Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH (1R35GM133496-01) a Z. Gao. Nos gustaría agradecer al Dr. Ryan Hobbs por la asistencia en la sección. Agradecemos las instalaciones centrales de Penn State College of Medicine, incluidas las Ciencias del Genoma y la Bioinformática, las Imágenes Avanzadas de Microscopía de Luz y la Citometría de Flujo. También agradecemos a la Dra. Yuka Imamura por la asistencia en el análisis de ARN-seq.

1. Cultura mESC
<ol><li>Cubra una placa tratada con cultivo de tejidos de 10 cm con gelatina al 0,1% y deje que la gelatina se fije durante al menos 15-30 minutos antes de aspirarla.</li>
	<li>Semilla γ fibroblastos embrionarios de ratón irradiados (MEF) un día antes de cultivar las mESC en el medio mESC precalentado (medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco con suero fetal bovino (FBS) al 15%), aminoácidos no esenciales, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina, piruvato de sodio, LIF, PD0325901 (PD) y Chir99021 (CH)).</li>
	<li>Permita que los MEFs irradiados por γ se asienten y se adhieran a la superficie de la placa antes de cultivar las células E14.</li>
	<li>Descongele las ESC E14 en un baño de agua a 37 °C y transfiera rápidamente las células en un tubo cónico de 15 cm con medio mESC caliente. Peletizar las células a 200 x g durante 3 min y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células en 10 ml de medio mESC y colocar las células en la placa de cultivo que contiene los MEFs γ irradiados sembrados anteriormente. Incubar el cultivo celular en una incubadora de 37 °C bajo 5% de CO2.</li>
	<li>Para el pasaje de cultivo, aspire e el medio y lave la placa con 1x PBS estéril. Agregue suficiente tripsina al 0.05% para cubrir la superficie de la placa e incube a 37 ° C durante 3 min.</li>
	<li>Neutralizar la tripsina con medio mESC y pipeta para generar suspensión unicelular. Centrifugar las células a 200 x g durante 3 min y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Cuente las células con un hemocitómetro o contador celular y siembre aproximadamente 5.0 x 105 células en una placa de cultivo de 10 cm.</li>
	<li>Resuspend las células en 10 ml de medio mESC, placa las células en la placa de cultivo de tejido recubierta de gelatina e incuba cultivos como se describió anteriormente. NOTA: Se recomienda que las mESCs se pasen cada 2 días para evitar que las células se diferencien en sus colonias. El rojo fenol en el medio funciona únicamente como un indicador de pH y dependiendo de la densidad celular, puede volverse amarillento (más ácido), antes de 2 días. Por lo tanto, puede ser necesario cambiar el medio todos los días. Los MEF irradiados por γ eventualmente morirán después de un par de pasajes.</li>
</ol>2. EB, NPC y diferenciación neuronal
<ol><li>Realice el protocolo de paso de cultivo mencionado anteriormente y cuente las células (pasos 1.7-1.10).</li>
	<li>Método de caída colgante (día 0)<ol>
<li>Para una placa de cultivo celular de 10 cm, cuente aproximadamente 2.5 x 104 células donde 5.0 x 102 células se suspenderán en un medio de diferenciación de 20 μL (DMEM con 15% de FBS, aminoácidos no esenciales, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina / estreptomicina y piruvato de sodio). Aproximadamente cincuenta gotas de 20 μL que contienen las células se pueden enchapar en una placa de 10 cm.</li>
		<li>Alícuota el número apropiado de células, y luego centrifuga las células a 200 x g durante 3 min y retire el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender las células en el volumen apropiado del medio de diferenciación para una densidad celular de 5,0 x 102 células por 20 μL (por ejemplo, 2,5 x 104 células en 1 mL de medio de diferenciación).</li>
