Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 31501099) y el Departamento de Educación Media y Joven de la Provincia de Hubei, China (No. Q20191104). Además, agradecemos al profesor Wensheng Deng de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Wuhan por proporcionar las líneas de células madre embrionarias del ratón A2lox.

1. Cultivo de células madre embrionarias del ratón
<ol><li>Prepare platos o platos de cultivo celular recubiertos de gelatina al 0,1%.<ol>
<li>Añadir 2 ml de gelatina esterilizada del 0,1% (0,1% w/v en agua) a platos de cultivo celular de 60 mm. Rockear suavemente para asegurar incluso el recubrimiento de los platos de cultivo celular.</li>
		<li>Coloque los platos en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C y deje el recubrimiento durante 1 h.</li>
		<li>Retire la solución de gelatina del 0,1% antes de sembrar las células. NOTA: Después de retirar la gelatina, no es necesario secar o lavar los platos recubiertos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultivo de células madre embrionarias del ratón (A2lox y 129)<ol>
<li>Incubar células mESC (A2lox y 129) en el 0,1% de gelatina recubierta de 60 mm de platos de cultivo celular en medio de crecimiento mESC a 37 °C en una incubadora de CO2 del 5%, respectivamente. El medio de crecimiento del mESC consiste en un 85% de eliminación dmem/F12, 15% reemplazo sérico knock-out (KSR), 0,1 mM β-mercaptoetanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% aminoácido no esencial (NEAA), 1% penicilina/estreptomicina (P/S), 1000 factor inhibitorio de leucemia U/mL (LIF), 10 nM CHIR-99021 (inhibidor de GSK-3) y 0,33 nM PD0325901 (inhibidor de MEK). PRECAUCIÓN: β-mercaptoetanol es inflamable y tiene toxicidad por inhalación. Manténgase alejado de las fuentes de fuego y use una máscara para evitar la inhalación cuando se utilice.</li>
		<li>Cambie el medio de crecimiento del MESC diariamente para un mejor crecimiento de A2lox y 129.</li>
		<li>Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, retire el medio y agregue 1 ml de 0,1% de trippsina al plato. Mezcle suavemente durante 30 s para asegurar una cobertura uniforme de trypsina en todas las células.</li>
		<li>Deje las celdas durante aproximadamente 1 minuto para probar eltamaño de la triptina y luego retire la trippsina usando pipeta de 1 ml.</li>
		<li>Añadir 2 ml de medio de crecimiento mESC al plato, pipeta arriba y abajo varias veces para hacer una sola suspensión celular.</li>
		<li>Contar la densidad de las células en la suspensión con la mayor precisión posible utilizando hemociclo.</li>
		<li>Divida las células en 7 grupos e induzca la diferenciación utilizando diferentes protocolos que se muestran en la Tabla 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Diferenciación de mESC a PNJ (Fase I)
<ol><li>Prepare placas de cultivo celular recubiertas de gelatina al 0,1% o cubre manchas.<ol>
<li>Antes de su uso, prepare 0.1% de placas de gelatina recubiertas de 6 pozos o cubrecubres como en el paso 1.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciación de fase I mediante el protocolo 1 (Tabla 1)<ol>
<li>Semillas de aproximadamente 2 x 104 mESC en 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%. Compruebe la densidad celular bajo un microscopio.</li>
		<li>Incubar las células a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 6 h para permitir el apego.</li>
		<li>Después del apego, saque de las células de la incubadora y lave las células dos veces con 2 ml de PBS.</li>
		<li>Agregue 2 ml de medio de diferenciación basal I(Tabla 1)a cada pozo y vuelva a colocar las células en la incubadora.</li>
		<li>Deje las células para la diferenciación durante 8 días. Reemplace el medio de diferenciación basal I cada 2 días.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciación de fase I mediante el protocolo 2 (Tabla 1)<ol>
<li>Añadir 1,5 x 106 mESC en un plato bacteriano nodhesivo en 10 ml de medio de diferenciación basal I para permitir la formación de cuerpos embrionados a 37 °C en una incubadora de CO2 del 5%.</li>
		<li>Después de 2 días, transfiera los agregados celulares a 15 tubos centrífugas de ml y déjelos establecer por gravedad.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y agregue 10 ml de medio de diferenciación basal fresco I para resuspend los cuerpos embrionados. Replantarlos en un nuevo plato bacteriano nodhesivo y permitir la diferenciación durante otros 2 días.</li>
		<li>Compruebe la formación de cuerpos embrionarios bajo el microscopio (Figura 2A).</li>
		<li>Recoger cuerpos embrionarios como se describe en los pasos 2.3.2-2.3.3. Semillas alrededor de 50 cuerpos embrionarios en 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en placas de 6 pozos recubiertas de gelatina del 0,1%.</li>
		<li>Prepare 1 mM de caldo ra totalmente trans (en DMSO) y guárdelo lejos de la luz en un congelador de -80 °C después del subenvasado. NOTA: La AR es inestable, y se debe prestar atención a mantenerla alejada de la luz y reducir el contacto con el aire durante la preparación del caldo de RA.</li>
		<li>Para la inducción de AR, agregue 2 μL de caldo de AR en cada pozo para hacer una concentración final de 1 μM.</li>
		<li>Coloque la placa en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C y diferencie durante otros 4 días.</li>
		<li>Cambie los 2 ml enteros del medio de diferenciación basal I (con 1 μM RA) cada 2 días.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciación de fase I mediante el protocolo 3 (Tabla 1)<ol>
<li>Plantar 1,5 x 106 mESC en un plato bacteriano nodhesivo en 10 ml de medio de diferenciación basal I. Dejar durante 2 días para la formación de cuerpos embrionados a 37 °C en una incubadora de CO2 del 5%.</li>
		<li>Compruebe la formación de cuerpos embrionarios bajo un microscopio(Figura 2B).</li>
		<li>Transfiera los agregados celulares a tubos centrífugas de 15 ml y déjelos establecer por gravedad.</li>
		<li>Retire el sobrenadante cuidadosamente y agregue 10 ml de medio de diferenciación basal fresco I para volver a usarlos.</li>
