الأغشية الخلوية مزدحمة للغاية بسبب وجود البروتينات والسكريات المدمجة. نحن نعرض تصوير جزيء واحد على الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة المزدحمة الاصطناعية. هذه المنصة مفيدة للتحقيق في تأثير الازدحام على التفاعلات الجزيئية الحيوية الغشائية ، على المستوى الجزيئي.
يشرح البروتوكول تحليل ربط وانتشار وتجميع الجزيئات الحيوية الغشائية. يعتمد النجاح في التجربة على التنظيف الدقيق للركيزة ، وتجنب تلف الطبقة الثنائية ، والحفاظ على نسبة إشارة عالية إلى الضوضاء في تصوير جزيء واحد. يوضح الإجراء معي Aditya Upasani ، و Vishwesh Haricharan Rai ، طلاب الدراسات العليا من المختبر.
ابدأ بوضع شريحة الأكريليك المعالجة بالبلازما على ورق مناديل نظيفة. قشر الشريط المقطوع بالليزر على الوجهين وألصقه بالشرائح. باستخدام طرف ماصة، قم بتسطيح الشريط لمنع التسرب من قناة إلى أخرى.
أغلق الغرفة عن طريق وضع الغطاء المعالج بالبلازما على الشريحة المسجلة. باستخدام طرف ماصة، اضغط برفق على الغطاء على المناطق المسجلة لجعل القناة محكمة الإغلاق. إذا كنت تستخدم شرائح زجاجية ، فقم بإغلاق الحواف باستخدام راتنجات الايبوكسي.
قم بتخزين غرف التصوير الموائع الدقيقة المعدة لمدة أسبوع إلى أسبوعين تحت ظروف مجففة. خذ قارورة زجاجية تم تنظيفها مسبقا باستخدام محلول البيرانا ، وأضف محلول الكلوروفورم من POPC و DOPE-PEG (2000) في جزء الخلد المطلوب من دهون PEG 2000 للحصول على تركيز الدهون النهائي من ثلاثة ملليمولار ، بعد إضافة المخزن المؤقت. وبالمثل ، يمكن تحضير تركيبات غشائية أخرى من الدهون.
بعد ذلك ، قم بتجفيف الكلوروفورم من القارورة باستخدام تيار لطيف من النيتروجين مع دوامة صغيرة بحيث يتم طلاء الدهون المطلوبة بشكل موحد على سطح القارورة. قم بإزالة الكلوروفورم المتبقي عن طريق الاحتفاظ بالقارورة في مجفف فراغ لمدة ساعة واحدة. ثم أضف ملليلتر واحد من PBS إلى القارورة واحتضنها بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، دوامة القارورة بلطف لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى يتحول المحلول إلى عكر وحليبي. الآن نقل 100 ميكرولتر من هذا الحل إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 500 ميكرولتر. لتوليد حويصلات أحادية الصفيحة الصغيرة التي يتراوح قطرها بين 50 و 100 نانومتر ، قم بسونيكات المحلول لمدة ساعة واحدة تقريبا في سونيكتور الحمام.
في نهاية الصوتنة ، سيصبح الحل واضحا ، إذا كان المحلول لا يزال عكرا ، فعندئذ سونيك لمدة 30 دقيقة إضافية. ثم أضف كلوريد الكالسيوم إلى الحويصلات الصوتية إلى تركيز نهائي قدره 30 ملليمول في محلول الدهون. قم بقص طرف ماصة صغير لحقن محلول العينة بحيث يتناسب مع الفتحة بإحكام.
امزج محلول الدهون وحقنه من خلال أحد الثقوب الموجودة في غرفة التصوير. امسح المحلول الزائد الذي يخرج من الغرفة من المخرج بأنسجة نظيفة لمنع تلوث القنوات المجاورة. قم بإعداد غرفة ترطيب عن طريق وضع أنسجة مبللة في نهاية أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر.
ضع الشريحة في الأنبوب وأغلق غطاء الأنبوب. ضع الأنبوب جانبيا واترك هذه المجموعة في غرفة رطبة لمدة 90 دقيقة ، ويفضل أن يكون ذلك في حاضنة عند 37 درجة مئوية. اغسل الغرفة جيدا بكمية وفيرة من المخزن المؤقت PBS ، مما يمنع فقاعات الهواء من دخول الغرفة أثناء الغسيل ، لأن هذا يمكن أن يولد عيوبا في الغشاء.
قبل إجراء أي تجربة على التنقل والتجميع ، قم بمحاذاة مجهر TIRF عن طريق إعداد عينة من حبة الفلورسنت وإضافتها إلى قناة الموائع الدقيقة بتركيزات منخفضة بحيث لا تتداخل بقع الفلورسنت من الخرز الفردي في الصور. أولا ، تصور الخرز في وضع epifluorescence. أثناء وجود الإضاءة في وضع التألق ، حرك مرآة M5 التي تجلس على مرحلة الترجمة بحيث ينحني الشعاع الخارج من الهدف حتى يتم تحقيق تكوين الانعكاس الداخلي الكلي.
