Los autores desean agradecer a Andy Poczobutt y Dr. Jori Leszczynski por su valiosa ayuda y ediciones a este manuscrito.  Apoyado por subvenciones recibidas desde el corazón nacional, pulmón y Blood Institute (NHLBI to1 HL078929, PPG HL014985 y HL095439 RO3) y el Departamento de Veterans Affairs (de mérito).

Se siguieron todas las directrices internacionales, nacionales o institucionales aplicables para el uso y cuidado de animales (ratones) en los experimentos descritos en este manuscrito.
Este método utiliza ratones adultos FVBN, edad 16-20 semanas, encontrado para ser óptimo para los fines de este estudio. Día 1 incluye pasos 1-5 y el día 2 incluye los pasos 6-7 (figura 1).
1. preparación de equipo
<ol><li>Garantizar un suministro adecuado de jeringas estériles, desechables y agujas, si ketamina/xilacina se utiliza como anestésico (como se recomienda). Si isoflurano se utiliza como anestésico, verifique el tanque de oxígeno y el nivel de líquido de isoflurano para asegurarse de que hay un suministro adecuado para el experimento antes de comenzar. Además, montar la nariz respiración circuitos y fije a la caja de la inducción; Coloque latas de carbón nuevo a los circuitos de respiración. Preparar el cuadro de inducción activando el oxígeno y comprobar que la segunda etapa Lee aproximadamente 50 psi.</li>
	<li>Encienda el cojín de calentamiento a 37 ° C.</li>
	<li>Preparar la sonda de temperatura rectal para la cirugía.</li>
</ol>2. ratón preparación
Este paso incluye anestesia, depilación y posicionamiento (adultos FVBN ratones-edad 16-20 semanas).
<ol><li>Pesan los ratones y registrar los pesos.</li>
	<li>Anestesiar los ratones.<ol>
<li>Administrar ketamina y xilacina IP (80-100 mg/kg y 7.5-16 mg/kg, respectivamente). Sin embargo, se recomienda comenzar con dosis bajas de ketamina y xilacina (alrededor de 30 mg/kg y 6 mg/kg, respectivamente).</li>
		<li>Mantener la anestesia con aproximadamente 0,1 - 0,25 veces inicial de dosis de ketamina/xilacina a lo largo de la cirugía. Ketamina y xilacina eran el agente anestésico de elección en este estudio en particular, como se observaron más reproducibilidad y capacidad de supervivencia. El agente anestésico de elección en otros estudios se puede encontrar a ser diferente.  Si se utiliza isoflurano, ponga el ratón en una cámara de inducción y encienda isoflurano al 5% hasta que el ratón pierde el sentido completo. Luego use una nariz nasal de isoflurane 1.5-2.5% en el resto del procedimiento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controlar los ratones cada 2-3 min por pellizco del dedo del pie para verificar la adecuada profundidad de la anestesia.</li>
	<li>Afeite la zona ventral del cuello del ratón.</li>
	<li>Coloque el ratón en una posición supina en la almohadilla de precalentado. Asegure las patas y los pies del ratón a la superficie quirúrgica con cinta.</li>
	<li>Coloque el ungüento de lágrima artificial en los ojos para evitar que se sequen durante la cirugía.</li>
</ol>3. quirúrgicos detalles
<ol><li>Realice una incisión de 1 cm en el cuello ventral derecho sobre la vena yugular.</li>
	<li>Aplicar una o dos gotas de lidocaína (1-2%) en el área de incisión para el tratamiento del dolor y promover la vasodilatación. Esperar 2 minutos para lidocaína surta efecto.</li>
	<li>Denunciar y aislar la vena yugular interna derecha por disección Roma. Atar la vena con la sutura 4-0 y retraer con suavidad el extremo rostral de la nave con una pinza hemostática. Orificio, con unas tijeras finas, unos 3 mm inferior o caudal a la corbata, aproximadamente a la mitad el diámetro de la vena.</li>
	<li>Un catéter de polivinilo PV-1 1,5 cm desde el extremo de la marca introduzca en la vena yugular a través del orificio usando un dilatador de vasos y el catéter hacia el extremo caudal de la nave, aproximadamente 1,5 cm del hilo de rosca.</li>
	<li>Atar el catéter firmemente dentro de la parte caudal de la embarcación (por debajo de la cut), con seda 4-0. Ate la parte rostral de la embarcación hacia el exterior de la sonda con los extremos sueltos de la sutura que se utiliza para atar la vena yugular rostral, en el paso 3.3.</li>
	<li>Virada la piel libremente de nuevo juntos alrededor del catéter con seda 4-0 para ayudar a prevenir pérdida de calor corporal y la desecación de los tejidos.</li>
	<li>Conectar el catéter a una jeringa con solución salina heparinizada (10 U/mL) y enjuague el catéter.</li>
</ol>4. inyecciones