		<li>Sembrar alrededor de 50 cuerpos embrionarios en 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%.</li>
		<li>Para la inducción de AR, agregue 2 μL de caldo de AR en cada pozo para hacer una concentración final de 1 μM.</li>
		<li>Coloque la placa en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C y diferencie durante otros 6 días. Cambie todo el medio de diferenciación basal I (con 1 μM RA) cada 2 días.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciación de fase I mediante el protocolo 4 (Tabla 1)<ol>
<li>Semillas de aproximadamente 2 x 104 mESC dentro de 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%. Coloque la placa en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C para permitir la fijación durante 6 h.</li>
		<li>Después de la fijación, lave las células dos veces con 2 ml de PBS. Añadir 2 ml de medio de diferenciación basal I a cada pozo y permitir la diferenciación durante 4 días en la incubadora de CO2 del 5% a 37 °C.</li>
		<li>Para la inducción por AR, añadir 2 μL de caldo de AR trans en cada pozo (la concentración de trabajo es de 1 μM) para inducir la diferenciación durante otros 4 días.</li>
		<li>En todo el proceso, reemplace todo el medio cada 2 días.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciación de fase I mediante el protocolo 5 (Tabla 1)<ol>
<li>Semillas de aproximadamente 2 x 104 mESC dentro de 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%. Coloque la placa en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C para permitir la fijación durante 6 h.</li>
		<li>Lave las células dos veces con 2 ml de PBS. Añadir 2 ml de medio de diferenciación basal I a cada pozo y permitir la diferenciación durante 2 días en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C.</li>
		<li>Para la posterior inducción de AR, añadir 2 μL de caldo de AR en cada pozo para hacer una concentración final de 1 μM. Coloque la placa en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C para inducir la diferenciación durante otros 6 días.</li>
		<li>En todo el proceso, reemplace todo el medio cada 2 días.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciación de fase I mediante el protocolo 6 (Tabla 1)<ol>
<li>Plantar 1,5 x 106 mESC en un plato bacteriano nodhesivo en 10 ml de N2B27 medio II(Tabla 1)para permitir la formación de cuerpos embrionarios.</li>
		<li>Eldía 2, recoja los agregados celulares como se describe en los pasos 2.3.2-2.3.3 y resuspend los cuerpos embrionarios usando 10 ml de N2B27 medio II fresco.</li>
		<li>Replantarlos en un nuevo plato bacteriano nodhesivo y permitir la diferenciación durante otros 2 días en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C. Compruebe la formación de cuerpos embrionarios bajo microscopio.</li>
		<li>El día4, recoge cuerpos embrionarios. Sembrar alrededor de 50 cuerpos embrionarios por pozo en placas de 6 pozos recubiertas de gelatina del 0,1% con 2 ml de N2B27 medio II.</li>
		<li>Añadir 2 μL de caldo de AR totalmente trans en cada pozo e inducir la diferenciación durante otros 4 días. Reemplace todo el medio (N2B27 medio II por 1 μM RA) cada dos días.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciación de fase I mediante el protocolo 7 (Tabla 1)<ol>
<li>Semillas de aproximadamente 2 x 104 mESC dentro de 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%. Coloque la placa en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C para permitir la fijación durante 6 h.</li>
		<li>Lave las células dos veces con PBS. A continuación, añadir 2 ml de N2B27 medio II a cada pozo y permitir la diferenciación durante 8 días a 37 °C en una incubadora de CO2 del 5%.</li>
		<li>Cambie todo el medio N2B27 II cada 2 días.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Observación morfológica celular
<ol><li>Compruebe el estado de diferenciación de los 7 grupos mencionados anteriormente diariamente bajo un microscopio de luz de contraste de fase invertido.</li>
	<li>Seleccione aleatoriamente al menos 12 campos y tome fotos para registrar los cambios morfológicos de cada grupo en D8.</li>
</ol>4. Tinción de inmunofluorescencia
<ol><li>Preparación de la muestra: Plecciones de semillas en 0.1% coverslips recubiertos de gelatina y permiten la diferenciación durante 8 días utilizando los protocolos mencionados en el paso 2.</li>
	<li>Enjuague: El día8, saque las muestras de la incubadora y retire el medio de diferenciación por aspiración. Enjuague suavemente las células una vez con 1 ml de PBS durante 5 minutos.</li>
	<li>Fijación: Agregue 1 ml de paraformaldehído al 4% a cada muestra y fije las celdas durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Enjuague: Después de la fijación, enjuague suavemente las células con 1 ml de PBS 3 veces, durante 5 minutos cada una.</li>
	<li>Permeabilización: Añadir 1 ml de 0.2% TritonX-100 en PBS a cada muestra y dejar durante 8 minutos en RT.</li>
	<li>Enjuague: Después de la permeabilización, enjuague suavemente las células con 1 ml de PBS 3 veces, durante 5 minutos cada una.</li>
	<li>Bloqueo: Añadir 1 ml de suero de cabra al 10% en PBS a cada muestra e incubar en RT durante 1 h para bloquear cualquier interacción no específica.</li>
	<li>Incubación con anticuerpo primario<ol>
<li>Diluir el anticuerpo anti-Nestin a una proporción de 1:100 usando 5% suero de cabra en PBS.</li>
		<li>Aplicar 500 μL de anticuerpo diluido en diferentes muestras e incubar durante la noche a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjuagar: Retire el anticuerpo y enjuague las muestras suavemente con 1 ml de PBS 3 veces durante 8 minutos cada una.</li>
	<li>Incubación con anticuerpo secundario<ol>
<li>Diluya el IgG anti-ratón de cabra con etiqueta Alexa Fluor 488 a una proporción de 1:500 usando un 5% de suero de cabra en PBS.</li>
		<li>Aplicar 500 μL de anticuerpo diluido en diferentes muestras e incubar en la oscuridad durante 2 h en RT. NOTA: Después de aplicar anticuerpo secundario fluorescente, realice todos los pasos posteriores en la oscuridad para evitar que se calme la fluorescencia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjuague: Retire el anticuerpo secundario y enjuague las muestras suavemente con 1 ml de PBS 3 veces durante 8 minutos cada una.</li>