للتحقق مما إذا كانت إضاءة النقل البري الدولي (التير) قد تحققت، تحقق من أن الخرز الموجود على السطح فقط هو المرئي عندما يضيء حقل النقل البري الدولي (التير) عينة الخرز ولا يتم ملاحظة الخرز العائم الحر بعيدا عن السطح. في بداية التجربة ، اضبط طاقة الليزر على المستوى البؤري الخلفي الموضوعي على خمسة إلى 10 مللي واط لمنع تدمير الصور للفلوروفورات. حافظ على الشريحة على مرحلة المجهر وركز على الغشاء العاري أولا ، فالآثار الصغيرة للشوائب في الأغشية الدهنية كافية لتصور الغشاء.
حقن العينة باستخدام ماصة صغيرة في غرفة التصوير المطلية ب PEG SLB. لقياس حركيات ربط جزيء واحد ، استخدم مضخة حقنة لتدفق الجزيئات الحيوية المصنفة عبر ثقوب المدخل إلى غرفة الموائع الدقيقة بمعدل تدفق يتراوح بين 50 و 500 ميكرولتر في الدقيقة. لتسجيل 5000 إطار بمعدل 25 إلى 50 إطارا في الثانية، اضبط معلمات اقتناء الأفلام المطلوبة.
ابدأ في الحصول على الفيلم واحصل على أكثر من 5000 إطار تحت التدفق المستمر من مضخة المحقنة حتى لا تكون هناك زيادة أخرى في ظهور بقع جديدة على سطح الغشاء ، وقم بتحليل حركية التجليد كما هو موضح في المخطوطة. لتتبع الجسيمات المفردة ، أضف الجزيئات الحيوية المصنفة بتركيزات منخفضة إلى القناة باستخدام ماصة صغيرة. لضمان الدقة العالية للمسارات المستردة من مجموعات البيانات ، قم بتحسين التركيز إلى كثافة أقل من 0.1 جسيم لكل ميكرومتر مربع ، بحيث نادرا ما تتقاطع الجسيمات الفردية مع المسارات.
إذا لزم الأمر ، احتضن الغرفة في بيئة رطبة واغسلها بالمخزن المؤقت قبل التصوير. لتحليل مسار الجسيمات المفردة، احصل على 200 إلى 500 إطار بمعدل 10 إلى 100 إطار في الثانية وحافظ على العدسة الموضوعية التي تركز على المستوى ثنائي الطبقة مع الحد الأدنى من انحراف المرحلة أثناء الحصول على الصورة. لقياس الوحدات الفرعية ، أضف التركيز ذي الصلة من الجزيئات الحيوية المصنفة إلى غرفة التصوير الموائع الدقيقة ، واحتضن الشريحة في غرفة ترطيب عند درجة الحرارة المطلوبة للوقت المطلوب.
قبل التصوير ، اغسل غرفة التصوير بمخزن مؤقت. ضع الشريحة على المجهر واضبط التركيز البؤري لتصور الجزيئات الموسومة. اضبط طاقة الليزر على مستوى يحدث فيه تبييض الفلوروفور تدريجيا.
من الناحية المثالية لكل مجمع مجمع مجمع ، يمكنك التحكم في قوة الليزر للحفاظ على معدل خطوة تبييض الصور بين 10 إلى 20 إطارا كما هو موضح في المخطوطة ، والحصول على الصور حتى يتم تبييض جميع الجزيئات بالكامل. قم بإجراء قياس تجميع يعتمد على الوقت من خلال بدء الحصول على الفيلم بمجرد إدخال العينة إلى الغرفة والحصول على أفلام تبييض صور جديدة على فترات زمنية ثابتة بعد ربط الغشاء من أجزاء مختلفة من PEG SLB. أظهر ربط Cytolysin A بالأغشية الدهنية بنسبة خمسة في المائة من DOPE-PEG (2000) زيادة في كثافة الجسيمات وتحقيق التشبع.
تعطي دالة الاضمحلال الأسي المناسبة للجسيمات المرتبطة الوقت الثابت لربط غشاء Cytolysin A. بدون أي بوليمر PEG في الغشاء ، أظهرت معظم أجهزة التتبع انتشارا مقيدا على SLBs. مستويات صغيرة من PEG 2000 في الطبقة الثنائية الغشائية رفعت بعيدا عن السطح الأساسي ، مما يسمح لجزيئات التتبع بالانتشار دون قيود سطحية.
ومع ذلك ، لوحظ الحبس الشديد عند تركيز عال من PEG في الغشاء ثنائي الطبقة. أظهر توزيع ISD2 لنشر مقتفي الحمض النووي المحب للدهون في اثنين من الأغشية الدهنية PEG 2000 المختلفة انخفاضا في الحركة عند تركيزات عالية من PEG. بعد احتضان غشاء ثنائي الطبقة الدهني المزدحم Cytolysin A عرض العديد من خطوات تبييض الصور المتميزة ، مما يشير إلى تشكيل مختلف وسيطات التجميع.
بعد تصحيح كفاءة وضع العلامات ، أظهر التوزيع النهائي ل oligomers نوع دوديكاميريك Cytolysin A كهيكل مهيمن. يجب إجراء تجميع ربط بروتين الغشاء والتفاعلات الأخرى في بيئات ازدحام الغشاء المناسبة. يجب الانتباه إلى تنظيف غرفة التصوير ، وتجنب تعطيل الطبقة الثنائية ، وإعداد مجهر TIRF.
