Name: neuronal differentiation from mouse embryonic stem cells in vitro
Uploaded: 2020-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro at JoVE.com

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 31501099) ve Hubei Eyaleti Eğitim Departmanı Orta Yaşlı ve Genç (No. Q20191104). Wuhan Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'nden Profesör Wensheng Deng'e fare embriyonik kök hücre çizgileri A2lox'u sağladığı için teşekkür ederiz.

1. Fare embriyonik kök hücre kültürü
<ol><li>% 0.1 jelatin kaplı hücre kültürü yemekleri veya tabakları hazırlayın.<ol>
<li>60 mm hücre kültürü yemeklerine 2 mL sterilize edilmiş %0,1 jelatin (suda %0,1 w/v) ekleyin. Hücre kültürü yemeklerinin eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için hafifçe sallayın.</li>
		<li>Bulaşıkları 37 °C'de % 5 CO2 inkübatöre koyun ve 1 saat boyunca kaplamaya izin verin.</li>
		<li>Hücreleri tohumlamadan önce% 0.1 jelatin çözeltisini çıkarın. NOT: Jelatin çıkarıldıktan sonra, kaplanmış bulaşıkları kurutmaya veya yıkamaya gerek yoktur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare embriyonik kök hücreleri (A2lox ve 129) kültürü<ol>
<li>%0,1 jelatin kaplı 60 mm hücre kültürü yemeklerindeki mESC hücrelerini sırasıyla %5 CO2 inkübatöründe 37 °C'de 37 °C'de kuluçkaya yatırın. mESC büyüme ortamı% 85 nakavt DMEM / F12, 15% Nakavt serum replasmanı (KSR), 0.1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, %1 esansiyel olmayan amino asit (NEAA), %1 penisilin/streptomisiyan (P/S), 1000 U/mL lösemi inhibitör faktörü (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3 inhibitörü) ve 0,33 nM PD0325901 (MEK inhibitörü). DİkKAT: β-mercaptoethanol yanıcıdır ve soluma toksisitesi vardır. Yangın kaynaklarından uzak durun ve kullanırken teneffüsten kaçınmak için maske takın.</li>
		<li>A2lox ve 129'un daha iyi büyümesi için mESC büyüme ortamını günlük olarak değiştirin.</li>
		<li>Hücreler% 80 izdihama ulaştığında, ortamı çıkarın ve yemeğe% 0.1 tripsin 1 mL ekleyin. Tüm hücrelerde tripin kapağını bile sağlamak için 30 sn hafifçe sallayın.</li>
		<li>Trypsinize için hücreleri yaklaşık 1 dakika bekletin ve ardından 1 mL pipet kullanarak tripsin çıkarın.</li>
		<li>Yemeğe 2 mL mL mESC büyüme ortamı ekleyin, tek bir hücre süspansiyonu yapmak için birkaç kez pipet yukarı ve aşağı.</li>
		<li>Hemositometre kullanarak süspansiyondaki hücrelerin yoğunluğunu mümkün olduğunca doğru bir şekilde sayın.</li>
		<li>Hücreleri 7 gruba ayırın ve Tablo 1'degösterilen farklı protokolleri kullanarak farklılaşmaya neden olan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. MESC'lerden NPC'lere farklılaşma (Aşama I)
<ol><li>% 0.1 jelatin kaplı hücre kültürü plakaları veya kapak örtüleri hazırlayın.<ol>
<li>Kullanmadan önce, adım 1.1'deki gibi% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları veya kapaklar hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Protokol 1 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)<ol>
<li>%0,1 jelatin kaplı 6 kuyulu plakalarda kuyu başına 2 mL bazal farklılaşma ortamında yaklaşık 2 x 104 mESC tohum. Mikroskop altında hücre yoğunluğunu kontrol edin.</li>
		<li>Hücreleri 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörde 6 saat boyunca inkübatöre sokun.</li>
		<li>Bağlanmadan sonra, inkübatörden hücreleri çıkar ve hücreleri 2 mL PBS ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>Her kuyuya 2 mL bazal farklılaşma ortamı I (Tablo 1) ekleyin ve hücreleri tekrar inkübatöre koyun.</li>
		<li>Hücreleri 8 gün boyunca farklılaşma için bırakın. Bazal farklılaşma ortamı I'yi her 2 günde bir değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Protokol 2 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)<ol>
<li>%5 CO2 inkübatörde 37 °C'de embriyoid vücut oluşumuna izin vermek için 10 mL bazal farklılaşma ortamı I'de yapışkan olmayan bir bakteri kabına 1,5 x 106 mESC ekleyin.</li>
		<li>2 gün sonra, hücre agregalarını 15 mL santrifüj tüplerine aktarın ve yerçekimi ile yerleşmelerini bırakın.</li>
		<li>Süpernatant çıkarın ve embriyoid vücutları yeniden depolamak için 10 mL taze bazal farklılaşma ortamı I ekleyin. Onları yeni bir nonadhesive bakteri kabına yeniden dikin ve 2 gün daha farklılaşmaya izin verin.</li>
		<li>Mikroskop altında embriyoid cisimlerinin oluşumunu kontrol edin (Şekil 2A).</li>
		<li>Embriyoid cisimleri 2.3.2-2.3.3 adımlarında açıklandığı gibi toplayın. %0,1 jelatin kaplı 6 kuyu plakası üzerine kuyu başına 2 mL bazal farklılaşma ortamında yaklaşık 50 embriyoid cisim tohum.</li>
		<li>1 mM all-trans RA stoğu hazırlayın (DMSO'da) ve alt ambalajdan sonra -80 °C dondurucuda ışıktan uzak saklayın. NOT: RA kararsızdır ve RA stoğunun hazırlanması sırasında ışıktan uzak tutmaya ve hava temasını azaltmaya dikkat edilmelidir.</li>
		<li>RA indüksiyonu için, 1 μM'lik son bir konsantrasyon yapmak için her kuyuya 2 μL RA stoğu ekleyin.</li>
		<li>Plakayı 37 °C'de % 5 CO2 inkübatöre yerleştirin ve 4 gün daha ayırt edin.</li>
		<li>2 mL bazal farklılaşma ortamı I'nin tamamını (1 μM RA ile) her 2 günde bir değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Protokol 3 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)<ol>
<li>Bitki 1.5 x10 6 mESC'yi 10 mL bazal farklılaşma ortamında yapışkan olmayan bir bakteri kabına yerleştirin I. %5 CO 2 inkübatörde 37 °C'de embriyoid vücut oluşumu için2 gün bekletin.</li>
		<li>Mikroskop altında embriyoid cisimlerinin oluşumunu kontrol edin (Şekil 2B).</li>
		<li>Hücre agregalarını 15 mL santrifüj tüplerine aktarın ve yerçekimi ile yerleşmelerine izin verin.</li>
		<li>Süpernatant'ı dikkatlice çıkarın ve yeniden depolamak için 10 mL taze bazal farklılaşma ortamı I ekleyin.</li>