	<li>Tinción y montaje nuclear<ol>
<li>Coloque una gota del medio de montaje DAPI en el microsluro limpio.</li>
		<li>Retire cuidadosamente las muestras de las placas y coloque la muestra encima del medio de montaje DAPI con la celda boca abajo. Dejar en la oscuridad durante 5 minutos en RT.</li>
		<li>Retire el exceso de medio de montaje DAPI con papel absorbente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Observación de microscopía de fluorescencia<ol>
<li>Coloque las muestras bajo la microscopía de fluorescencia y detecte la señal de DAPI y Alexa Fluor 488 utilizando filtros adecuados.</li>
		<li>Elija de manera uniforme y aleatoria 10-15 campos visuales diferentes para cada muestra y grabe las imágenes con una cámara CCD.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Diferenciación de los PNJ a las neuronas (Fase II)
<ol><li>Preparar derivados mESC en la diferenciación de fase I utilizando el protocolo 3 (8 días, Cuadro 1)como se detalla en el paso 2.4, que tiene la mayor eficiencia de diferenciación (véase la Figura 3). NOTA: Después de la diferenciación de la fase I, el control de calidad debe llevarse a cabo utilizando la observación de morfología celular y el ensayo de inmunofluorescencia mencionado anteriormente, para garantizar un PNJ sano y de alto rendimiento.</li>
	<li>Semillas de aproximadamente 5 x 105 derivados mESC dentro de 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%. Divida aleatoriamente los derivados del mESC en 3 grupos, como el protocolo de fase II 1, el protocolo 2 y el protocolo 3, respectivamente.</li>
	<li>Coloque la placa en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C para permitir la fijación durante 6 h. Lávalo dos veces con 2 ml de PBS.</li>
	<li>Añadir 2 ml de medio de diferenciación basal I, N2B27 medio I y N2B27 medio II(Tabla 2),respectivamente, a cada pozo de los grupos anteriores.</li>
	<li>Coloque las placas en la incubadora y deje diferenciar durante otros 10 días. Cambie el medio correspondiente cada 2 días.</li>
	<li>Compruebe el estado de diferenciación y registre los cambios morfológicos mencionados en el paso 3.</li>
	<li>El día 18, evaluar la generación de neuronas (β-Tubulin III positivo) y determinar la eficiencia de diferenciación de los 3 protocolos que se utilizan en el paso 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vieira, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+differentiation+into+mature+neurons:+mechanisms+of+regulation+and+biotechnological+applications.">Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).</li><li>Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+embryonic+stem+cells+on+Parkinson's+disease+therapy.">Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy.</a> Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).</li><li>Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+an+in+vitro+tool+for+the+study+of+the+expression+patterns+of+the+neuronal+cytoskeleton+during+neurogenesis.">Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).</li><li>Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+modified+by+the+Neural+Growth+Factor+(NGF)+gene.">Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene.</a> Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).</li><li>Yoshimatsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+efficacy+of+small+molecules+for+neural+differentiation+of+common+marmoset+ESCs+and+iPSCs.">Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs.</a> Neuroscience research. , (2019).</li><li>Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+matrix+microenvironment+for+targeted+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+and+glial+lineages.">3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages.</a> Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).</li><li>Gazina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+derivation+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+generating+synchronous+neuronal+networks.">Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).</li><li>Ohnuki, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hanging+drop+culture+conditions+on+embryoid+body+formation+and+neuronal+cell+differentiation+using+mouse+embryonic+stem+cells:+Optimization+of+culture+conditions+for+the+formation+of+well-controlled+embryoid+bodies.">Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).</li><li>Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+in+serum-free+monolayer+culture.">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture.</a> Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+neuronal+differentiation+of+embryonic+stem+cells+in+vitro.">An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+optimal+suspension+culture+time+for+the+osteoblastic+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+the+embryoid+body+method.">Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).</li><li>Lu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans+retinoic+acid+promotes+neural+lineage+entry+by+pluripotent+embryonic+stem+cells+via+multiple+pathways.">All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways.</a> BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).</li><li>Kanungo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+in+P19+stem+cell+differentiation.">Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation.</a> Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).</li><li>Rochette-Egly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+and+mouse+embryonic+stem+cell+differentiation:+Cross+talk+between+genomic+and+non-genomic+effects+of+RA.">Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+maintains+self-renewal+of+murine+embryonic+stem+cells+via+a+feedback+mechanism.">Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism.</a> Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).</li><li>Wu, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-induced+upregulation+of+miR-219+promotes+the+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+cells.">Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells.</a> Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+germ+cell+differentiation+in+mouse+embryonic+stem+cells+through+a+Smad-dependent+pathway.">Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).</li><li>Nakayama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+neuronal+induction+of+the+P19+embryonic+carcinoma+cell+line.">A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line.</a> Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).</li><li>Bibel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+a+defined+neuronal+lineage.">Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage.</a> Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).</li><li>Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Differentiation+of+Retinoic+Acid-Induced+Human+Pluripotent+Embryonic+Carcinoma+Stem+Cell+Neurons.">Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons.</a> PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).</li><li>Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic-acid-concentration-dependent+acquisition+of+neural+cell+identity+during+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En el presente estudio, establecimos un método simple y eficaz para la diferenciación neuronal de los mESC, con materiales de bajo costo y fácil obtención. En este método, 2 días de formación de cuerpos embrionados seguidos de 6 días de inducción por AR pueden promover eficazmente la diferenciación de los MESC en LOSP (Fase I-protocolo 3). Para la diferenciación de fase II, N2B27 medio II (Fase II-protocolo 3) más eficazmente inducen la diferenciación de los NPC en las neuronas. Para garantizar el éxito, se debe prestar más atención a varios pasos críticos.
En primer lugar, el estado saludable de los cuerpos embrionarios es la clave para todo el proceso de diferenciación. La formación de cuerpos embrionarios tridimensionales se utiliza generalmente para dirigir la diferenciación de los ESC8. En este estudio, investigamos el tiempo adecuado de cultivo de suspensión de los cuerpos embrionarios. Como se muestra en la Figura 2,los cuerpos embrionarios redondos con núcleos brillantes se formaron después del cultivo de suspensión durante 2 días en esta condición. Sin embargo, cuando se cultivan durante 4 días, muchos cuerpos embrionarios se adhieren entre sí, y los núcleos se vuelven oscuros, lo que indica la apoptosis de las células en los núcleos. La diferenciación posterior confirmó además el peor efecto de la formación prolongada del cuerpo embrionario. En algunos estudios notificados, el cultivo de suspensión de cuerpos embrionarios podría durar hasta 10 días, utilizando medio con menor concentración de FBS o sin FBS11. El tiempo reducido para la formación de cuerpos embrionarios en el estudio puede deberse a una mayor concentración de FBS (15%) utilizado aquí, y se ha demostrado que 15% FBS puede promover mejor la formación y diferenciación de cuerpos embrionarios.
En segundo lugar, el punto de tiempo en el que se aplica la AR y la concentración de trabajo ra son críticos para la determinación del destino celular de los MESC. Ra, un derivado de la vitamina A, es uno de los morfógenos más importantes con acciones pleiotrópicas12. La AR puede regular múltiples vías de señal y afectar la determinación del destino celular de los ESC13,14. Los informes mostraron que el tratamiento a corto plazo de los mESC con AR durante la etapa de diferenciación temprana impedía la diferenciación espontánea y mantuvo la capacidad de autorretración de los MESC15. Otros sugirieron que la AR podría regular tanto la diferenciación de células germinales como la diferenciación neuronal de los ESC, que dependen del punto de tiempo16,17,18. En la condición presentada aquí, la AR añadió elsegundo día después de que la formación del cuerpo embrionario sea apropiada para dirigir la diferenciación en PNJ. Mientras tanto, la concentración de trabajo de la AR también es crítica. Las bajas concentraciones de AR (~10 nM) pueden inducir la diferenciación de los mESC en células similares al endodermo, mientras que las altas concentraciones de AR (1-5 μM) son más propensas a inducir la diferenciación en los PNJ13,14,15,16,17,18,19. Debido al uso de la AR, uno esperaría un efecto de caudalización; la diferenciación en las neuronas cerebrales de los antebrazo rara vez se vería y producir neuronas de hindbrain y los destinos de la médula espinal ocurriría20,21. Además, la AR es un agente de fácil acceso y bajo costo, y el uso de este protocolo puede ahorrar fondos de investigación para la mayoría de los laboratorios.
En tercer lugar, en las condiciones aquí presentadas, los PNJ generados después de la diferenciación de fase I pueden almacenarse y pasarse en condiciones adecuadas. La criopreservación con alta densidad celular (>2 x 106)utilizando Stem-Cellbanker puede reducir eficazmente el daño celular causado por la congelación para obtener una alta tasa de recuperación. Mientras tanto, los PNJ generados en el estudio se pueden pasar utilizando el medio N2B27 (49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Medio neurobasal + 2% B27) con una densidad celular superior a 5 x 105/cm2. Bajo baja densidad celular (menos de 0,5 x 105/cm2),los PNJ tienden a diferenciarse. Tal criopreservación celular y recuperación puede traer gran comodidad a la investigación.
Además, el medio neurobasal es esencial para la diferenciación de fase II. El medio neurobasal está diseñado específicamente para el mantenimiento a largo plazo y la maduración de células neuronales. Como se indica en N2B27 medio II(Tabla 2),la adición del medio Neurobasal podría apoyar mejor la diferenciación de los NPC en las neuronas.
Colectivamente, informamos de un método eficiente y de bajo costo para la diferenciación neuronal de los MESC in vitro, utilizando las estrategias de cribado combinatorio. El método establecido es muy fácil de implementar y es adecuado para su uso por la mayoría de los laboratorios. Este método optimizado puede ser una poderosa herramienta para la neurobiología y la investigación en biología del desarrollo.

