Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31501099) und der Middle-aged and Young of the Education Department of Hubei Province, China (Nr. Q20191104). Und wir danken Professor Wensheng Deng von der Wuhan University of Science and Technology für die Bereitstellung der mausembryonalen Stammzelllinien A2lox.

1. Maus embryonale Stammzellkultur
<ol><li>Bereiten Sie 0,1% gelatinebeschichtete Zellkultur-Gerichte oder Teller zu.<ol>
<li>2 ml sterilisierte 0,1% Gelatine (0,1% w/v in Wasser) zu 60 mm Zellkulturschalen hinzufügen. Schaukeln Sie sanft, um eine gleichmäßige Beschichtung der Zellkulturgerichte zu gewährleisten.</li>
		<li>Die Gerichte bei 37 °C in einen 5% CO2-Inkubator geben und 1 h beschichten lassen.</li>
		<li>Entfernen Sie die 0,1% Gelatinelösung, bevor Sie die Zellen säen. HINWEIS: Nach dem Entfernen der Gelatine ist es nicht erforderlich, die beschichteten Gerichte zu trocknen oder zu waschen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embryonale Stammzellen der Maus (A2lox und 129) Kultur<ol>
<li>Inkubieren Sie mESCs (A2lox und 129) Zellen in den 0,1% gelatinebeschichteten 60 mm Zellkulturschalen in mESC Wachstumsmedium bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator. Das mESC-Wachstumsmedium besteht aus 85% Knock-out DMEM/F12, 15% Knock-out Serumersatz (KSR), 0,1 mM β-Mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% nicht-essentielle Aminosäure (NEAA), 1% Penicillin/Streptomycin (P/S), 1000 U/mL Leukämie-Hemmfaktor (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3-Hemmer) und 0,33 nM PD0325901 (MEK-Hemmer). VORSICHT: β-Mercaptoethanol ist entzündlich und hat Inhalationstoxizität. Halten Sie sich von Brandquellen fern und tragen Sie eine Maske, um einEinatmen bei Gebrauch zu vermeiden.</li>
		<li>Ändern Sie das mESC-Wachstumsmedium täglich für ein besseres Wachstum von A2lox und 129.</li>
		<li>Wenn die Zellen 80% Zusammenfluss erreichen, entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml 0,1% Trypsin in die Schale. Sanft für 30 s schaukeln, um eine gleichmäßige Abdeckung von Trypsin auf allen Zellen zu gewährleisten.</li>
		<li>Lassen Sie die Zellen für etwa 1 min zu trypsinizeund dann entfernen Sie das Trypsin mit 1 ml Pipette.</li>
		<li>Fügen Sie 2 ml mL mESC Wachstumsmedium auf die Schale, Pipette nach oben und unten mehrmals, um eine einzellige Suspension zu machen.</li>
		<li>Zählen Sie die Dichte der Zellen in der Suspension so genau wie möglich mit Hämozytometer.</li>
		<li>Teilen Sie die Zellen in 7 Gruppen auf und induzieren Sie eine Differenzierung anhand verschiedener Protokolle, die in Tabelle 1dargestellt sind.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Differenzierung von mESCs zu NPCs (Phase I)
<ol><li>0,1% gelatinebeschichtete Zellkulturplatten oder Decklippen zubereiten.<ol>
<li>Vor Gebrauch 0,1% gelatinebeschichtete 6-Well-Platten oder Decklippen wie in Schritt 1.1 zubereiten.</li>
	</ol></li>
	<li>Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 1 (Tabelle 1)<ol>
<li>Samen ca. 2 x 104 mESCs in 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen in den 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Überprüfen Sie die Zelldichte unter dem Mikroskop.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator für 6 h, um eine Anhaftung zu ermöglichen.</li>
		<li>Nach der Anhaftung nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator heraus und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Brunnen 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I (Tabelle 1) hinzu und legen Sie die Zellen wieder in den Inkubator.</li>
		<li>Lassen Sie die Zellen für 8 Tage zur Differenzierung. Ersetzen Sie das Basaldifferenzierungsmedium I alle 2 Tage.</li>
	</ol></li>
	<li>Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 2 (Tabelle 1)<ol>
<li>Fügen Sie 1,5 x 106 mESCs in eine nicht klebende bakterielle Schale in 10 ml Basaldifferenzierungsmedium I ein, um die embryoide Körperbildung bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator zu ermöglichen.</li>
		<li>Nach 2 Tagen zellische Aggregate in 15 ml Zentrifugenrohre übertragen und durch Schwerkraft absetzen lassen.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml frisches Basaldifferenzierungsmedium I hinzu, um die embryoiden Körper wieder auszusetzen. Pflanzen Sie sie in eine neue nicht klebende bakterielle Schale ein und ermöglichen eine Differenzierung für weitere 2 Tage.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Bildung von embryoiden Körpern unter dem Mikroskop (Abbildung 2A).</li>
		<li>Sammeln Sie embryoide Körper, wie in den Schritten 2.3.2-2.3.3 beschrieben. Samen etwa 50 embryoide Körper in 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf 0,1% gelatinebeschichtete 6-Well-Platten.</li>