		<li>Yaklaşık 50 embriyoid cisimini% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakalarına kuyu başına 2 mL bazal farklılaşma ortamına tohumlayın.</li>
		<li>RA indüksiyonu için, 1 μM'lik son bir konsantrasyon yapmak için her kuyuya 2 μL RA stoğu ekleyin.</li>
		<li>Plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin ve 6 gün daha ayırt edin. Tüm bazal farklılaşma ortamı I'yi (1 μM RA ile) her 2 günde bir değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Protokol 4 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)<ol>
<li>Tohum yaklaşık 2 x10 4 mESC içinde 2 mL bazal farklılaşma ortamı I kuyu başına% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine. Plakayı 6 saat boyunca bağlanmaya izin vermek için 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörüne yerleştirin.</li>
		<li>Bağlanmadan sonra, hücreleri 2 mL PBS ile iki kez yıkayın. Her kuyuya 2 mL bazal farklılaşma ortamı I ekleyin ve 37 °C'deki %5 CO 2 inkübatörde4 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.</li>
		<li>RA indüksiyonu için, 4 gün daha farklılaşmayı teşvik etmek için her kuyuya 2 μL all-trans RA stoğu ekleyin (çalışma konsantrasyonu 1 μM'dir).</li>
		<li>Tüm süreçte, tüm ortamı her 2 günde bir değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Protokol 5 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)<ol>
<li>Tohum yaklaşık 2 x10 4 mESC içinde 2 mL bazal farklılaşma ortamı I kuyu başına% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine. Plakayı 6 saat boyunca bağlanmaya izin vermek için 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörüne yerleştirin.</li>
		<li>Hücreleri 2 mL PBS ile iki kez yıkayın. Her kuyuya 2 mL bazal farklılaşma ortamı I ekleyin ve 37 °C'deki %5 CO 2 inkübatörde2 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.</li>
		<li>Sonraki RA indüksiyonu için, 1 μM'lik son bir konsantrasyon yapmak için her kuyuya2 μL RA stoğu ekleyin.</li>
		<li>Tüm süreçte, tüm ortamı her 2 günde bir değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Protokol 6 (Tablo 1) kullanılarak Aşama I farklılaşması<ol>
<li>Embriyoid cisimlerin oluşumuna izin vermek için10 mL N2B27 orta II 'de (Tablo 1) yapışkan olmayan bir bakteri kabına1,5 x 10 6mESC yerleştirin.</li>
		<li>2. günde, 2.3.2-2.3.3 adımlarında açıklandığı gibi hücre agregalarını toplayın ve 10 mL taze N2B27 orta II kullanarak embriyoid gövdeleri yeniden uygulayın.</li>
		<li>Onları yeni bir nonadhesive bakteri kabına yeniden dikin ve 37 °C'deki% 5 CO 2 inkübatörde2 gün daha farklılaşmaya izin verin. Mikroskop altında embriyoid cisimlerinin oluşumunu kontrol edin.</li>
		<li>4. günde embriyoid vücutları toplayın. 2 mL N2B27 orta II ile% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine kuyu başına yaklaşık 50 embriyoid gövdesi tohumlayın.</li>
		<li>Her kuyuya 2 μL all-trans RA stoğu ekleyin ve 4 gün daha farklılaşmaya neden olan. Her iki günde bir tüm ortamı (N2B27 orta II, 1 μM RA ile) değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Protokol 7 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)<ol>
<li>Tohum yaklaşık 2 x10 4 mESC içinde 2 mL bazal farklılaşma ortamı I kuyu başına% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine. Plakayı 6 saat boyunca bağlanmaya izin vermek için 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörüne yerleştirin.</li>
		<li>Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, her kuyuya 2 mL N2B27 orta II ekleyin ve% 5 CO 2 inkübatörde 37 ° C'de8 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.</li>
		<li>N2B27 orta II'nin tamamını her 2 günde bir değiştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Hücre morfolojisi gözlemi
<ol><li>Ters faz kontrastı ışık mikroskobu altında yukarıda belirtilen 7 grubun günlük farklılaşma durumunu kontrol edin.</li>
	<li>En az 12 alanı rastgele seçin ve her grubun morfolojik değişikliklerini D8'e kaydetmek için fotoğraf çekin.</li>
</ol>4. İmmünofluoresans boyama
<ol><li>Örnek hazırlama: %0,1 jelatin kaplı kapaklarda tohum mESC'leri ve adım 2'de belirtilen protokolleri kullanarak 8 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.</li>
	<li>Durulama:8. günde, örnekleri inkübatörden çıkarın ve ayırma ortamını aspirasyonla çıkarın. Hücreleri 1 mL PBS ile bir kez 5 dakika boyunca hafifçe durulayın.</li>
	<li>Fiksasyon: Her numuneye 1 mL%4 paraformaldehit ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında (RT) 20 dakika sabitleyin.</li>
	<li>Durulama: Sabitlemeden sonra, hücreleri her biri 5 dakika boyunca 3 kez 1 mL PBS ile hafifçe durulayın.</li>
	<li>Permeabilizasyon: Pbs'de %0,2 TritonX-100'ün 1 mL'sini her örneğe ekleyin ve RT'de 8 dakika bekletin.</li>
	<li>Durulama: Permeabilizasyondan sonra, hücreleri her biri 5 dakika boyunca 3 kez 1 mL PBS ile hafifçe durulayın.</li>
	<li>Engelleme: Her örneğe PBS'de %10 keçi serumunun 1 mL'sini ekleyin ve spesifik olmayan etkileşimleri engellemek için RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Primer antikor ile inkübasyon<ol>
<li>PBS'de %5 keçi serumu kullanarak anti-Nestin antikoru 1:100 oranında seyreltin.</li>
		<li>Farklı örneklere 500 μL seyreltilmiş antikor uygulayın ve 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durulama: Antikoru çıkarın ve örnekleri her biri 8 dakika boyunca 3 kez 1 mL PBS ile hafifçe durulayın.</li>
	<li>sekonder antikor ile inkübasyon<ol>
<li>PBS'de %5 keçi serumu kullanarak Alexa Fluor 488 etiketli keçi fare önleyici IgG'yi 1:500 oranında seyreltin.</li>
		<li>Farklı örneklere 500 μL seyreltilmiş antikor uygulayın ve RT'de 2 saat boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın. NOT: Floresan sekonder antikor uyguladıktan sonra, floresan söndürmeyi önlemek için karanlıkta sonraki tüm adımları uygulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durulama: İkincil antikoru çıkarın ve örnekleri her biri 8 dakika boyunca 3 kez 1 mL PBS ile hafifçe durulayın.</li>