Las células madre embrionarias (ESC) son pluripotentes y pueden diferenciarse en células precursoras neuronales (NPC) y posteriormente en neuronas bajo ciertas condiciones1. La neurogénesis basada en ESC proporciona la mejor plataforma para imitar la neurogénesis, sirviendo así como una herramienta útil para estudios de biología del desarrollo y potencialmente ayuda en medicina regenerativa2,3. En las últimas décadas, muchas estrategias se han divulgado para inducir neurogénesis embrionaria, como el método transgénico4,utilizando moléculas pequeñas5,utilizando una matriz 3D microambiente6,y la técnica de co-cultivo7. Sin embargo, la mayoría de estos protocolos son condicionantes o difíciles de operar, por lo que no son adecuados para su uso en la mayoría de los laboratorios.
Para encontrar un método fácil de operar y de bajo costo para lograr una diferenciación neuronal eficiente de los mESC, aquí se utilizó una estrategia de cribado combinatoria. Como se describe en la Figura 1,todo el proceso de neurogénesis embrionaria se dividió en 2 fases. La Fase I se refiere al proceso de diferenciación de los MESC a los PNJ, y la fase II se relaciona con la diferenciación posterior de los PNJ en las neuronas. Sobre la base de los principios de fácil operación, bajo costo, materiales fácilmente disponibles y alta eficiencia de diferenciación, se eligieron siete protocolos en la Fase I y tres protocolos en la Fase II basados en el sistema tradicional de cultivo monocapa adherente o sistema de formación de cuerpos embrionados8,9. La eficiencia de diferenciación de los protocolos en ambas fases se evaluó utilizando la observación de morfología celular y el ensayo de inmunofluorescencia. Mediante la combinación del protocolo más eficiente de cada fase, establecimos el método optimizado para la diferenciación neuronal de los mESC.