<ol><li>Inyecte la solución de azul de Evans (50 μL de una solución de 30 mg/mL en solución salina normal, unheparinized 0.9%, o aproximadamente 50 mg/kg) en el catéter de la vena yugular, seguido de un pequeño volumen de solución salina heparinizada para purgar la línea.</li>
	<li>2 minutos más tarde, inyectar sustancia P (100 μL de una solución 0,3 μM en 0,9% solución salina normal, unheparinized o 1 nmol/kg), seguida de un pequeño volumen de solución salina heparinizada para purgar la línea. Sustancia P aumenta la extravasación de proteínas plasmáticas a través de la capa endotelial; en este protocolo, habitualmente induce un aumento de los valores de extravasación de plasma de aproximadamente 1.5-fold, cual plasma extravasación más fácil de medir.</li>
	<li>Esperar 18 minutos después de inyectar la sustancia P. Durante este tiempo, el tinte de azul de Evans se equilibre y circular.</li>
	<li>Terminar el experimento 18 minutos después de la inyección de sustancia P (20 min después de la inyección de azul de Evans) sacrificando el ratón con la dislocación cervical. Es probable que el ratón puede ser directamente cervical dislocada, sin primero dar una sobredosis de anestésico, como el ratón es probablemente todavía bien anestesiado de la cirugía. Sin embargo, si es necesario, una sobredosis de anestésicos ketamina/xilacina, isoflurano o pentobarbital puede ser dado, seguido por dislocación cervical.</li>
</ol>5. aislamiento de órganos
<ol><li>Abrir la cavidad torácica del ratón y gravedad-perfusión (desde una altura de unos 51 cm o 20") el corazón y los vasos sanguíneos con 50 mL de citrato de sodio 50 mM, pH 3.5. pH 3,5 probablemente conserva a encuadernación azul de Evans a la albúmina.</li>
	<li>Suprimir los órganos relevantes 1-5 (tejidos) con un bisturí de disección (e.g. vejiga urinaria, riñón, estómago, hígado, páncreas, proximal o distal colon, íleon, duodeno, piel del flanco, orejas, cola, corazón y/o los pulmones) y quitar cualquier contenido residual, si presente.</li>
	<li>Enjuague los órganos en temperatura ambiente (RT) con tampón fosfato salino (PBS; 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, 8.0 g de NaCl y 0,20 g de KCl en 1 L, pH 7,4).</li>
	<li>Seque los órganos con tejido, corte cada órgano por la mitad y pesan cada mitad (mojado pesos, en g).</li>
	<li>Seque uno mitad del tejido en un horno de secado a 150 ° C, en florete, durante 48 h.</li>
	<li>Coloque los otros tejidos del tubo la mitad en un volumen constante (200 μL) de formamida en una microcentrífuga durante 48 h (y hasta 72 h) para extraer el azul de Evans.</li>
</ol>6. medición del tejido OD
<ol><li>Saque 50 μl de formamida infundido de azul de Evans (después de la incubación de 48-72 h RT) el tubo de microcentrífuga y el lugar en un pozo de una placa de poliestireno de 96 pocillos. Tenga cuidado de no transferir piezas de tejido junto con la formamida.</li>
	<li>Depositar 50 μl de formamida nueva, pura en cada uno de los dos pozos vacíos de la placa de 96 pocillos para los espacios en blanco.</li>
	<li>Mida y registre la OD620 de cada pocillo de la placa de 96 pocillos en un lector de absorbancia. 620 nm es la absorbancia máxima de azul de Evans.</li>
</ol>7. cálculo de la extravasación de Plasma
<ol><li>Pesa el tejido seco mitad que ha estado en el horno durante 48 h.</li>
	<li>Calcular la proporción de peso seco/peso húmedo para el órgano específico de interés de cada ratón individual, comenzando con el peso húmedo de este tejido medio (obtenido en paso 5.4), dividido por el peso seco de este mismo tejido medio (obtenido en paso 7.1).</li>
	<li>Calcular el peso seco (en gramos) de tejido medio en formamida al dividir el peso mojado del tejido antes de que la mitad se colocó en formamida (obtenido en el paso 5.4) por la humedad: proporción de peso seco para el órgano específico de interés (calculado en el paso 7.2).</li>
	<li>Calcular los valores corregidos de620 OD. A partir de la OD620 valor de cada bien experimental de la placa de 96 pocillos (contiene formamida infundido de azul de Evans de cada tejido, obtenido en el paso 6.3), reste el espacio en blanco bien OD620 valor (la media OD620 de los dos pozos que contienen formamida puro, preparado en el paso 6.2, OD a620 los valores obtenidos en el paso 6.3) de cada valor experimental.</li>
	<li>Calcular el valor de extravasación de plasma por la corregida OD620 (calculado en paso 7.4) dividiendo el peso seco del tejido mitad en formamida (calculado en paso 7.3). Las unidades de la extravasación de plasma será OD620/g peso seco.</li>