	<li>Nükleer boyama ve montaj<ol>
<li>Temiz mikroslide üzerine bir damla DAPI montaj ortamı yerleştirin.</li>
		<li>Plakalardan numuneleri dikkatlice alın ve numuneyi hücre yüzü aşağı bakacak şekilde DAPI montaj ortamının üzerine yerleştirin. RT'de 5 dakika karanlıkta bırakın.</li>
		<li>Fazla DAPI montaj ortamını emici kağıtla çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Floresan mikroskopi gözlemi<ol>
<li>Numuneleri floresan mikroskopinin altına yerleştirin ve uygun filtreler kullanarak DAPI ve Alexa Fluor 488 sinyalini algılayın.</li>
		<li>Her örnek için eşit ve rastgele 10-15 farklı görsel alan seçin ve görüntüleri bir CCD kamera ile kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. NPC'lerden nöronlara farklılaşma (Faz II)
<ol><li>MESC türevlerini, en yüksek farklılaşma verimliliğine sahip adım 2.4'te ayrıntılı olarak belirtildiği gibi protokol 3 (8 gün, Tablo 1)kullanarak Faz I farklılaşması altında hazırlayın (Bkz. Şekil 3). NOT: Faz I farklılaşmasından sonra, sağlıklı ve yüksek verimli bir NPC sağlamak için yukarıda belirtilen hücre morfolojisi gözlemi ve immünofluoresans tahlil kullanılarak kalite kontrolü yapılmalıdır.</li>
	<li>Tohum yaklaşık 5 x10 5 mESC türevleri 2 mL bazal farklılaşma ortamı I kuyu başına% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine. mESC türevlerini sırasıyla Aşama II protokol 1, protokol 2 ve protokol 3 olarak rastgele 3 gruba ayırın.</li>
	<li>Plakayı 6 saat boyunca bağlanmaya izin vermek için 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörüne yerleştirin. 2 mL PBS ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Yukarıdaki grupların her kuyusuna sırasıyla 2 mL bazal farklılaşma ortamı I, N2B27 orta I veN2B27orta II ( Tablo 2 ) ekleyin.</li>
	<li>Plakaları inkübatöre yerleştirin ve 10 gün daha ayırt etmeye bırakın. İlgili ortamı her 2 günde bir değiştirin.</li>
	<li>Farklılaşma durumunu denetleyin ve 3.</li>
	<li>18. günde, nöronların neslini değerlendirin (β-Tubulin III pozitif) ve 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vieira, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+differentiation+into+mature+neurons:+mechanisms+of+regulation+and+biotechnological+applications.">Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).</li><li>Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+embryonic+stem+cells+on+Parkinson's+disease+therapy.">Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy.</a> Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).</li><li>Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+an+in+vitro+tool+for+the+study+of+the+expression+patterns+of+the+neuronal+cytoskeleton+during+neurogenesis.">Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).</li><li>Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+modified+by+the+Neural+Growth+Factor+(NGF)+gene.">Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene.</a> Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).</li><li>Yoshimatsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+efficacy+of+small+molecules+for+neural+differentiation+of+common+marmoset+ESCs+and+iPSCs.">Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs.</a> Neuroscience research. , (2019).</li><li>Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+matrix+microenvironment+for+targeted+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+and+glial+lineages.">3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages.</a> Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).</li><li>Gazina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+derivation+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+generating+synchronous+neuronal+networks.">Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).</li><li>Ohnuki, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hanging+drop+culture+conditions+on+embryoid+body+formation+and+neuronal+cell+differentiation+using+mouse+embryonic+stem+cells:+Optimization+of+culture+conditions+for+the+formation+of+well-controlled+embryoid+bodies.">Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).</li><li>Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+in+serum-free+monolayer+culture.">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture.</a> Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+neuronal+differentiation+of+embryonic+stem+cells+in+vitro.">An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+optimal+suspension+culture+time+for+the+osteoblastic+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+the+embryoid+body+method.">Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).</li><li>Lu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans+retinoic+acid+promotes+neural+lineage+entry+by+pluripotent+embryonic+stem+cells+via+multiple+pathways.">All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways.</a> BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).</li><li>Kanungo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+in+P19+stem+cell+differentiation.">Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation.</a> Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).</li><li>Rochette-Egly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+and+mouse+embryonic+stem+cell+differentiation:+Cross+talk+between+genomic+and+non-genomic+effects+of+RA.">Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+maintains+self-renewal+of+murine+embryonic+stem+cells+via+a+feedback+mechanism.">Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism.</a> Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).