		<li>1 mM All-Trans RA-Lager (in DMSO) vorbereiten und nach der Unterverpackung in einem -80 °C-Gefrierschrank vor dem Licht lagern. HINWEIS: RA ist instabil, und es sollte darauf geachtet werden, es von Licht fernzuhalten und den Luftkontakt während der Vorbereitung des RA-Bestands zu reduzieren.</li>
		<li>Für die RA-Induktion fügen Sie in jedem Bohrwert 2 L RA-Lager hinzu, um eine Endkonzentration von 1 M zu erreichen.</li>
		<li>Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator und differenzieren Sie sie weitere 4 Tage.</li>
		<li>Ändern Sie alle 2 Tage das gesamte 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I (mit 1 M RA).</li>
	</ol></li>
	<li>Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 3 (Tabelle 1)<ol>
<li>1,5 x 106 mESCs in eine nicht klebende bakterielle Schale in 10 ml Basaldifferenzierungsmedium I pflanzen. 2 Tage für die embryoide Körperbildung bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator lassen.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Bildung von embryoiden Körpern unter dem Mikroskop (Abbildung 2B).</li>
		<li>Zellaggregate in 15 ml Zentrifugenrohre übertragen und durch Schwerkraft absetzen lassen.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand sorgfältig und fügen Sie 10 ml frisches Basaldifferenzierungsmedium I hinzu, um sie wieder auszusetzen.</li>
		<li>Säen Sie etwa 50 embryoide Körper in 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf 0,1% gelatinebeschichtete 6-Well-Platten.</li>
		<li>Für die RA-Induktion fügen Sie in jedem Bohrwert 2 L RA-Lager hinzu, um eine Endkonzentration von 1 M zu erreichen.</li>
		<li>Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator und differenzieren Sie sie für weitere 6 Tage. Ändern Sie alle 2 Tage das gesamte Basaldifferenzierungsmedium I (mit 1 M RA).</li>
	</ol></li>
	<li>Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 4 (Tabelle 1)<ol>
<li>Samen ca. 2 x 104 mESCs innerhalb von 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf die 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator, um eine Befestigung für 6 h zu ermöglichen.</li>
		<li>Nach der Befestigung die Zellen zweimal mit 2 ml PBS waschen. Fügen Sie jeweils 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I zu jedem Brunnen hinzu und lassen Sie eine Differenzierung für 4 Tage im 5% CO2-Inkubator bei 37 °C zu.</li>
		<li>Für die RA-Induktion fügen Sie jedem Bohrgut 2 L All-Trans-RA-Bestand (die Arbeitskonzentration beträgt 1 M) hinzu, um weitere 4 Tage differenzierungzuregen.</li>
		<li>Ersetzen Sie im gesamten Prozess alle 2 Tage das gesamte Medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 5 (Tabelle 1)<ol>
<li>Samen ca. 2 x 104 mESCs innerhalb von 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf die 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator, um eine Befestigung für 6 h zu ermöglichen.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS. Fügen Sie jeweils 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I zu jedem Brunnen hinzu und lassen Sie eine Differenzierung für 2 Tage im 5% CO2-Inkubator bei 37 °C zu.</li>
		<li>Für die anschließende RA-Induktion fügen Sie jedem Bohrkörper 2 L RA-Bestand hinzu, um eine Endkonzentration von 1 m zu erreichen. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator, um für weitere 6 Tage eine Differenzierung zu induzieren.</li>
		<li>Ersetzen Sie im gesamten Prozess alle 2 Tage das gesamte Medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 6 (Tabelle 1)<ol>
<li>1,5 x 106 mESCs in eine nicht klebende bakterielle Schale in 10 ml N2B27 Medium II(Tabelle 1) pflanzen, um die Bildung embryoider Körper zu ermöglichen.</li>
		<li>Sammeln Sie am2. Tag die in den Schritten 2.3.2-2.3.3 beschriebenen Zellaggregate und setzen Sie die embryoiden Körper mit 10 ml frischem N2B27-Medium II wieder aus.</li>
		<li>Pflanzen Sie sie in eine neue nicht klebende bakterielle Schale ein und lassen Sie sie für weitere 2 Tage im 5% CO2-Inkubator bei 37 °C differenzierungen. Überprüfen Sie die Bildung von embryoiden Körpern unter dem Mikroskop.</li>
		<li>Sammeln Sie am4. Tag embryoide Körper. Samen etwa 50 embryoide Körper pro Brunnen auf 0,1% gelatinebeschichtete 6-Well-Platten mit 2 ml N2B27 Medium II.</li>
		<li>Fügen Sie in jedem Brunnen 2 L All-Trans-RA-Bestände hinzu und induzieren Sie weitere 4 Tage Differenzierung. Ersetzen Sie das gesamte Medium (N2B27 medium II mit 1 M RA) alle zwei Tage.</li>
	</ol></li>
	<li>Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 7 (Tabelle 1)<ol>
<li>Samen ca. 2 x 104 mESCs innerhalb von 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf die 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator, um eine Befestigung für 6 h zu ermöglichen.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Dann fügen Sie 2 ml N2B27 medium II zu jedem Brunnen hinzu und lassen Sie eine Differenzierung für 8 Tage bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator zu.</li>
		<li>Ändern Sie das gesamte N2B27 Medium II alle 2 Tage.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Zellmorphologie Beobachtung