	<li>Analizar los datos y expresar como la media ± SEM. estadísticamente comparar grupos por prueba t o análisis unidireccional de varianza y prueba de comparación múltiple de Scheffé (lycofs01.lycoming.edu), según corresponda.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Como hemos comentado anteriormente, el estudio de la extravasación de plasma en última instancia puede llevar a nuevos conocimientos sobre las causas de o nuevas maneras de inhibir o tratar la extravasación de plasma. El uso acertado del Protocolo de extravasación de plasma (arriba), utilizando medio de contraste azul de Evans, se ha demostrado en el manuscrito actual. Aunque los datos se muestra de nuevo la hipótesis de que la NEP puede proteger la vasculatura contra la extravasación de plasma, este es un objetivo secundario en la actualidad, con el objetivo principal es presentar un protocolo optimizado que puede usarse fácilmente en el laboratorio promedio para el estudio de la extravasación de plasma. El protocolo reportado en el presente documento se centra en la adaptabilidad a futuros estudios con objetivos diferentes, animales, órganos y otras condiciones, es especialmente útil debido a que este protocolo es fácil de usar, confiable, económico y tiene en cuenta el general disponibilidad de materiales comunes, reactivos y personal capacitado. Cabe señalar, sin embargo, que este protocolo requiere una gran cantidad de repeticiones por grupo de animales (8-12 repeticiones sugeridos) para obtener resultados estadísticamente válidos.
Ha habido numerosos estudios e informes que detallan los intentos para medir la permeabilidad vascular y extravasación de plasma. Por el momento, la mayoría de estos informes detalla permutaciones de los métodos utilizados junto con el método del colorante azul de Evans para investigar la extravasación de plasma y de la permeabilidad vascular2,3,6,11, 12,13. Ha habido pocos informes de métodos de permeabilidad vascular que no incorporan a Evans blue en todos3,13,15,24; Estos métodos son en general menos accesible para el promedio de laboratorio, que requiere métodos complicados, equipo especializado y personal y son generalmente caros.
El desarrollo del Protocolo de azul de Evans por encima implicó la prueba de muchos diferentes permutaciones y modificaciones. Experimentos tempranos se centraron en los intentos de inyectar a través de la vena de la cola de ratón azul de Evans. Sin embargo, la cola vena inyecciones resultadas técnicamente desafiante y dio lugar a resultados inconsistentes, lo que requeriría la inclusión de las inyecciones de la vena yugular y terminal técnicas quirúrgicas descritas. Muchos experimentos preliminares fueron también hecho tratando de encontrar las concentraciones adecuadas de Evans blue y sustancia p. La cantidad exacta de azul de Evans no fue encontrada para ser imprescindible, como es por debajo de 200 mg/kg (en comparación con 50 mg/kg utilizado en la actualidad), pero la cantidad de sustancia P utilizada en estos experimentos era importante. Después de mucha experimentación, 1 nmole/kg se encontró que la concentración ideal de exógeno agregada sustancia P, dando como resulta un aumento de 1.5-fold de (y así más fácilmente medible) valores de extravasación de plasma. También, se encontró que un tiempo adecuado debe ser para que el azul de Evans se equilibren (> 10 min). Perfusión de los vasos sanguíneos para eliminar a exceso Evans blue, después del sacrificio del ratón, pero antes de aislamiento de órgano, fue encontrada para ser un componente esencial del presente Protocolo, a diferencia de otros protocolos que no incluyen este paso de perfusión4. La solución (entregada por un gradiente suave gravedad) es de 50 mL de una solución de pH 3,5 (que fomenta la Unión del azul de Evans y albúmina); paraformaldehido, frecuente en muchos otros Evans protocolos azul6,10,25, se omite en el presente Protocolo. Otro factor que ha sido resuelta en este protocolo es que el tinte usado en chow de doxiciclina interfiere con la medición de nm OD620 de azul de Evans en los tejidos de la vía alimentaria. Así, fue necesario utilizar chow doxiciclina sin teñir en los experimentos anteriores. También, un hallazgo importante y útil es que casi cualquier órgano del ratón satisfactoriamente es aislado y examinado mediante el presente Protocolo.