</li><li>Wu, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-induced+upregulation+of+miR-219+promotes+the+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+cells.">Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells.</a> Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+germ+cell+differentiation+in+mouse+embryonic+stem+cells+through+a+Smad-dependent+pathway.">Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).</li><li>Nakayama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+neuronal+induction+of+the+P19+embryonic+carcinoma+cell+line.">A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line.</a> Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).</li><li>Bibel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+a+defined+neuronal+lineage.">Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage.</a> Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).</li><li>Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Differentiation+of+Retinoic+Acid-Induced+Human+Pluripotent+Embryonic+Carcinoma+Stem+Cell+Neurons.">Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons.</a> PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).</li><li>Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic-acid-concentration-dependent+acquisition+of+neural+cell+identity+during+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu çalışmada, düşük maliyetli ve kolayca elde edilen malzemelerle, mESC'lerden nöronal farklılaşma için basit ve etkili bir yöntem oluşturduk. Bu yöntemde, 2 günlük embriyoid vücut oluşumu ve ardından 6 günlük RA indüksiyonu, MESC'lerin NPC'lere farklılaştırılmasını etkili bir şekilde teşvik edebilir (Faz I-protokolü 3). Faz II farklılaşması için, N2B27 orta II (Faz II-protokol 3) NPC'lerden nöronlara farklılaşmayı en etkili şekilde teşvik eder. Başarıyı sağlamak için birkaç kritik adıma daha fazla dikkat edilmelidir.
İlk olarak, embriyoid vücutların sağlıklı durumu tüm farklılaşma sürecinin anahtarıdır. Üç boyutlu embriyoid vücut oluşumu genellikle ESC'lerin farklılaşmasına yön vermek için kullanılır8. Bu çalışmada embriyoid cisimlerin uygun süspansiyon kültürü zamanını araştırdık. Şekil 2'degösterildiği gibi, parlak çekirdekli yuvarlak embriyoid cisimler, bu durumda 2 gün boyunca süspansiyon kültüründen sonra oluşturulmuştur. Bununla birlikte, 4 gün boyunca kültürlendiğinde, birçok embriyoid cisim birbirine yapışır ve çekirdekler karanlık hale gelir ve bu da çekirdeklerdeki hücrelerin apoptozuna işaret eder. Daha sonraki farklılaşma, uzun süreli embriyoid vücut oluşumunun daha kötü etkisini daha da doğruladı. Bildirilen bazı çalışmalarda, embriyoid cisimlerin süspansiyon kültürü, daha düşük FBS konsantrasyonuna sahip veya FBS 11 olmadan orta kullanarak10gün kadar sürebilir. Çalışmada embriyoid vücut oluşumu için azaltılmış süre, daha yüksek FBS konsantrasyonuna (%15) bağlı olabilir. burada kullanılır ve% 15 FBS'nin embriyoid cisimlerin oluşumunu ve farklılaşmasını daha iyi teşvik edebileceği kanıtlanmıştır.
İkincisi, RA'nın uygulandığı zaman noktası ve RA çalışma konsantrasyonu MESC'lerin hücre kaderinin belirlenmesi için kritik öneme sahiptir. A vitamininin bir türevi olan RA, pleiotropik eylemlere sahip en önemli morfojenlerden biridir12. RA birden fazla sinyal yolunu düzenleyebilir ve ESC'lerin hücre kaderinin belirlenmesini etkileyebilir13,14. Raporlar, erken farklılaşma aşamasında MESC'lerin RA ile kısa süreli tedavisinin spontan farklılaşmayı önlediği ve mESC15'inkendini yenileme kapasitesini koruduğu göstermiştir. Diğerleri RA'nın hem mikrop hücre farklılaşması hem de zaman noktasına bağlı 16,17,18olanESC'lerdensinirselfarklılaşmayı düzenleyebileceğini öne sürdü. Burada sunulan durumda, EMBRIYOID vücut oluşumundan sonraki2 nd günde eklenen RA, farklılaşmayı NPC'lere yönlendirmek için uygundur. Bu arada, RA'nın çalışma konsantrasyonu da kritiktir. Düşük RA konsantrasyonları (~10 nM) mESC'lerin endoderm benzeri hücrelere farklılaşmasına neden olabilirken, yüksek RA konsantrasyonlarının (1-5 μM)NPC'lerefarklılaşmaya neden olma olasılığı daha yüksektir 13,14,15,16,17,18,19. RA kullanımı nedeniyle, bir kaudalizasyon etkisi beklenir; ön beyin nöronlarına farklılaşma nadiren görülür ve arka beyin ve omurilik kaderlerinin nöronları meydana gelir20,21. Ayrıca, RA kolayca kullanılabilen ve düşük maliyetli bir ajandır ve bu protokolün kullanımı çoğu laboratuvar için araştırma fonlarından tasarruf sağlayabilir.
Üçüncü olarak, burada sunulan durumda, faz I farklılaşmasından sonra oluşturulan NPC'ler uygun koşullarda saklanabilir ve geçiş yapılabilir. Kök HücreBanker kullanarak yüksek hücre yoğunluğuna sahip kriyoprezervasyon (>2 x10 6),yüksek iyileşme oranı elde etmek için donma nedeniyle oluşan hücre hasarını etkili bir şekilde azaltabilir. Bu arada, çalışmada üretilen NPC'ler, 5 x105 /cm 2'den fazla hücre yoğunluğuna sahip N2B27 ortamı (%49 DMEM/F12+ %1 N2 + %48 Nörobasal orta + %2B27)kullanılarak geçirilebilir. Düşük hücre yoğunluğu altında (0,5 x 105/cm2'denaz), NPC'ler farklılaşma eğilimindedir. Bu tür hücre kriyoprezervasyonu ve iyileşmesi araştırmaya büyük kolaylık getirebilir.
Ayrıca, Nörobakal ortam faz II farklılaşması için gereklidir. Nörobakal ortam özellikle nöronal hücrenin uzun süreli bakımı ve olgunlaşması için tasarlanmıştır. N2B27 medium II 'de(Tablo 2)listelendiği gibi, Nörobakal ortamın eklenmesi NPC'lerden nöronlara farklılaşmayı daha iyi destekleyebilir.
Toplu olarak, kombinatoryal tarama stratejilerini kullanarak mESC in vitro'dan nöronal farklılaşma için verimli ve düşük maliyetli bir yöntem bildirdik. Kurulan yöntemin uygulanması çok kolaydır ve çoğu laboratuvar tarafından kullanıma uygundur. Böyle optimize edilmiş bir yöntem nörobiyoloji ve gelişimsel biyoloji araştırmaları için güçlü bir araç olabilir.