<ol><li>Überprüfen Sie den Differenzierungsstatus der oben genannten 7 Gruppen täglich unter einem invertierten Phasenkontrastlichtmikroskop.</li>
	<li>Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip mindestens 12 Felder aus, und nehmen Sie Fotos auf, um die morphologischen Veränderungen jeder Gruppe auf D8 aufzuzeichnen.</li>
</ol>4. Immunfluoreszenzfärbung
<ol><li>Probenvorbereitung: Seed mESCs auf 0,1% gelatinebeschichteten Abdeckungen und ermöglichen eine Differenzierung für 8 Tage unter Verwendung der in Schritt 2 genannten Protokolle.</li>
	<li>Spülen: Am8. Tag die Proben aus dem Inkubator nehmen und das Differenzierungsmedium durch Aspiration entfernen. Spülen Sie die Zellen einmal mit 1 ml PBS für 5 min.</li>
	<li>Fixierung: Fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd zu jeder Probe hinzu und fixieren Sie die Zellen für 20 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Spülen: Spülen Sie die Zellen nach der Fixierung mit 1 ml PBS 3 mal, jeweils 5 min.</li>
	<li>Permeabilisierung: Fügen Sie 1 ml 0,2% TritonX-100 in PBS zu jeder Probe hinzu und lassen Sie sie 8 min bei RT.</li>
	<li>Spülen: Spülen Sie die Zellen nach permeabilisieren der Zellen mit 1 ml PBS 3 mal, jeweils 5 min.</li>
	<li>Blockierung: Fügen Sie 1 ml 10% Ziegenserum in PBS zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie bei RT für 1 h, um alle unspezifischen Wechselwirkungen zu blockieren.</li>
	<li>Inkubation mit primärem Antikörper<ol>
<li>Verdünnen Sie den Anti-Nestin-Antikörper im Verhältnis 1:100 mit 5% Ziegenserum in PBS.</li>
		<li>500 l verdünnter Antikörper auf verschiedene Proben auftragen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spülen: Entfernen Sie den Antikörper und spülen Sie die Proben vorsichtig mit 1 ml PBS 3 mal für jeweils 8 min.</li>
	<li>Inkubation mit Sekundärantikörper<ol>
<li>Verdünnen Sie das Alexa Fluor 488-markierte Ziegenanti-Maus-IgG im Verhältnis 1:500 mit 5% Ziegenserum in PBS.</li>
		<li>500 l verdünnter Antikörper auf verschiedene Proben auftragen und bei RT 2 h im Dunkeln brüten. HINWEIS: Führen Sie nach dem Auftragen eines fluoreszierenden Sekundärantikörpers alle nachfolgenden Schritte im Dunkeln aus, um eine Fluoreszenzabschreckung zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spülen: Entfernen Sie den sekundären Antikörper und spülen Sie die Proben vorsichtig mit 1 ml PBS 3 mal für jeweils 8 min.</li>
	<li>Nukleare Färbung und Montage<ol>
<li>Legen Sie einen Tropfen DAPI-Montagemedium auf den sauberen Mikroschlitten.</li>
		<li>Nehmen Sie die Proben vorsichtig von den Platten ab und legen Sie die Probe mit der Zelle nach unten auf das DAPI-Montagemedium. Lassen Sie im Dunkeln für 5 min bei RT.</li>
		<li>Entfernen Sie überschüssiges DAPI-Montagemedium mit saugfähigem Papier.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fluoreszenzmikroskopische Beobachtung<ol>
<li>Stellen Sie die Proben unter die Fluoreszenzmikroskopie und erkennen Sie das Signal für DAPI und Alexa Fluor 488 mit geeigneten Filtern.</li>
		<li>Wählen Sie gleichmäßig und zufällig 10-15 verschiedene visuelle Felder für jedes Sample aus und zeichnen Sie die Bilder mit einer CCD-Kamera auf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Differenzierung von NPCs zu Neuronen (Phase II)
<ol><li>Bereiten Sie mESC-Derivate nach Phase-I-Differenzierung nach Protokoll 3 (8 Tage, Tabelle 1) vor, wie in Schritt 2.4 beschrieben, das die höchste Differenzierungseffizienz hat (siehe Abbildung 3). HINWEIS: Nach der Phase-I-Differenzierung sollte die Qualitätskontrolle mit Hilfe der oben genannten Zellmorphologiebeobachtung und Immunfluoreszenz-Assay durchgeführt werden, um eine gesunde und ertragreiche NPCs zu gewährleisten.</li>
	<li>Samen ca. 5 x 105 mESC-Derivate innerhalb von 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf die 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Teilen Sie die mESC-Derivate nach dem Zufallsprinzip in 3 Gruppen auf, wie Phase II-Protokoll 1, Protokoll 2 und Protokoll 3.</li>
	<li>Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator, um eine Befestigung für 6 h zu ermöglichen. Waschen Sie sie zweimal mit 2 ml PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I, N2B27 Medium I und N2B27 Medium II (Tabelle 2) zu jedem Brunnen der oben genannten Gruppen hinzu.</li>
	<li>Legen Sie die Platten in den Inkubator und lassen Sie für weitere 10 Tage unterscheiden. Ändern Sie das entsprechende Medium alle 2 Tage.</li>
	<li>Überprüfen Sie den Differenzierungsstatus und zeichnen Sie die morphologischen Veränderungen auf, wie in Schritt 3 erwähnt.</li>
	<li>Bewerten Sie am 18. Tag die Erzeugung von Neuronen (β-Tubulin III positiv) und bestimmen Sie die Differenzierungseffizienz der 3 Protokolle unter Verwendung von Schritt 4.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu verraten.