Fuga vascular en los órganos se refiere a extravasación o salida de plasma sanguíneo a través de brechas en el endotelio de post vénulas capilares en los órganos. Esta extravasación de plasma o el aumento de la permeabilidad vascular, que puede surgir de algún tipo de respuesta inflamatoria, puede tener graves consecuencias. Por lo tanto, es importante que este fenómeno, sus causas, moduladores y consecuencias, están estudiadas y entendidas, y además, que los investigadores tienen buenas herramientas y protocolos con los que estudiar. Las brechas endoteliales pueden ser producidas a través de una serie de estímulos, pero generalmente se producen por la acción de neurotransmisores péptido o taquicininas en el endothelia. Uno de los principales mediadores naturales de este proceso, que resulta en extravasación de plasma mayor, es el undecapeptide taquiquinina neuropéptido sustancia P1.
Métodos para investigar y medir la permeabilidad vascular o extravasación de plasma, que utilizan la propiedad de unión a albúmina del colorante azul de Evans, se han desarrollado y generalmente son conocidos por su precisión, sencillez, economía, seguridad y capacidad de permitir que el determinación de la extravasación de plasma de varios tejidos a la vez, si es así deseado2,3,4,5,6,7,8,9 . Este protocolo de azul de Evans para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN utiliza todos estos, pero añade algunas modificaciones importantes que lo hacen generalmente útil y adaptable para estudios futuros, el laboratorio promedio lleva a cabo o que llevar a cabo importantes estudios de factores asociados a la extravasación de plasma o en la permeabilidad vascular. En este protocolo, sustancia P es introducida a los ratones a 1 nmol/kg, lo que aumenta la extravasación de plasma por 1.5. Esto aumenta la sensibilidad del Protocolo, dando por resultado más fácilmente observables y obtener resultados. Otros factores que afectan a la permeabilidad, como varios otros péptidos, productos químicos o algunas formas de lesión tóxica, pueden ser utilizados o estudiados por otros laboratorios, como se desee. En este protocolo para introducir el azul de Evans y sustancia P sistémica, que requiere cirugía terminal se utilizan inyecciones de vena yugular. Sin embargo, las inyecciones de vena yugular5,7,10, incluso después de la consideración de las necesarias técnicas quirúrgicas terminal, son fáciles de dominar y conducir a la producción de resultados más consistentes que otra las inyecciones venosas, incluyendo cola vena inyecciones4,9. Aunque es posible de azul de Evans ser entregados por las inyecciones del seno venoso orbital retro, no hay referencias en la literatura han encontrado que utilizar este método de entrega de azul de Evans. Sin embargo, en cuanto a las inyecciones de vena de la cola, el alto grado de conocimientos y práctica reproducible dominar esta técnica muy limita su uso para inyección de azul de Evans exitosa. En contraste, el método de inyección de la vena yugular alternativos como se describe en nuestro protocolo, ofrece una solución técnicamente obtenible. Un procedimiento crucial para la perfusión de las venas del ratón, realizado justo después del sacrificio del ratón de perfusión de azul de Evans, elimina el exceso de tinte de azul de Evans y se ha estandarizado en el presente Protocolo. Métodos anteriormente descritos de perfusión han sido cuidadosamente examinados y modificado para conocer el presente procedimiento. Otras modificaciones que se describen aquí son todo optimizado, simple y de bajo costo.