		<li>Usando una micropipeta o una pipeta repetidora, coloque gotas de 20 μL de la suspensión celular en la tapa de la placa de cultivo de tejidos. Asegúrese de que las gotas no estén demasiado cerca unas de otras para evitar que se fusionen. NOTA: Las gotas se pueden enchapar en una placa de fijación tratada con cultivo de tejidos o en una placa de suspensión, ya que se colocarán en la tapa y no en la placa en sí. Para un enfoque más factible y estéril, coloque las gotas en una placa de cultivo de tejido de fijación y transfiéralas a una placa de suspensión como se describe a continuación.</li>
		<li>Llene el plato con 5-10 ml de 1x PBS y vuelva a colocar cuidadosamente la tapa en el plato. Incubar el cultivo en la incubadora de 37 °C. NOTA: PbS se agrega a la placa de cultivo para evitar que las gotas se sequen.</li>
	</ol></li>
	<li>El día 2,use una micropipeta para recoger las gotas de la tapa y colóquelas en una placa de suspensión de cultivo celular de 10 cm llena de 10 ml de medio de diferenciación. Incubar el cultivo en un agitador orbital que tiembla a baja velocidad en la incubadora.</li>
	<li>El día 4,para cosechar los EB, recolectar las células, centrifugar a 200 x g durante 3 min y retirar el sobrenadante. NOTA: Los EB también se pueden lavar con 1x PBS según los requisitos de los experimentos posteriores.</li>
	<li>Para continuar el procedimiento e inducir la diferenciación EB en células progenitoras neurales (NPC), prepare el medio de diferenciación con ácido retinoico (AR) de 5 μM.</li>
	<li>Retire el medio viejo peletizando los EB a 100 x g durante 3 minutos o permita que los EB se asienten antes de aspirar el medio viejo. Añadir 10 ml del medio de diferenciación que contiene 5 μM de AR a la placa de cultivo.</li>
	<li>El día 6, reemplace al menos la mitad del medio con un medio fresco que contenga 5 μM ra inclinando la placa y canalizando el medio como se describió anteriormente. NOTA: Se recomienda que al menos la mitad del medio se reemplace con un medio fresco que contenga AR los días 5 y 7. Tome nota del indicador rojo fenol; si se vuelve amarillento, es mejor reemplazar todo el medio.</li>
	<li>El día 8,cosecha los NPC recolectando las células, centrifugando a 200 x g durante 3 min, y retirando el sobrenadante. NOTA: Los NPC también se pueden lavar con 1x PBS de acuerdo con las necesidades de los experimentos posteriores. Si es necesario, los NPC pueden congelarse y descongelarse nuevamente para su posterior cultivo y análisis. Si los NPC van a ser cultivados, la accutasa también se puede utilizar como una alternativa a la tripsina.</li>
	<li>Para continuar el procedimiento y diferenciar los NPC en neuronas, recoja los NPC en un tubo cónico de 15 ml por centrifugación, disocie con tripsina e incube a 37 °C durante 3 min. Pipetear los NPC para asegurarse de que todos los agregados de NPC estén disociados y neutralizar la tripsina con el medio.</li>
	<li>Filtrar las células con un colador de células de nylon de 40 μm y contar las células antes de enchaparlas a una densidad de 1,5 x10 5/cm2 en medio N2 (medio DMEM/F12 + 3 mg/ml de glucosa + 3 mg/ml de albúmina bovina rica en lípidos (LBSA) + suplemento de 1:100 N2 + 10 ng/mL de bFGF + 50 U/mL de pluma/estreptococo + 1 mM de L-glutamina) en una placa tratada con cultivo de tejidos para experimentos posteriores de PCR y western blot; o en una cámara de cultivo de tejidos para experimentos de inmunofluorescencia.</li>
	<li>El día 9,reemplace el medio antiguo por un medio N2 fresco.</li>
	<li>El día 10,cambie el medio N2 con medio N2 / B27 (50% DMEM / F12 y 50% basal neural, 3 mg / ml LBA, suplemento 1: 200 N2, suplemento 1: 100 B27, 50 U / ml pluma / estreptococo y 1 mM L-glutamina).</li>