<table><tbody><tr><td>Anti-Nestin antibody [Rat-401]</td><td>Abcam</td><td>Ab11306</td><td>stored at -80 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Anti-&amp;beta;-Tubulin III antibody produced in rabbit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td><td>stored at -80 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serum free</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, and protect from light</td></tr><tr><td>CHIR-99021 (CT99021)</td><td>Selleck</td><td>S1263</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Fluorescence microscopy</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Gibco</td><td>CM0635B</td><td>stored at room temperature</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor human</td><td>Sigma</td><td>L5283</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td>stored at 4 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids solution</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson</td><td>005-000-121</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Nonadhesive bacterial dish</td><td>Corning</td><td>3262</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Penicillin/ Streptomycin Solution</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PD0325901(Mirdametinib)</td><td>Selleck</td><td>S1036</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>stored at -80 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells</td><td>Cyagen</td><td>MUAES-01001</td><td>Maintained in feeder-free culture system</td></tr><tr><td>Stem-Cellbanker (DMSO free)</td><td>ZENOAQ</td><td>stem cellbanker DMSO free</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25% (1X) Solution</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>stored at 4 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>6 - well plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>60 mm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>NUNC</td><td>339650</td><td></td></tr></tbody></table>

neuronal differentiation from mouse embryonic stem cells in vitro

La diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón (MESC) es una herramienta potencial para dilucidar los mecanismos clave implicados en la neurogénesis y potencialmente ayudar en la medicina regenerativa. Aquí, establecimos un método eficiente y de bajo costo para la diferenciación neuronal de los MESC invitro, utilizando la estrategia de cribado combinatorio. En las condiciones definidas aquí, la formación de cuerpos embrionados de 2 días + protocolo de inducción de ácido retinoico de 6 días permite una diferenciación rápida y eficiente de los mESC en células precursoras neuronales (NPC), como lo ve la formación de A2lox bien apilado y similar a un neurite y 129 derivados que son nestin positivos. El estado saludable de los cuerpos embrionarios y el punto de tiempo en el que se aplica el ácido retinoico (AR), así como las concentraciones de AR, son críticos en el proceso. En la diferenciación posterior de los PNJ en las neuronas, N2B27 medio II (complementado por medio neurobasal) podría apoyar mejor el mantenimiento a largo plazo y la maduración de las células neuronales. El método presentado es altamente eficiente, de bajo costo y fácil de operar, y puede ser una poderosa herramienta para la neurobiología y la investigación en biología del desarrollo.