In der vorliegenden Studie haben wir eine einfache und effektive Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs mit kostengünstigen und leicht zu erhaltenden Materialien etabliert. Bei dieser Methode können 2 Tage embryoiden Körperbildung gefolgt von 6 Tagen RA-Induktion die Differenzierung von mESCs in NPCs wirksam fördern (Phase I-Protokoll 3). Für die Phase-II-Differenzierung induzieren N2B27 Medium II (Phase II-Protokoll 3) am effektivsten die Differenzierung von NPCs in Neuronen. Um den Erfolg zu gewährleisten, sollten mehrere kritische Schritte stärker beachtet werden.
Erstens ist der gesunde Zustand von Embryokörpern der Schlüssel für den gesamten Differenzierungsprozess. Dreidimensionale embryoide Körperbildung wird in der Regel verwendet, um die Differenzierung von ESCs8zu lenken. In dieser Studie untersuchten wir die richtige Suspensionskulturzeit von embryoiden Körpern. Wie in Abbildung 2gezeigt, wurden runde Embryoide Körper mit hellen Kernen nach Suspensionskultur für 2 Tage in diesem Zustand gebildet. Wenn sie jedoch 4 Tage lang kultiviert werden, haften viele embryoide Körper aneinander, und die Kerne werden dunkel, was auf die Apoptose von Zellen in den Kernen hindeutet. Die anschließende Differenzierung bestätigte die schlimmere Wirkung einer längeren embryoiden Körperbildung. In einigen berichteten Studien, Suspensionskultur von embryoiden Körpern könnte für so lange wie 10 Tage dauern, mit Medium mit niedrigerFBS Konzentration oder ohne FBS11. Die verminderte Zeit für embryoide Körperbildung in der Studie kann auf die höhere FBS-Konzentration (15%) und es ist erwiesen, dass 15% FBS die Bildung und Differenzierung von embryoiden Körpern besser fördern kann.
Zweitens sind der Zeitpunkt, zu dem RA angewendet wird, und die RA-Arbeitskonzentration entscheidend für die Bestimmung des Zellschicksals von mESCs. RA, ein Derivat von Vitamin A, ist eines der wichtigsten Morphogene mit pleiotropen Aktionen12. RA kann mehrere Signalwege regulieren und die Zellschicksalsbestimmung von ESCs13,14beeinflussen. Berichte zeigten, dass die kurzfristige Behandlung von mESCs mit RA während der frühen Differenzierungsphase eine spontane Differenzierung verhinderte und die Selbsterneuerungskapazität von mESCs15aufrechterhielt. Andere schlugen vor, dass RA sowohl die Differenzierung von Keimzellen als auch die neuronale Differenzierung von ESCs regulieren könnte, die zeitpunktabhängig sind16,17,18. In dem hier vorgestellten Zustand, RA hinzugefügt am2. Tag nach embryoiden Körperbildung ist geeignet, um die Differenzierung in NPCs zu lenken. Inzwischen ist auch die Arbeitskonzentration von RA kritisch. Niedrige RA-Konzentrationen (ca. 10 nM) können die Differenzierung von mESCs in Endoderm-ähnliche Zellen induzieren, während hohe RA-Konzentrationen (1-5 m) eher eine Differenzierung in NPCs13,14,15,16,17,18,19induzieren. Aufgrund der Verwendung von RA würde man einen Caudalisierungseffekt erwarten; die Differenzierung in Vorhirn-Neuronen wäre selten zu sehen und nachgebende Neuronen von Hinterhirn- und Rückenmarksschicksalen würden20,21auftreten. Darüber hinaus ist RA ein leicht verfügbarer und kostengünstiger Agent, und die Verwendung dieses Protokolls kann Forschungsgelder für die meisten Labore sparen.
Drittens können die nPCs, die nach der Phase-I-Differenzierung erzeugt werden, in einem hier vorgestellten Zustand unter angemessenen Bedingungen gespeichert und durchlaufen werden. Die Kryokonservierung mit hoher Zelldichte (>2 x 106) mit Stem-Cellbanker kann die zellschädigenden Zellschäden, die durch das Einfrieren verursacht werden, effektiv reduzieren, um eine hohe Rückgewinnungsrate zu erhalten. In der Zwischenzeit können nPCs, die in der Studie generiert werden, mit N2B27 medium (49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Neurobasalmedium + 2% B27) mit einer Zelldichte von mehr als 5 x 105/cm2durchzogen werden. Bei geringer Zelldichte (weniger als 0,5 x 105/cm2)neigen NPCs dazu, sich zu differenzieren. Eine solche Zellkryokonservierung und Erholung kann große Bequemlichkeit für die Forschung bringen.
Darüber hinaus ist das neurobasale Medium für die Phase-II-Differenzierung von wesentlicher Bedeutung. Neurobasales Medium wurde speziell für die langfristige Erhaltung und Reifung der neuronalen Zelle entwickelt. Wie in N2B27 medium II (Tabelle 2) aufgeführt, könnte die Zugabe von Neurobasalmedium die Differenzierung von NPCs zu Neuronen besser unterstützen.
Gemeinsam berichteten wir über eine effiziente und kostengünstige Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs in vitro, unter Verwendung der Strategien des kombinatorischen Screenings. Die etablierte Methode ist sehr einfach zu implementieren und eignet sich für den Einsatz in den meisten Laboratorien. Eine solche optimierte Methode kann ein leistungsfähiges Werkzeug für die Neurobiologie und Entwicklungsbiologieforschung sein.