Existen algunas limitaciones importantes del método de colorante azul de Evans. Por ejemplo, baja sensibilidad a veces asociado con este método puede prevenir algunos adicional examen macroscópico patológico e histológico de los tejidos de los animales de inyección de azul de Evans. Sin embargo, estas y otras limitaciones han llevado al desarrollo de métodos alternativos y modelos que, sin embargo, todavía utilizan el azul de Evans. La medición de azul de Evans por fluorescencia (en lugar de alcance visual) espectroscopia puede aumentar la sensibilidad del método. Además, microscopía de fluorescencia de los tejidos teñidos de azul de Evans fue desarrollado para permitir la observación de fuga vascular en más distintas ubicaciones11. Además, todo el cuerpo la proyección de imagen y escaneo de un animal vivo previamente inyectaron con Evans azul12 permite la investigación de las concentraciones de azul de Evans en una manera continua, en lugar de en uno elegido tiempo punto específico del experimento. Sin embargo, este método requiere la disponibilidad de instalaciones adecuadas de imagen y puede ser muy costoso. Modificaciones que Evans blue y realizada en un tipo de in vitro del modelo, como en una celda de cultura o chick corioalantoideas modelo13 (CAM) también se han descrito. Estos modelos son monitoreados por fluorescencia y microscopia intravital14 y permiten la cuantificación de cambios en la permeabilidad vascular con el tiempo, pero pueden plantear preguntas sobre modelado preciso de condiciones en vivo y también puede caro.
Ha habido otros métodos desarrollados para determinar y cuantificar fuga vascular o permeabilidad, que implica la administración de azul de Evans. Estos métodos pueden emplear una adecuada molécula fluorescente (como la albúmina o fluoresceína) o una molécula etiquetada isotópicamente etiquetada o no, a los animales vivos (o para la célula cultura o corioalantoideas (CAM) modelos13, seguido de no invasivo proyección de imagen (PET-TAC, resonancia magnética, microscopía intravital, escaneo de cuerpo entero) o por proyección de imagen invasivas (microscopia fluorescente)3,12,15. Aunque estas técnicas pueden ofrecer a una serie de ventajas sobre otros Evans métodos azul, también tienen desventajas, que pueden incluir su considerable complejidad, conocimientos necesarios, recursos y altos costos monetarios.
Neprilysin16 (la peptidasa enzima NEP, también conocido como CD10, MME o Enkephalinase) se ha sugerido para ser implicados en la inhibición de extravasación de plasma, al menos en parte, a través del metabolismo enzimático y la inactivación de sustancias endógenas Así, en los tejidos en que ocurre la peptidasa superficie celular NEP, puede haber una atenuación del efecto de la sustancia P, probablemente por la actividad de la peptidasa de NEP.
Al principio, probamos para la extravasación de plasma inducido por la sustancia P utilizando este protocolo modificado de Evans blue, con FVBN tipo salvaje (WT) y ratones knockout (KO) de NEP. Participación de la NEP en extravasación de plasma aumentada de sustancia P fue sospechada de estos estudios iniciales, y describimos a estos y otros experimentos papel de NEP participación en extravasación de plasma. Sin embargo, el foco de este manuscrito no es NEP o su papel en la extravasación de plasma, pero más bien la extravasación de plasma experimentos ellos mismos. Los resultados de la NEP son representante de la clase de resultados que pueden obtenerse mediante el uso de este protocolo modificado. El método de azul de Evans para medir la extravasación de plasma ha sido optimizado y modificado, como se describe en detalle a continuación para los ratones FVBN.