	<li>En los días 11-12,cosecha las neuronas de la siguiente manera. Lave las células con 1x PBS, agregue tripsina e incube el cultivo en la incubadora de 37 °C durante 3 min antes de neutralizar la tripsina con medio y centrífuga a 200 x g durante 3 min.</li>
</ol>3. Caracterización de mESCs y células diferenciadas
<ol><li>Ensayo de fosfatasa alcalina (AP) 
	<ol>
<li>Use un kit para evaluar la actividad de la fosfatasa alcalina (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Retire el medio de la placa de cultivo y lave los ESC con 1x PBS.</li>
		<li>Agregue 1 ml de la solución fija (consiste en formaldehído y metanol) provisto con el kit a la placa e incube a temperatura ambiente durante 2-5 min. NOTA: La sobreincubación en la solución fix puede comprometer la actividad de AP.</li>
		<li>Retire la solución fija, lave los ESC con 1x PBS y deje cierta cantidad de PBS en la placa. NOTA: Mantenga los ESC húmedos en PBS para no comprometer la actividad de AP.</li>
		<li>Prepare la solución AP mezclando las soluciones de sustrato A, B y C en una proporción de 1:1:1. Mezcle primero las soluciones A y B e incube la mezcla a temperatura ambiente durante 2 minutos antes de agregar la solución C.</li>
		<li>Retire el PBS 1x y agregue la solución AP preparada anteriormente.</li>
		<li>Incubar los ESC durante unos 15 minutos en la oscuridad envolviendo la placa de cultivo con papel de aluminio o realizando el paso 3.5 en una habitación oscura.</li>
		<li>Controle la reacción y retire la solución de reacción cuando la solución se vuelva brillante para evitar manchas no específicas.</li>
		<li>Lave los ESC dos veces con 1x PBS.</li>
		<li>Evite que la muestra se seque cubriendo los ESC con 1x PBS o medio de montaje. NOTA: Aparecerá una mancha roja o púrpura para la expresión AP. La placa se puede almacenar en un refrigerador de 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>RT-qPCR 
	<ol>
<li>Recolecte células en varias etapas siguiendo los pasos 1.6–1.7 y 2.4 para ESC y EB y NPC, respectivamente.</li>
		<li>Aislar el ARN utilizando ARN, ADN y solución de extracción de proteínas (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Genere ADNc con un kit de transcriptasa inversa (consulte la Tabla de materiales)y siga el manual del fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Fijación e incrustación 
	<ol>
<li>Coseche los EB y los NPC como se describió anteriormente (paso 2.6) y corríjalos con una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% en 1x PBS durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire el PFA y lave la muestra con 1x PBS durante 5 min.</li>
		<li>Coloque la muestra en una dilución en serie de 1x soluciones de PBS, 10%-, 20%-, y 30%-sacarosa a 25\u201228 °C donde la muestra se transfiere a la siguiente solución después de 30 min de incubación. NOTA: La muestra se puede almacenar en la solución de sacarosa al 30% a 4 °C antes de continuar con el paso de incrustación.</li>
		<li>Humedezca la punta de la pipeta con solución de sacarosa antes de colocar la muestra (sin apilarla) en el centro del criomolde y pipetee el exceso de líquido. NOTA: El papel de filtro también se puede utilizar para eliminar el exceso de solución. Mojar la punta de la pipeta con solución de sacarosa es importante para evitar que los EB y los NPC se peguen a las paredes de la punta.</li>
		<li>Agregue cuidadosamente la solución de temperatura de corte óptima (OCT) al molde sin volver a suspender las muestras y elimine el exceso de burbujas con una pipeta.</li>
		<li>Coloque el molde con la muestra en un mezclador de laboratorio a baja velocidad para agitar ligeramente la muestra durante 15 minutos. Esto ayuda a asentar los EB y NPC al fondo si se vuelven a suspender en la solución oct.</li>