Embryonale Stammzellen (ESCs) sind pluripotent und können sich unter bestimmten Bedingungen in neuronale Vorläuferzellen (NPCs) und anschließend in Neuronen differenzieren1. ESC-basierte Neurogenese bietet die beste Plattform, um Neurogenese zu imitieren, und dient somit als nützliches Werkzeug für Entwicklungsbiologie-Studien und potenziell Hilfe in der regenerativen Medizin2,3. In den letzten Jahrzehnten wurden viele Strategien zur Induktion der embryonalen Neurogenese berichtet, wie die transgene Methode4, mit kleinen Molekülen5, mit einer 3D-Matrix-Mikroumgebung6, und die Co-Kultur-Technik7. Die meisten dieser Protokolle sind jedoch entweder bedingt oder schwer zu bedienen, daher sind sie für den Einsatz in den meisten Laboratorien nicht geeignet.
Um eine einfach zu bedienende und kostengünstige Methode zu finden, um eine effiziente neuronale Differenzierung von mESCs zu erreichen, wurde hier eine kombinatorische Screening-Strategie verwendet. Wie in Abbildung 1beschrieben, wurde der gesamte Prozess der embryonalen Neurogenese in 2 Phasen unterteilt. Phase I bezieht sich auf den Differenzierungsprozess von mESCs in NPCs, und Phase II bezieht sich auf die nachfolgende Differenzierung von NPCs in Neuronen. Basierend auf den Prinzipien der einfachen Bedienung, der niedrigen Kosten, der leicht zugänglichen Materialien und der hohen Differenzierungseffizienz wurden sieben Protokolle in Phase I und drei Protokolle in Phase II auf der Grundlage des traditionellen stickigen Monolayer-Kultursystems oder embryoiden Körperbildungssystems8,9ausgewählt. Die Differenzierungseffizienz von Protokollen in beiden Phasen wurde mittels Zellmorphologiebeobachtung und Immunfluoreszenz-Assay evaluiert. Durch die Kombination des effizientesten Protokolls jeder Phase haben wir die optimierte Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs etabliert.