La formación de cuerpos embrionados de 2 días + la inducción por AR de 6 días funciona mejor en la dirección de la diferenciación de los MESC en PNJ (Fase I). Para determinar el protocolo óptimo que mejor promueve la diferenciación de los MESC en PNJ (Fase I), se probaron 7 protocolos tanto en A2lox como en 129 mESCs(Cuadro 1)y se monitorizó el estado de diferenciación de cada grupo utilizando microscopio ligero. Como se muestra en la Figura 3A, la mayoría de los derivados A2lox y 129 bajo el tratamiento de "formación de cuerpos embrionados de 2 días + inducción de RA de 6 días" (Fase I-protocolo 3) mostraron morfologías bien apiladas y similares a neuritas, lo que indica la formación de NPCs. Sin embargo, las células con tratamiento de "formación de cuerpos embrionarios de 4 días + inducción por AR de 4 días" (Phase I-protocol 2) mostraron un estado pobre y apoptótico, que puede deberse a la falta de nutrientes dentro de los cuerpos embrionarios. El cultivo monocapa combinado con la inducción por AR (Fase I-protocolo 4 y 5) también podría dirigir la diferenciación de los MESC, mientras que la proporción de células similares a la neurita no era tanto como la del protocolo fase I 3. Mientras tanto, la mayoría de los derivados de A2lox y 129 en los protocolos de fase I 6 y 7 mostraron cuerpos celulares más pequeños y tendieron a someterse a apoptosis, lo que sugiere que N2B27 medio II no podía soportar la neurogénesis embrionaria de manera efectiva.
Para confirmar aún más la formación de PNJ, se detectó el porcentaje de células Nestin+ (marcador para PNJ) en cada grupo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. En la Figura 3B,el porcentaje de células Nestin+ en la Fase I-protocolo 3 fue el más alto y alcanzó hasta 77,67 ± 4,33% y 69,33 ± 2,33% en A2lox y 129 derivados, respectivamente. En conjunto, el protocolo 3 de fase I funciona mejor para dirigir la diferenciación de los MESC en los PNJ.
N2B27 medio II puede inducir más eficazmente la diferenciación de los PNJ en las neuronas (Fase II). Se examinaron tres protocolos de diferenciación de fase II. Como se muestra en la Figura 4A,la observación morfológica mostró que la mayoría de los derivados A2lox y 129 en la fase II-protocolo 3 (diferenciación con N2B27 medio II) aparecieron las estructuras más prolongadas similares a las neuronas con neurites claros y extensiones del cuerpo celular para el día 18, lo que indica la aparición eficiente de neurogénesis. Los ensayos de inmunofluorescencia confirmaron además la generación de neuronas, con un porcentaje de células β-Tubulina III+ de hasta 67,75 ± 4,01% y 58,73 ± 7,25%, respectivamente, en A2lox y 129 derivados en D18(Figura 4B).
Para hacerlo más claro, se muestra un diagrama esquemático del método optimizado para la neurogénesis embrionaria en la Figura 5. Brevemente, 1,5 x 106 mESC se siembran en un plato bacteriano nodhesivo en 10 ml de medio de diferenciación basal I y permiten la formación de cuerpos embrionados durante 2 días. A continuación, los cuerpos embrionarios se recogen y plantan en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina del 0,1% con la concentración de 50 cuerpos embrionarios por pozo. Mientras tanto, la AR (1 μM) se añade durante otros 6 días. Desde el día 8 hasta el día 18, se elimina la AR y se aplica N2B27 medio II para dirigir la diferenciación posterior de los PNJ a las neuronas. Con un método tan combinado, se pueden formar neuronas robustas el día 18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama del proceso de neurogénesis embrionaria. Esta cifra ha sido modificada desde Li et al.10. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61190/61190fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig02.jpg"> Figura 2: La morfología de los cuerpos embrionarios. (A) Cuerpos embrionarios cultivados durante 4 días. B) Cuerpos embrionarios cultivados durante 2 días. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61190/61190fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig03.jpg"> Figura 3: Comparación de eficiencia de los 7 protocolos de diferenciación de fase I utilizando A2lox y 129 mESCs. (A) Análisis morfológico de derivados de A2lox y 129 mESCs el día 8. Panel superior: Derivados de A2lox; Panel inferior: 129 derivados. (B) Detección de inmunofluorescencia para la formación de PNJ (Nestin+, verde). Los núcleos estaban etiquetados de azul con DAPI. Panel superior: Derivados A2lox en D8; Panel inferior: 129 derivados en D8. Los porcentajes de células Nestin+ de cada grupo se mostraron mediante histograma. Cada columna representa la media±SEM de tres experimentos independientes. *, p≤0.05; **, p≤0.01. Esta cifra ha sido modificada desde Li et al.10. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61190/61190fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig04.jpg"> Figura 4: Comparación de eficiencia de los 3 protocolos sobre diferenciación de fase II. (A) Análisis morfológico de derivados de A2lox y 129 mESC el día 18. Panel superior: Derivados de A2lox; Panel inferior: 129 derivados. (B) Detección de inmunofluorescencia para la formación de neuronas (β-Tubulina III+, rojo). Los núcleos estaban etiquetados de azul con DAPI. Panel superior: Derivados A2lox en D18; Panel inferior: 129 derivados en D18. Porcentajes de células β-Tubulina III+ de cada grupo se mostraron mediante histograma. Cada columna representa la media ± SEM de tres experimentos independientes. *, p≤0.05; **, p≤0.01. Esta cifra ha sido modificada desde Li et al.10. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61190/61190fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig05.jpg"> Figura 5: Breve modelo del método optimizado para la diferenciación neuronal de los MESC in vitro Esta cifra se ha modificado desde liet al.10. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61190/61190fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Diferenciación Fase I (8d)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Protocolos</td>
			<td>Medio</td>
		</tr>
<tr>
<td>protocolo 1</td>
			<td>Diferenciación natural: Con medio de diferenciación basal sólo</td>
			<td rowspan="5">Medio de diferenciación basal I: DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0,1mM 2ME+ 1%P/S</td>
		</tr>
<tr>
<td>protocolo 2</td>
			<td>Formación de cuerpos embrionarios de 4 días + inducción de RA de 4 días</td>
		</tr>
<tr>
<td>protocolo 3</td>
			<td>Formación de cuerpos embrionarios de 2 días + inducción de RA de 6 días</td>
		</tr>
<tr>
<td>protocolo 4</td>
			<td>Cultivo monocapa combinado con inducción ra: 4d (-RA) 4d (+RA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>protocolo 5</td>
			<td>Cultivo monocapa combinado con inducción ra: 2d (-RA) 6d(+RA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>protocolo 6</td>
			<td>Formación de cuerpos embrionarios (4 d) y diferenciación inducida con N2B27 medio II</td>
			<td rowspan="2">N2B27 medio II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Medio neurobasal + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0,1mM 2ME</td>
		</tr>
<tr>
<td>protocolo 7</td>
			<td>Cultivo monocapa con N2B27 medio II</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Detalles de los 7 protocolos utilizados en la diferenciación de fase I. Esta tabla ha sido modificada desde Li et al.10.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Diferenciación Fase II (10d)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Protocolos</td>
			<td>Medio</td>
		</tr>
<tr>
<td>protocolo 1</td>
			<td>Diferenciación natural: Con medio de diferenciación basal sólo</td>
			<td>Medio de diferenciación basal I: DMEM/F12 +15%FBS +1%NEAA +0,1mM 2ME+ 1%P/S</td>
		</tr>
<tr>
<td>protocolo 2</td>
			<td>Diferenciación con N2B27 medio I</td>
			<td>N2B27 medio I: DMEM/F12 + 1%N2 + 2%B27 + 1%GlutaMAX +0,1mM 2ME</td>
		</tr>
<tr>
<td>protocolo 3</td>
			<td>Diferenciación con N2B27 medio II</td>
			<td>N2B27 medio II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Medio neurobasal + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0,1mM 2ME</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Detalles de los 3 protocolos utilizados en la diferenciación de fase II. Esta tabla ha sido modificada desde Li et al.10.

