

El comportamiento de la difusión de sondas fluorescentes de lípidos en SLBS es diferente dependiendo del sustrato. TIRFM combinado con la técnica SMT es un método valioso para la visualización de movimientos de partículas y la extracción de sus coeficientes de difusión. Señales de moléculas individuales de una sonda de esfingomielina-ATTO647N de difusión en un DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) bicapa apoyado sobre el vidrio y mica se muestran en la figura animada adjunto. La superficie de la mica se preparó de acuerdo con el protocolo que se presenta aquí. Para estimar las aberraciones ópticas, se midió el ancho a la mitad del máximo (FWHM) y un promedio de más de la función de dispersión del punto 20 (PSF) utilizando Mosaico 2D PSF Tamaño ImageJ Plugin 16,17. El FWHM medido para el vidrio y mica eran 441nm y 464 nm, respectivamente (Figura 1). La diferencia en la resolución de 22 nm entre la formación de imágenes sobre el vidrio y mica no es significativa. En ambos casos, el centroide fibras discontinuas de poliéster de cada molécula fluorescente solo se puede LOCAlizado en cuadros sucesivos, y vinculado en trayectorias de las partículas con el tiempo con el mosaico de partículas Rastreador ImageJ plugin de 16,17. La figura 2 muestra las trayectorias de la muestra de partículas que se difunden a través de la bicapa soportada sobre ambas superficies. Los desplazamientos cuadráticos medios (MSD) de la sonda fluorescente de difusión en la membrana de DOPC apoyado sobre el vidrio y mica se representan en la Figura 3. Debido a la coexistencia de múltiples poblaciones de dos modelo de población se utilizó para extraer los coeficientes de difusión rápidos y lentos, según el método descrito por Schutz (Figura 4, Figura 5) 18. Los coeficientes de difusión, y sus fracciones se extrajeron utilizando el software TrackArt 19 y se resumen en la Tabla 1. Los resultados de este ejemplo demuestran la existencia de dos estados separados de la sonda de difusión: rápido y lento. El coeficiente de difusión de la población rápido es más o menos 10,5 veces más alta en la mica que en el vidrio. Sin embargo, el componente lento, es casi inmóvil sobre el vidrio (&lt;0,01 m 2 / seg), en comparación con una D de sólo ~ 1/10 la población rápido sobre mica. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52054/52054fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Tamaño PSF media. Perfil Promedio intensidad PSF por 20 puntos medidos en el vidrio (línea continua negro) y mica (línea roja punteada). La anchura total a la mitad del máximo (FWHM) de la intensidad normalizada para el vidrio y mica se estimó en 441 nm y 464 nm, respectivamente. La diferencia de 22 nm indica que no hay ninguna caída significativa en la resolución de imagen entre estas dos superficies. Perfil de intensidad PSF se midió utilizando la herramienta Mosaico PSF 2D ImageJ plugin de 16,17. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52054/52054fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 2. Trayectorias de ejemplo. Trayectorias de ejemplo de SM-ATTO647N de difusión en una bicapa de lípidos DOPC apoyado sobre el vidrio (A) y de mica (B). En la bicapa de vidrio soportada, la sonda a menudo se inmoviliza sobre la superficie, de vez en cuando de conmutación al estado de difusión rápida. Sondas de difusión en la mica apoyado bicapa, en contraste, rara vez se inmovilizan en la superficie. En su lugar, tienden a cambiar de estado de difusión rápida y lenta. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52054/52054fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52054/52054fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Media desplazamientos cuadrados. Desplazamiento cuadrático medio<html> mentos de partículas SM-ATTO647N difunden en un vidrio (■) y mica (●) apoyó DOPC bicapa. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52054/52054fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52054/52054fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Distribución de probabilidad acumulativa se ajusta. Distribución de probabilidad acumulativa (CPD) de desplazamientos cuadrados y se ajusta para el modelo de difusión biexponencial (dos población) de las partículas SM-ATTO647N de difusión sobre el vidrio-(A) y la mica-(B) apoyó bicapas DOPC. Distribuciones y ajustes sólo se presentan por quinta vez-lag (Δ t = 50 ms). Los cálculos y las parcelas se obtienen utilizando el software TrackArt 19.lacio &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52054/52054fig5highres.jpg" width="500" /> Parcelas Figura 5. MSD y parcelas de fracciones. MSD para el ayuno (r 1 2) y lento (r 2 2) la difusión de la población y la fracción de la población rápido (F 1), calculado a partir de los ataques de DPC. Los resultados se presentan por separado para partículas SM-ATTO647N de difusión sobre el vidrio-(A) y la mica-(B) apoyados bicapas DOPC. Los cálculos y las parcelas se obtuvieron utilizando software TrackArt 19. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52054/52054fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672"><tbody><tr height = &quot;46&quot;&gt; <td height="46" style="height:46px;width:72px;"></td><td colspan="4" style="width:301px;"> Población 1 (rápido) </td><td colspan="4" style="width:301px;"> Población 2 (lento) </td></tr><tr height="67"><td height="67" style="height:67px;width:72px;"></td><td colspan="2" style="width:136px;"> D 1 (2 m / seg) </td><td colspan="2" style="width:165px;"> Fracción (%) </td><td colspan="2" style="width:136px;"> D 2 (2 m / seg) </td><td colspan="2" style="width:165px;"> Fracción (%) </td></tr><tr height="51"><td height="51" style="height:51px;width:72px;"> Vidrio </td><td colspan="2" style="width:136px;"> 1,840 ± 0,031 </td><td colspan="2" style="width:165px;"> 65,19 ± 0,56 </td><td colspan="2" style="width:136px;"> 0,006 ± 0,001 </td><td colspan="2" style="width:165px;"> 34,81 ± 0,56 </td></tr><tr height="52"><td height="52" style="height:52px;"> Mica </td><td colspan = &quot;2&quot;&gt; 2,440 ± 0,023 </td><td colspan="2"> 53.88 ± 0.26 </td><td colspan="2"> 0,176 ± 0,002 </td><td colspan="2" style="width:165px;"> 46.12 ± 0.26 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Los coeficientes de difusión. Resumen de las estadísticas de difusión. Los coeficientes de difusión para las poblaciones lentos y rápidos, y sus fracciones. Los cálculos se realizaron en el software TrackArt usando un modelo de dos población. Trayectorias fueron reconocidos y vinculados mediante mosaico de partículas Rastreador ImageJ plugin. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52054/1.mp4" target="_blank">Figura Animado</a> :. difusión moléculas individuales película Timelapse TIRFM de esfingomielina-ATTO647N difusión en una bicapa DOPC apoyado sobre vidrio (izquierda) y la mica (derecha). La barra de escala es de 5 micras.