<table><tbody><tr><td>Anti-Nestin antibody [Rat-401]</td><td>Abcam</td><td>Ab11306</td><td>stored at -80 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Anti-&amp;beta;-Tubulin III antibody produced in rabbit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td><td>stored at -80 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serum free</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, and protect from light</td></tr><tr><td>CHIR-99021 (CT99021)</td><td>Selleck</td><td>S1263</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Fluorescence microscopy</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Gibco</td><td>CM0635B</td><td>stored at room temperature</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor human</td><td>Sigma</td><td>L5283</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td>stored at 4 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids solution</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson</td><td>005-000-121</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Nonadhesive bacterial dish</td><td>Corning</td><td>3262</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Penicillin/ Streptomycin Solution</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PD0325901(Mirdametinib)</td><td>Selleck</td><td>S1036</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>stored at -80 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells</td><td>Cyagen</td><td>MUAES-01001</td><td>Maintained in feeder-free culture system</td></tr><tr><td>Stem-Cellbanker (DMSO free)</td><td>ZENOAQ</td><td>stem cellbanker DMSO free</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25% (1X) Solution</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>stored at 4 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>6 - well plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>60 mm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>NUNC</td><td>339650</td><td></td></tr></tbody></table>

neuronal differentiation from mouse embryonic stem cells in vitro

Die neuronale Differenzierung embryonaler Stammzellen (mESCs) ist ein mögliches Werkzeug zur Aufklärung der Schlüsselmechanismen der Neurogenese und potenzieller Hilfe in der regenerativen Medizin. Hier haben wir eine effiziente und kostengünstige Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs in vitroetabliert, mit der Strategie des kombinatorischen Screenings. Unter den hier definierten Bedingungen ermöglicht die 2-tägige embryoide Körperbildung + 6-Tage-Retinoinsäure-Induktionsprotokoll eine schnelle und effiziente Differenzierung von mESCs in neuronale Vorläuferzellen (NPCs), wie die Bildung von gut gestapelten und neuritigen A2lox- und 129 Derivaten sieht, die Nestin-positiv sind. Der gesunde Zustand von embryoiden Körpern und der Zeitpunkt, an dem Retinsäure (RA) angewendet wird, sowie die RA-Konzentrationen sind dabei von entscheidender Bedeutung. In der anschließenden Differenzierung von NPCs in Neuronen könnte N2B27 medium II (ergänzt durch Neurobasal medium) die langfristige Erhaltung und Reifung neuronaler Zellen besser unterstützen. Die vorgestellte Methode ist hochgradig effizient, kostengünstig und einfach zu bedienen und kann ein leistungsfähiges Werkzeug für die Neurobiologie und Entwicklungsbiologieforschung sein.