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Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Aquí, establecimos un método de bajo costo y fácil de operar que dirige la diferenciación rápida y eficiente de las células madre embrionarias a las neuronas. Este método es adecuado para la popularización entre laboratorios y puede ser una herramienta útil para la investigación neurológica.

Diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

neuronal-differentiation-from-mouse-embryonic-stem-cells-in-vitro

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K vistas.  Wuhan Center for Disease Control and Prevention. Aquí, establecimos un método de bajo costo y fácil de operar que dirige la diferenciación rápida y eficiente de las células madre embrionarias a las neuronas. Este método es adecuado para la popularización entre laboratorios y puede ser una herramienta útil para la investigación neurológica.

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Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en el suero libre de monocapa Cultura

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Diferenciación neuronal eficiente utilizando el cultivo monocelular de células madre embrionarias humanas

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Diferenciación y caracterización de progenitores neurales y neuronas a partir de células madre embrionarias de ratón

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Evaluación Funcional de neurotoxinas Biológica en Culturas en Red de Células Madre deriva-Sistema Nervioso Central Neuronas

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Neurociencias

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Diferenciación de células madre embrionarias de ratón en precursores corticales interneurona

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

La diferenciación eficiente de las células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Biología

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Aislamiento y cultivo de las células madre neurales embrionarias de ratón

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

Una técnica para generar células progenitoras neurales a partir de células madre embrionarias de ratón

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neurons

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video showcased a cell culture method for differentiating neural progenitor cells into neurons. By incubating cells in a nutrient-rich medium supplemented with growth factors, the progenitor cells matured into neurons with developed axons and dendrites. A stabilizing agent ensured cell viability and protected against oxidative damage throughout the differentiation process.