Embriyonik kök hücreler (ESC' ler) pluripotenttir ve nöral öncül hücrelere (NPC' ler) ve daha sonra belirli koşullar altında nöronlara farklılaşabilir1. ESC tabanlı nörogenez, nörogenez taklit etmek için en iyi platformu sağlar, böylece gelişimsel biyoloji çalışmaları için yararlı bir araç olarak hizmet eder ve rejeneratif tıpta potansiyel olarak yardımcıolunur 2,3. Son on yıllarda, transgenik yöntem 4 , küçük moleküller5,3Dmatris mikroçevrimi 6 ve ortak kültür tekniği7gibi embriyoniknörogenez indüklenmesi için birçok strateji bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokollerin çoğu koşul sınırlı veya kullanımı zordur, bu nedenle çoğu laboratuvarda kullanım için uygun değildir.
MESC'lerden verimli nöral farklılaşma elde etmek için kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir yöntem bulmak için burada bir kombinatoryal tarama stratejisi kullanılmıştır. Şekil 1'deaçıklandığı gibi embriyonik nörogenezin tüm süreci 2 faza ayrılmıştır. Aşama I, MESC'lerden NPC'lere farklılaşma sürecini ifade eder ve faz II, NPC'lerden nöronlara sonraki farklılaşma ile ilgilidir. Kolay kullanım, düşük maliyetli, kolay kullanılabilen malzemeler ve yüksek farklılaşma verimliliği ilkelerine dayanarak, Geleneksel yapışık monolayer kültür sistemine veya embriyoid vücut oluşum sistemine göre Faz I'de yedi protokol ve Faz II'de üç protokol seçilmiştir8,9. Her iki fazda da protokollerin farklılaşma verimliliği hücre morfolojisi gözlemi ve immünofluoresans tahlilleri kullanılarak değerlendirildi. Her aşamanın en verimli protokolünü birleştirerek, mESC'lerden nöral farklılaşma için optimize edilmiş yöntemi oluşturduk.