2-Tage embryoide Körperbildung + 6-Tage-RA-Induktion funktioniert am besten bei der Unterscheidung von mESCs in NPCs (Phase I). Um das optimale Protokoll zu bestimmen, das die Differenzierung von mESCs in NPCs (Phase I) am besten fördert, wurden 7 Protokolle sowohl auf A2lox als auch auf 129 mESCs (Tabelle 1) getestet und der Differenzierungsstatus jeder Gruppe mit Lichtmikroskop überwacht. Wie in Abbildung 3Adargestellt, zeigten die meisten A2lox- und 129-Derivate unter "2-Tage-Embryoid-Körperbildung + 6-Tage-RA-Induktionsbehandlung" (Phase I-Protokoll 3) gut gestapelte und neuritartige Morphologien, die auf die Bildung von NPCs hindeuten. Zellen mit "4-tage embryoider Körperbildung + 4-Tage-RA-Induktion" (Phase I-Protokoll 2) zeigten jedoch einen schlechten und apoptotischen Status, der auf den Mangel an Nährstoffen in embryoiden Körpern zurückzuführen sein kann. Die Monolayer-Kultur in Kombination mit der RA-Induktion (Phase I-Protokoll 4 und 5) könnte auch die Differenzierung von mESCs lenken, während der Anteil der neuritartigen Zellen nicht so hoch war wie der in Phase I-Protokoll 3. In der Zwischenzeit zeigten die meisten A2lox- und 129-Derivate in Phase I-Protokoll 6 und 7 kleinere Zellkörper und neigten zur Apoptose, was darauf hindeutet, dass N2B27 Medium II die embryonale Neurogenese nicht effektiv unterstützen konnte.
Um die Bildung von NPCs weiter zu bestätigen, wurde der Prozentsatz der Nestin+-Zellen (Marker für NPCs) in jeder Gruppe mit einem Immunfluoreszenz-Assay nachgewiesen. In Abbildung 3Bwar der Anteil der Nestin+-Zellen in Phase I-Protokoll 3 am höchsten und erreichte bis zu 77,67 ± 4,33 % bzw. 69,33 ± 2,33 % in A2lox- bzw. 129-Derivaten. Insgesamt funktioniert Phase I-Protokoll 3 am besten bei der Unterscheidung von mESCs in NPCs.
N2B27 Medium II kann am effektivsten die Differenzierung von NPCs in Neuronen induzieren (Phase II). Drei Protokolle in Phase-II-Differenzierung wurden untersucht. Wie in Abbildung 4Adargestellt, zeigte die morphologische Beobachtung, dass die meisten A2lox- und 129-Derivate in Phase II-Protokoll 3 (Differenzierung mit N2B27 medium II) die am weitesten verlängerten neuronenähnlichen Strukturen mit klaren Neuriten und Zellkörpererweiterungen bis Tag 18 aufwiesen, was auf das effiziente Auftreten der Neurogenese hindeutet. Immunfluoreszenz-Assays bestätigten ferner die Erzeugung von Neuronen, wobei der Anteil der β-Tubulin-III+-Zellen bis zu 67,75 ± 4,01 % bzw. 58,73 ± 7,25 % in A2lox- und 129-Derivaten auf D18 (Abbildung 4B) betrug.
Um es klarer zu machen, ist in Abbildung 5ein schematisches Diagramm der optimierten Methode für die embryonale Neurogenese dargestellt. Kurz gesagt, 1,5 x 106 mESCs werden in 10 ml Basaldifferenzierungsmedium I in eine nicht klebende Bakterienschale gesät und ermöglichen eine embryoide Körperbildung für 2 Tage. Dann werden embryoide Körper gesammelt und in die 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten mit der Konzentration von 50 embryoiden Körpern pro Brunnen gepflanzt. In der Zwischenzeit wird RA (1 M) für weitere 6 Tage hinzugefügt. Von Tag 8 bis Tag 18 wird RA entfernt, und N2B27 Medium II wird angewendet, um die nachfolgende Differenzierung von NPCs auf Neuronen zu lenken. Mit einer solchen kombinierten Methode können an Tag 18 robuste Neuronen gebildet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig01.jpg"> Abbildung 1: Diagramm des embryonalen Neurogeneseprozesses. Diese Zahl wurde von Li et al.10geändert. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61190/61190fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig02.jpg"> Abbildung 2: Die Morphologie der embryoiden Körper. (A) Embryoide Körper, die 4 Tage lang kultiviert wurden. (B) Embryoide Körper, die 2 Tage lang kultiviert wurden. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61190/61190fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig03.jpg"> Abbildung 3: Effizienzvergleich der 7 Protokolle zur Phase-I-Differenzierung mit A2lox und 129 mESCs. (A) Morphologische Analyse von A2lox- und 129 mESCs-Derivaten am 8. Tag. Oberteil: A2lox-Derivate; Untere Platte: 129 Derivate. (B) Immunfluoreszenznachweis zur Bildung von NPCs (Nestin+, grün). Die Kerne wurden blau mit DAPI beschriftet. Oberteil: A2lox-Derivate auf D8; Untere Platte: 129 Derivate auf D8. Prozentsätze der Nestin+-Zellen jeder Gruppe wurden durch Histogramm angezeigt. Jede Spalte stellt den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten dar±. *, p≤0.05; **, p≤0.01. Diese Zahl wurde von Li et al.10geändert. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61190/61190fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig04.jpg"> Abbildung 4: Effizienzvergleich der 3 Protokolle zur Phase-II-Differenzierung. (A) Morphologische Analyse von A2lox- und 129 mESCs-Derivaten am 18. Tag. Oberteil: A2lox-Derivate; Untere Platte: 129 Derivate. (B) Immunfluoreszenznachweis zur Bildung von Neuronen (β-Tubulin III+, rot). Die Kerne wurden blau mit DAPI beschriftet. Oberteil: A2lox-Derivate auf D18; Untere Platte: 129 Derivate auf D18. Prozentsätze der β-Tubulin III+ Zellen jeder Gruppe wurden durch Histogramm gezeigt. Jede Spalte stellt den Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten dar. *, p≤0.05; **, p≤0.01. Diese Zahl wurde von Li et al.10geändert. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61190/61190fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61190/61190fig05.jpg"> Abbildung 5: Kurzmodell der optimierten Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs in vitro Diese Zahl wurde von Lietal. 10geändert. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61190/61190fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Differenzierungsphase I (8d)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Protokolle</td>
			<td>Medien</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokoll 1</td>
			<td>Differenzierung natürlich: Mit Basaldifferenzierungsmedium I nur</td>
			<td rowspan="5">Basaldifferenzierungsmedium I: DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0,1 mM 2ME+ 1%P/S</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokoll 2</td>
			<td>4-tage Embryoide Körperbildung + 4-Tage-RA-Induktion</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokoll 3</td>
			<td>2-tage Embryoide Körperbildung + 6-Tage RA-Induktion</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokoll 4</td>
			<td>Monolayer-Kultur kombiniert mit RA-Induktion: 4d (-RA) 4d (+RA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokoll 5</td>
			<td>Monolayer-Kultur kombiniert mit RA-Induktion: 2d (-RA) 6d(+RA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokoll 6</td>
			<td>Embryoide Körperbildung (4 d) und Differenzierung induziert mit N2B27 medium II</td>
			<td rowspan="2">N2B27 mittel II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Neurobasales Medium + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0.1mM 2ME</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokoll 7</td>
			<td>Monolayer-Kultur mit N2B27 medium II</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Einzelheiten der 7 Protokolle, die bei der Differenzierung der Phase I verwendet werden. Diese Tabelle wurde von Li et al.10geändert.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Differenzierung Phase II (10d)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Protokolle</td>
			<td>Medien</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokoll 1</td>
			<td>Differenzierung natürlich: Mit Basaldifferenzierungsmedium I nur</td>
			<td>Basale Differenzierung smittel I: DMEM/F12 +15%FBS +1%NEAA +0.1mM 2ME+ 1%P/S</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokoll 2</td>
			<td>Differenzierung mit N2B27 medium I</td>
			<td>N2B27 mittel I: DMEM/F12 + 1%N2 + 2%B27 + 1%GlutaMAX +0.1mM 2ME</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokoll 3</td>
			<td>Differenzierung mit N2B27 medium II</td>
			<td>N2B27 mittel II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Neurobasales Medium + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0.1mM 2ME</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Einzelheiten der drei Protokolle, die bei der Differenzierung nach Phase II verwendet werden. Diese Tabelle wurde von Li et al.10geändert.