		<li>Congele rápidamente la muestra colocando el molde en nitrógeno líquido o sobre hielo seco. NOTA: Las muestras se pueden almacenar en un congelador de -70 °C antes de continuar con el siguiente paso.</li>
	</ol></li>
	<li>Crioseccionado 
	<ol>
<li>Ajuste el criostato para que se enfríe a -20 a -18 °C antes de transferir la muestra al instrumento.</li>
		<li>Separe el bloque de OCT congelado del molde y asegúrelo en el soporte con una pequeña solución de OCT colocada en la superficie del soporte.</li>
		<li>Alinee el bloque oct para que los EB y los NPC estén más cerca de la hoja para asegurarse de que la muestra no se pierda durante la sección.</li>
		<li>Separe cuidadosamente 10 μm del bloque y preste mucha atención a las rodajas que contienen la muestra.</li>
		<li>Coloque rápidamente la rebanada de OCT que contiene la muestra en el portaobjetos de vidrio que incrusta tejido y permita que las rebanadas de OCT se sequen al aire durante 1 h a temperatura ambiente. NOTA: Las muestras se pueden almacenar a -70 °C para su uso posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Inmunofluorescencia (IF) 
	<ol>
<li>Bloquee las secciones de OCT o las cámaras de cultivo que contienen neuronas en un 10% de suero de burro normal / 0.1% Triton X-100 en 1x PBS durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar las muestras en anticuerpo primario diluido en suero de burro normal al 5%/Tritón X-100 al 0,05% en 1x PBS durante la noche a 4 °C.</li>
		<li>Lave las muestras en 1x PBS/0.1% Triton X-100 tres veces durante 5 min cada lavado.</li>
		<li>Incubar las muestras con anticuerpos secundarios diluidos en suero de burro normal al 5%/Tritón X-100 al 0,05% en 1x PBS durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave las muestras en 1x PBS/0.1% Triton X-100 tres veces durante 5 min cada lavado y luego incube las muestras en 1 μg/mL DAPI.</li>
		<li>Monte las muestras con una funda y algún medio de montaje y deje que se seque.</li>
		<li>Observe las muestras bajo un microscopio de fluorescencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de ARN-seq 
	<ol>
<li>Recolecte las células en varias etapas y realice la extracción de ARN (ver paso 3.2).</li>
		<li>Preparar las bibliotecas de ADNc, realizar secuenciación profunda y análisis de datos según el protocolo descrito en Wang et al.8.</li>
		<li>Realice el análisis de Ontología Génica (GO) utilizando el paquete R, clusterProfiler.</li>
	</ol></li>
	<li>Citometría de flujo 
	<ol>
<li>Recolecte escasiadas siguiendo los pasos 1.6–1.7 y vuelva a suspender las células en medio. Recoge los EB y NPC siguiendo el paso 2.4 y vuelve a suspender las células en medio.</li>
		<li>Filtre la suspensión celular utilizando el colador de células de nylon de 40 μm en un nuevo tubo cónico de 15 ml.</li>
		<li>Mida la señal GFP de las muestras utilizando el citómetro de flujo (realizado por la instalación central de la institución).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer:+The+case+for+3D+bioprinting+neurons+to+create+patient-specific+epilepsy+models.">Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models.</a> Materials. 12 (19), (2019).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture.">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Joshi, P., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+imaging+(HCI)+on+miniaturized+three-dimensional+(3D)+cell+cultures.">High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures.</a> Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).</li></ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros en competencia.