<table><tbody><tr><td>Anti-Nestin antibody [Rat-401]</td><td>Abcam</td><td>Ab11306</td><td>stored at -80 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Anti-&amp;beta;-Tubulin III antibody produced in rabbit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td><td>stored at -80 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serum free</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, and protect from light</td></tr><tr><td>CHIR-99021 (CT99021)</td><td>Selleck</td><td>S1263</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Fluorescence microscopy</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Gibco</td><td>CM0635B</td><td>stored at room temperature</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor human</td><td>Sigma</td><td>L5283</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td>stored at 4 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids solution</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson</td><td>005-000-121</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Nonadhesive bacterial dish</td><td>Corning</td><td>3262</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Penicillin/ Streptomycin Solution</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PD0325901(Mirdametinib)</td><td>Selleck</td><td>S1036</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>stored at -80 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells</td><td>Cyagen</td><td>MUAES-01001</td><td>Maintained in feeder-free culture system</td></tr><tr><td>Stem-Cellbanker (DMSO free)</td><td>ZENOAQ</td><td>stem cellbanker DMSO free</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25% (1X) Solution</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>stored at 4 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>6 - well plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>60 mm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>NUNC</td><td>339650</td><td></td></tr></tbody></table>

neuronal differentiation from mouse embryonic stem cells in vitro

Fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC' ler) nöral farklılaşması, nörogenezde yer alan temel mekanizmaların aydınlatıcı ve rejeneratif tıbba potansiyel olarak yardımcı olan potansiyel bir araçtır. Burada, kombinatoryal tarama stratejisinikullanarak mESC in vitro'dan nöronal farklılaşma için verimli ve düşük maliyetli bir yöntem oluşturduk. Burada tanımlanan koşullar altında, 2 günlük embriyoid vücut oluşumu + 6 günlük retinoik asit indüksiyon protokolü, Nestin pozitif olan iyi istiflenmiş ve neurit benzeri A2lox ve 129 türevin oluşumunda görüldüğü gibi, MESC'lerden sinirsel öncül hücrelere (NPC' ler) hızlı ve verimli bir şekilde farklılaşmaya izin sağlar. Embriyoid cisimlerin sağlıklı durumu ve retinoik asidin (RA) uygulandığı zaman noktası ve RA konsantrasyonları bu süreçte kritik öneme sahiptir. Daha sonraki NPC'lerden nöronlara farklılaşmada, N2B27 orta II (Nörobakal ortam tarafından desteklenmiştir) nöronal hücrelerin uzun süreli bakımını ve olgunlaşmasını daha iyi destekleyebilir. Sunulan yöntem yüksek verimlilik, düşük maliyetli ve kullanımı kolaydır ve nörobiyoloji ve gelişimsel biyoloji araştırmaları için güçlü bir araç olabilir.