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Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Hier haben wir eine kostengünstige und einfach zu bedienende Methode etabliert, die eine schnelle und effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Neuronen leitet. Diese Methode eignet sich für die Popularisierung unter Laboratorien und kann ein nützliches Werkzeug für die neurologische Forschung sein.

Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Aufrufe.  Wuhan Center for Disease Control and Prevention. Hier haben wir eine kostengünstige und einfach zu bedienende Methode etabliert, die eine schnelle und effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Neuronen leitet. Diese Methode eignet sich für die Popularisierung unter Laboratorien und kann ein nützliches Werkzeug für die neurologische Forschung sein.

Serie: Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Differenzierung und Charakterisierung neuronaler Vorläufer und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Funktionale Bewertung der biologischen Neurotoxine in Networked Cultures für Stammzell abgeleitete Zentralnervensystem Neuronen

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Neurowissenschaften

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in kortikalen Interneuron Vorstufen

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Biologie

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

Eine Technik zur Erzeugung neuraler Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neurons

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video showcased a cell culture method for differentiating neural progenitor cells into neurons. By incubating cells in a nutrient-rich medium supplemented with growth factors, the progenitor cells matured into neurons with developed axons and dendrites. A stabilizing agent ensured cell viability and protected against oxidative damage throughout the differentiation process.