El método para la diferenciación neuronal de las células madre embrionarias de ratón se ha establecido durante décadas y los investigadores han seguido modificando los protocolos anteriores o creando otros nuevos para diversos fines7,10,11. Utilizamos una serie de ensayos para analizar exhaustivamente la eficiencia y el progreso de las etapas de diferenciación de las mESCs a las neuronas, que pueden usarse en el análisis ...

Desde su primera derivación de la masa celular interna de los blastocistos de ratón en desarrollo1,2,las células madre embrionarias de ratón (mESC) se han utilizado como herramientas poderosas para estudiar la autorrenovación y diferenciación de las células madre3. Además, el estudio de la diferenciación mESC conduce a una tremenda comprensión de los mecanismos moleculares que pueden mejorar la eficiencia y la seguridad en la terapia basada en células madre en el tratamiento de enfermedades como los trastornos neurodegenerativos4. En comparación con los modelos animales, este sistema in vitro proporciona muchas ventajas, incluida la simplicidad en la práctica y la evaluación, el bajo costo en el mantenimiento de las líneas celulares en contraste con los animales y la relativa facilidad en las manipulaciones genéticas. Sin embargo, la eficiencia y la calidad de los tipos de células diferenciadas a menudo se ven afectadas por diferentes líneas de mESCs, así como por los métodos de diferenciación5,6. Además, los ensayos tradicionales para evaluar la eficiencia de la diferenciación se basan en el examen cualitativo de genes marcadores seleccionados que carecen de robustez y, por lo tanto, no logran comprender los cambios globales en la expresión génica.
Aquí pretendemos utilizar una batería de ensayos para la evaluación sistemática de la diferenciación neuronal. Utilizando tanto análisis tradicionales in vitro en marcadores seleccionados como ARN-seq, establecemos una plataforma para medir la eficiencia de diferenciación, así como los cambios transcriptómicos durante este proceso. Basándonos en un protocolo previamente establecido7,generamos cuerpos embrioides (EB) a través de la técnica de gota colgante, seguida de la inducción utilizando cantidad suprafisiológica de ácido retinoico (AR) para generar células progenitoras neurales (NPC), que posteriormente se diferenciaron a neuronas con medio de inducción neural. Para examinar la eficiencia de la diferenciación, además de los ensayos tradicionales de RT-qPCR e inmunofluorescencia (IF), se realizó citometría de flujo y ARN-seq. Estos análisis proporcionan una medición exhaustiva de la progresión de la diferenciación específica de la etapa.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X</td><td>Corning</td><td>25-052-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>Prepared in de-ionized water</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>Diluted in 1X PBS</td></tr><tr><td>40-&amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>Antibody was diluted at 1:500 for IF</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase Staining Kit II</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td></td></tr><tr><td>AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox</td><td>Azura Genomics</td><td>AZ-2105</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto</td><td>BD</td><td>657338</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>11123149001</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Chir99021</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>C298-500</td><td>Fisher Chemical</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EB buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>111000200</td><td>Pharmco</td><td>Diluted in de-ionized water</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S10250</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 Sequencing System</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>BDH1133-4LG</td><td>BDH VWR Analytical</td><td>Diluted in de-ionized water</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Collected from MEF supernatant</td></tr><tr><td>m18srRNA primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-GCAATTATTCCCCATGAACG-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3&#039;</td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>mNanog primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3&#039;</td></tr><tr><td>mNes primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3&#039;</td></tr><tr><td>mNeuroD1 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3&#039;</td></tr><tr><td>mOct4 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3&#039;</td></tr><tr><td>mPax6 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3&#039;</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Nestin primary antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>Antibody was diluted at 1:200 for IF</td></tr><tr><td>Neural basal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilament primary antibody</td><td>DSHB</td><td>2H3</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit</td><td>BioO Scientific</td><td>NOVA-5138-07</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13034</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Prepared in de-ionized water</td></tr><tr><td>- Potassium chloride</td><td>P217-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>- Potassium phosphate monobasic anhydrous</td><td>0781-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>- Sodium chloride</td><td>BP358-10</td><td>Fisher Bioreagents</td><td></td></tr><tr><td>- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate</td><td>SX0715-1</td><td>Milipore</td><td></td></tr><tr><td>Random hexamer primer</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Prepared in DMSO</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>84097</td><td>Diluted in 1X PBS</td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064022</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>TriPure Isolation Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11667165001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Rapid</td><td>Illumina</td><td>20020616</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP176-100</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiation and characterization of neural progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells

Describimos el procedimiento paso a paso para cultivar y diferenciar las células madre embrionarias de ratón en linajes neuronales, seguido de una serie de ensayos para caracterizar las células diferenciadas. Las células madre embrionarias de ratón E14 se utilizaron para formar cuerpos embrionarios a través del método de la gota colgante, y luego se indujeron a diferenciarse en células progenitoras neurales por ácido retinoico, y finalmente se diferenciaron en neuronas. Los experimentos cuantitativos de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-qPCR) e inmunofluorescencia revelaron que los progenitores neurales y las neuronas exhiben marcadores correspondientes (nestina para los progenitores neurales y neurofilamento para las neuronas) en los días 8 y 12 después de la diferenciación, respectivamente. Los experimentos de citometría de flujo en una línea E14 que expresan un informador de GFP impulsado por el promotor Sox1 mostraron que aproximadamente el 60% de las células en el día 8 son GFP positivas, lo que indica la diferenciación exitosa de las células progenitoras neurales en esta etapa. Finalmente, se utilizó el análisis RNA-seq para perfilar los cambios transcriptómicos globales. Estos métodos son útiles para analizar la participación de genes y vías específicas en la regulación de la transición de la identidad celular durante la diferenciación neuronal.

Como representación de nuestro método, realizamos un experimento de EB, NPC y diferenciación neuronal en células E14. Las células E14 se cultivaron en MEFs irradiados γ(Figura 1A)hasta que la población de MEF γ-irradiada se diluyó. Confirmamos la pluripotencia de las células E14 mediante la tinción de fosfatasa alcalina (AP)(Figura 1B)y posteriormente RT-qPCR (ver más abajo) para los marcadores Nanog y Oct4. Las células E14 libres ...

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Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Describimos el procedimiento para la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en células neuronales utilizando el método de la gota colgante. Además, realizamos un análisis fenotípico exhaustivo a través de RT-qPCR, inmunofluorescencia, ARN-seq y citometría de flujo.

Diferenciación y caracterización de progenitores neurales y neuronas a partir de células madre embrionarias de ratón

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

differentiation-characterization-neural-progenitors-neurons-from

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.8K vistas.  Penn State Hershey Cancer Institute. Describimos el procedimiento para la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en células neuronales utilizando el método de la gota colgante. Además, realizamos un análisis fenotípico exhaustivo a través de RT-qPCR, inmunofluorescencia, ARN-seq y citometría de flujo.

Video: Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en el suero libre de monocapa Cultura

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Diferenciación de células madre embrionarias de ratón en precursores corticales interneurona

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Neurociencias

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

La diferenciación eficiente de las células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Biología

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Aislamiento y cultivo de las células madre neurales embrionarias de ratón

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Generating Neural Progenitors from Mouse Embryonic Stem Cells by the Hanging Drop Method

Source: Hanafiah, A., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61446">Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video demonstrates the differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) to embryoid bodies (EBs) by the hanging drop method. Upon suspending the mESCs in hanging drops and incubating, the cells aggregate to form EBs, which are further differentiated into neuronal progenitor cells (NPCs) using a differentiation medium supplemented with retinoic acid (RA).

Generación de progenitores neurales a partir de células madre embrionarias de ratón mediante el método de la gota colgante

1. mESC culture

	Coat a 10 cm tissue-culture-treated plate with 0.1% gelatin and allow the gelatin to set for at least 15&#8211;30 min before aspirating ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Neural Progenitors

Source: Jeon, K. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60571">Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates the differentiation of human embryonic stem cells, or hESCs, directly into neural progenitor cells without using feeder cells or any intermediate steps. The selective inhibition of bone morphogenetic protein or BMP and transforming growth factor-beta, or TGF-&#946;, signaling pathways leads to hESCs differentiation into neural progenitor cells, or NPCs.

Diferenciación de células madre embrionarias humanas en progenitores neurales

1. Preparation of human embryonic stem cells (hESC)-qualified Basement Membrane Matrix-coated Plates

	Slowly thaw the hESC-qualified basement membrane ...

Advanced Neuronal Models

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

Una técnica para generar células progenitoras neurales a partir de células madre embrionarias de ratón

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...

Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neurons

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video showcased a cell culture method for differentiating neural progenitor cells into neurons. By incubating cells in a nutrient-rich medium supplemented with growth factors, the progenitor cells matured into neurons with developed axons and dendrites. A stabilizing agent ensured cell viability and protected against oxidative damage throughout the differentiation process.