2 günlük embriyoid vücut oluşumu + 6 günlük RA indüksiyonu, mESC'lerin farklılaştırılmasını NPC'lere (Faz I) yönlendirmede en iyi şekilde çalışır. MESC'lerin NPC'lere (Aşama I) farklılaştırılmasını en iyi şekilde destekleyen en uygun protokolü belirlemek için, hem A2lox hem de 129 mESC 'de(Tablo 1)7 protokol test edildi ve her grubun farklılaşma durumu ışık mikroskobu kullanılarak izlendi. Şekil 3A'dagösterildiği gibi , "2 günlük embriyoid vücut oluşumu + 6 günlük RA indüksiyonu" tedavisi (Faz I-protokolü 3) altında çoğu A2lox ve 129 türevi, NPC'lerin oluşumunu gösteren iyi yığılmış ve neurit benzeri morfolojiler göstermiştir. Bununla birlikte, "4 günlük embriyoid vücut oluşumu + 4 günlük RA indüksiyonu" tedavisi (Faz I-protokolü 2) olan hücreler, embriyoid cisimlerde besin eksikliğinden kaynaklanabilecek zayıf ve apoptotik durum göstermiştir. RA indüksiyonu (Faz I-protokolü 4 ve 5) ile birlikte monolayer kültürü mESC'lerin farklılaşmasına da yön verebilirken, neurit benzeri hücrelerin oranı Faz I-protokolü 3'teki kadar değildi. Bu arada, Faz I-protokolü 6 ve 7'deki çoğu A2lox ve 129 türevi daha küçük hücre cisimleri gösterdi ve apoptoz geçirme eğiliminde olduğunu belirterek, N2B27 medium II'nin embriyonik nörogenezi etkili bir şekilde destekleyemeyeceğini düşündürmektedir.
NPC'lerin oluşumunu daha da doğrulamak için, her gruptaki Nestin+ hücrelerinin yüzdesi (NPC'ler için belirteç) bir immünofluoresans tahlili kullanılarak tespit edildi. Şekil 3B'deNestin+ hücrelerinin Faz I protokolü 3'teki yüzdesi en yüksekti ve sırasıyla %4,33 ± 77,67'ye, A2lox ve 129 türevlerinde ise %2,33'± 69,33'e ulaştı. Toplu olarak, Aşama I-protokolü 3, mESC'lerin farklılaştırılmasını NPC'lere yönlendirmede en iyi şekilde çalışır.
N2B27 orta II, NPC'lerden nöronlara (Faz II) farklılaşmayı en etkili şekilde teşvik edebilir. Faz II farklılaşmasında üç protokol incelendi. Şekil 4A'dagösterildiği gibi, morfolojik gözlem, faz II-protokol 3'teki A2lox ve 129 türevlerinin çoğunun (N2B27 orta II ile farklılaşma) 18. İmmünofluoresans tahlilleri, D18'de sırasıyla β-Tubulin III+ hücrelerinin% 4.01'± ve 58.73'e ±% 7.25'e kadar olan nöronların neslini doğruladı (Şekil 4B).
Daha açık hale getirmek için, embriyonik nörogenez için optimize edilmiş yöntemin şematik diyagramı Şekil 5'te gösterilmiştir. Kısaca, 1.5 x10 6 mESC, 10 mL bazal farklılaşma ortamı I'de yapışkan olmayan bir bakteri kabına tohumlanır ve 2 gün boyunca embriyoid vücut oluşumuna izin verir. Daha sonra embriyoid cisimleri toplanır ve kuyu başına 50 embriyoid cisim konsantrasyonu ile% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakalarına ekilir. Bu arada, RA (1 μM) 6 gün daha eklenir. 8. günden 18. güne kadar RA çıkarılır ve sonraki farklılaşmayı NPC'lerden nöronlara yönlendirmek için N2B27 orta II uygulanır. Böyle bir kombine yöntemle, 18. günde sağlam nöronlar oluşturulabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig01.jpg"> Şekil 1: Embriyonik nörogenez sürecinin şeması. Bu rakam Li ve ark.10'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61190/61190fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig02.jpg"> Şekil 2: Embriyoid cisimlerinin morfolojisi. (A) Embriyoid cisimler 4 gün boyunca kültürlü. (B) Embriyoid cisimler 2 gün boyunca kültüre edildi. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61190/61190fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig03.jpg"> Şekil 3: A2lox ve 129 mESC kullanılarak faz I farklılaşmasına ilişkin 7 protokolün verimlilik karşılaştırması. (A) 8. Günde A2lox ve 129 mESC türevlerinin morfolojik analizi. Üst panel: A2lox türevleri; Alt panel: 129 türev. (B) NPC oluşumu için immünoresans tespiti (Nestin+, yeşil). Çekirdekler DAPI ile mavi olarak etiketlenmişti. Üst panel: D8'de A2lox türevleri; Alt panel: D8'de 129 türev. Her grubun Nestin+ hücrelerinin yüzdeleri histogram ile gösterilmiştir. Her sütun üç bağımsız deneyin ortalama±SEM'ini temsil eder. *, s≤0.05; **, s≤0.01. Bu rakam Li ve ark.10'dandeğiştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61190/61190fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig04.jpg"> Şekil 4: Faz II farklılaşmasına ilişkin 3 protokolün verimlilik karşılaştırması. (A) 18. Günde A2lox ve 129 mESC türevlerinin morfolojik analizi. Üst panel: A2lox türevleri; Alt panel: 129 türev. (B) Nöron oluşumu için immünoresans tespiti (β-Tubulin III+, kırmızı). Çekirdekler DAPI ile mavi olarak etiketlenmişti. Üst panel: D18'de A2lox türevleri; Alt panel: D18'de 129 türev. Her grubun β-Tubulin III+ hücrelerinin yüzdeleri histogram ile gösterilmiştir. Her sütun, üç bağımsız deneyin ortalama ± SEM'ini temsil eder. *, s≤0.05; **, s≤0.01. Bu rakam Li ve ark.10'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61190/61190fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig05.jpg"> Şekil 5: MESC in vitro'dan nöronal farklılaşma için optimize edilmiş yöntemin kısa modeli Bu rakam Liet al.10'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61190/61190fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Farklılaşma Aşaması I (8d)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Protokol</td>
			<td>Medya</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 1</td>
			<td>Doğal olarak farklılaşma: Bazal farklılaşma ortamı ile sadece ben</td>
			<td rowspan="5">Bazal farklılaşma ortamı I: DMEM/F12 +%15 FBS + %1 NEAA+0,1mM 2ME+ %1 P/S</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 2</td>
			<td>4 günlük Embriyoid Vücut oluşumu + 4 günlük RA indüksiyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 3</td>
			<td>2 günlük Embriyoid Vücut oluşumu + 6 günlük RA indüksiyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 4</td>
			<td>RA indüksiyonu ile birlikte monolayer kültürü: 4d (-RA) 4d (+RA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 5</td>
			<td>RA indüksiyonu ile birlikte monolayer kültürü: 2d (-RA) 6d(+RA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 6</td>
			<td>Embriyoid Cisim oluşumu (4 d) ve N2B27 orta II ile indüklenen farklılaşma</td>
			<td rowspan="2">N2B27 orta II: %49 DMEM/F12+ %1 N2 + %48 Nörobakal orta + %2 B27 +%1 GlutaMAX+ 0,1mM 2ME</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 7</td>
			<td>N2B27 orta II ile monolayer kültürü</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Aşama I farklılaşmasında kullanılan 7 protokolün ayrıntıları. Bu tablo Li ve ark.10'dan değiştirilmiştir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Farklılaşma Aşaması II (10d)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Protokol</td>
			<td>Medya</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 1</td>
			<td>Doğal olarak farklılaşma: Bazal farklılaşma ortamı ile sadece ben</td>
			<td>Bazal farklılaşma ortamı I: DMEM/F12 +%15 FBS +%1 NEAA +0,1mM 2ME+ %1 P/S</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 2</td>
			<td>N2B27 medium I ile farklılaşma</td>
			<td>N2B27 orta I: DMEM/F12 + 1%N2 + 2%B27 + %1 GlutaMAX +0.1mM 2ME</td>
		</tr>
<tr>
<td>protokol 3</td>
			<td>N2B27 orta II ile farklılaşma</td>
			<td>N2B27 orta II: %49 DMEM/F12+ %1 N2 + %48 Nörobakal orta + %2 B27 +%1 GlutaMAX+ 0,1mM 2ME</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Faz II farklılaşmasında kullanılan 3 protokolün ayrıntıları. Bu tablo Li ve ark.10'dan değiştirilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro at JoVE.com