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Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Presentamos un método de preparación de mica apoyado bicapas lipídicas de microscopía de alta resolución. La mica es transparente y plana en una escala atómica, pero rara vez se utiliza en la formación de imágenes debido a dificultades de manejo; nuestra preparación resulta en la deposición uniforme de la hoja de mica, y reduce el material utilizado en la preparación bicapa.

Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.3K vistas.  Nanyang Technological University.  Presentamos un método de preparación de mica apoyado bicapas lipídicas de microscopía de alta resolución. La mica es transparente y plana en una escala atómica, pero rara vez se utiliza en la formación de imágenes debido a dificultades de manejo; nuestra preparación resulta en la deposición uniforme de la hoja de mica, y reduce el material utilizado en la preparación bicapa. 

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Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

El apoyo de bicapa plana para la Formación de Estudio de la sinapsis inmunológica y Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

Investigación

Biología

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Formación de biomembrana Microarrays con un método basado en la Asamblea Rasero

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Bioingeniería

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrana Fabrication por la bicapa lipídica (SALB) Método-Solvente asistida

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-resolución de imagen de la célula Natural Killer inmunológica Synapse en un apoyada-Glass planar bicapa lipídica

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Inmunología e Infección

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

Difusión y ensamblaje de una sola molécula en membranas lipídicas llenas de polímeros

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

Bioquímica

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Ensamblaje de modelos de bicapa lipídica soportada y suspendida de imitación celular para el estudio de interacciones moleculares

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

Reconstitución de corticidades mínimas de actina atadas a la membrana en bicapas lipídicas soportadas

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Planar Supported Lipid Bilayer Assay: A Microscopy-Based In Vitro Technique to Investigate Septin Assembly on Biological Membrane Mimics

Source: Curtis, B. N. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/64090">Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions.</a> J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we demonstrate a procedure to investigate septin organization on a glass-supported lipid bilayer in vitro using total internal reflection fluorescence microscopy.

Ensayo de bicapa lipídica soportada plana: una técnica in vitro basada en microscopía para investigar el ensamblaje de septinas en imitaciones de membranas biológicas

Source: Curtis, B. N. et al. Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions. J. Vis. Exp. (2022)
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