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Burada embriyonik kök hücrelerden nöronlara hızlı ve verimli farklılaşmayı yönlendiren düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir yöntem kurduk. Bu yöntem laboratuvarlar arasında popülerleşmeye uygundur ve nörolojik araştırmalar için yararlı bir araç olabilir.

Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

neuronal-differentiation-from-mouse-embryonic-stem-cells-in-vitro

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Görüntüleme.  Wuhan Center for Disease Control and Prevention. Burada embriyonik kök hücrelerden nöronlara hızlı ve verimli farklılaşmayı yönlendiren düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir yöntem kurduk. Bu yöntem laboratuvarlar arasında popülerleşmeye uygundur ve nörolojik araştırmalar için yararlı bir araç olabilir.

Video: Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

İki ve Üç boyutlu Embriyoid Oluşumu Fare Embriyonik Kök Hücreler Retinoik Asit kaynaklı sinir Farklılaşma analizi

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Kök ve Ağ Kültürlerde Biyolojik nörotoksinlerin Fonksiyonel Değerlendirme Merkezi Sinir Sistemi Nöronlar Hücre-türetilmiş

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Nörobilim

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Nöral Progenitör Hücreler Üretmek İçin Bir Teknik

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Nöronal Kültür Teknikleri

Gelişmiş Nöron Modelleri

Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neurons

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video showcased a cell culture method for differentiating neural progenitor cells into neurons. By incubating cells in a nutrient-rich medium supplemented with growth factors, the progenitor cells matured into neurons with developed axons and dendrites. A stabilizing agent ensured cell viability and protected against oxidative damage throughout the differentiation process.