<table><tbody><tr><td>isoflurane</td><td>Vet One</td><td>200-070</td><td>inhaled anesthetic</td></tr><tr><td>ketamine</td><td>Vet One</td><td>200-055</td><td>injectable anesthetic</td></tr><tr><td>xylazine</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td>injectable anesthetic</td></tr><tr><td>syringes (10,3 &amp;amp; 1 cc)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604, 309657, 309659</td><td></td></tr><tr><td>needles (20G1,23G1 &amp;amp; 26G1/2)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305178, 305193, 305111</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane induction chamber</td><td>VetEquip</td><td>941443</td><td>1 Liter</td></tr><tr><td>nosecone breathing circuits&amp;nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>RC2</td><td>Rodent Circuit Controller 2</td></tr><tr><td>oxygen tank</td><td>Airgas</td><td>UN 1072</td><td>100% medical</td></tr><tr><td>heating pad</td><td>CWE Inc.</td><td>TC-1000</td><td>temperature controller</td></tr><tr><td>rectal temperature probe</td><td>CWE Inc.</td><td>10-09012</td><td>mouse</td></tr><tr><td>balance (for rodents)</td><td>Ohaus</td><td>CS 2000</td><td></td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>15000-00</td><td>Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11151-10</td><td>Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)</td></tr><tr><td>surgical tools-hemostats</td><td>Fine Science tools</td><td>13009-12</td><td>Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)</td></tr><tr><td>surgical tools -suture drivers</td><td>Fine Science tools</td><td>12502-12</td><td>Olsen-Hegar suture drivers (suturing)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11627-12</td><td>Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)</td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14110-15</td><td>Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>18025-10</td><td>suture tying forceps (used for Millar cath)</td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14078-10</td><td>Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11254-20</td><td>Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)</td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14082-09</td><td>Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11051-10</td><td>10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11251-35</td><td>Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)</td></tr><tr><td>surgical tools-retractors</td><td>Fine Science tools</td><td>17012-11</td><td>Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11294-00</td><td>Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11297-00</td><td>Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)</td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14058-11</td><td>tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11009-13</td><td>serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)</td></tr><tr><td>surgical tools-hemostats</td><td>Fine Science tools</td><td>13003-10</td><td>Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11006-12</td><td>Adson serrated forceps (tissue grasping)</td></tr><tr><td>clippers</td><td>Oster</td><td>A5</td><td></td></tr><tr><td>tape</td><td>Fisherbrand</td><td>159015G</td><td></td></tr><tr><td>artificial tear ointment</td><td>Akorn Inc</td><td>13985-600-03</td><td></td></tr><tr><td>lidocaine</td><td>Hospira</td><td>0409-4277-01</td><td>2% injectable</td></tr><tr><td>polyvinyl catheters</td><td>Tygon</td><td>PV-1</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Substance P</td><td>Bachem&amp;nbsp;</td><td>H-1890</td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25201-400-10</td><td>1000 U/ml</td></tr><tr><td>saline solution</td><td>Hospira</td><td>0409-7138-09</td><td>0.9% sodium chloride</td></tr><tr><td>phenobarbital&amp;nbsp;</td><td>Vortech</td><td>0298-9373-68</td><td></td></tr><tr><td>sodium citrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-50TAB&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes for blotting</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47670</td><td></td></tr><tr><td>microbalance</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>microfuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-534</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene 96 well plate</td><td>Becton Dickenson</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>absorbance plate reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>polyacrylamide gels</td><td>Bio-Rad</td><td>3450014&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>protein molecular weight standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Protran supported nitrocellulose</td><td>Amersham (GE)</td><td>10600015</td><td></td></tr><tr><td>gel box</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-1379</td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>primary NEP polyclonal antibody&amp;nbsp;</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>AF1182</td><td></td></tr><tr><td>doxycycline chow</td><td>Teklad (HARLAN)</td><td>TD.130750&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FVB/NJ wild type mice</td><td>Jackson</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>secondary antibody (goat anti-rabbit)</td><td>ZyMed</td><td>81-6120</td><td></td></tr><tr><td>ECL solution-Western Lightening Plus</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>film</td><td>Pierce</td><td>34091</td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse

Fuga vascular y extravasación de plasma, tiene un número de causas y puede ser una grave consecuencia o síntoma de una respuesta inflamatoria. Este estudio en última instancia puede conducir a nuevos conocimientos sobre las causas de o nuevas maneras de inhibir o tratar la extravasación de plasma. Es importante que los investigadores tienen las herramientas adecuadas, incluyendo los mejores métodos disponibles para el estudio de la extravasación de plasma. En este artículo, se describe un protocolo, utilizando el método de colorante azul de Evans, para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN. Este protocolo es intencionadamente simple, a tan grande un grado de lo posible, pero proporciona datos de alta calidad. Colorante azul de Evans ha sido elegido principalmente porque es fácil para el laboratorio de media utilizar. Hemos utilizado este protocolo para proporcionar evidencia y apoyo a la hipótesis de que la neprilysin de enzima puede proteger la vasculatura contra la extravasación de plasma. Sin embargo, este protocolo puede usar experimentalmente y fácilmente adaptado para el uso en otras cepas de ratones o en otras especies, en muchos diversos órganos o tejidos para estudios que pueden involucrar otros factores que son importantes para entender, prevenir o tratar la extravasación de plasma. Este protocolo ha sido ampliamente optimizado y modificado de los protocolos existentes y combina fiabilidad, facilidad de uso, economía y disponibilidad general de materiales y equipos, hacer superior para el laboratorio de media utilizar en el presente Protocolo cuantificación de la extravasación de plasma de órganos.

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An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

En este artículo, se describe un protocolo simple, económico y optimizado que utiliza el método de colorante azul de Evans para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN que pueden ser adaptados para su uso en otras cepas, especies y otros órganos o tejidos.

Un optimizado Evans azul protocolo para evaluar la fuga Vascular en el ratón

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

an-optimized-evans-blue-protocol-to-assess-vascular-leak-in-the-mouse

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

26.4K vistas.  University of Colorado Denver. En este artículo, se describe un protocolo simple, económico y optimizado que utiliza el método de colorante azul de Evans para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN que pueden ser adaptados para su uso en otras cepas, especies y otros órganos o tejidos.

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Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Modelo de rata de ruptura de la barrera sangre-cerebro para permitir dirigida Therapeutics neurovascular

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Investigación

Medicina

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Ensayo de prueba de permeabilidad Vasos Sanguíneos

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

Medición anafilaxia local en ratones

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Inmunología e Infección

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Utilizando adeno-asociado virus como una herramienta para estudiar las barreras de retina en la enfermedad

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

La inducción de la lesión por isquemia-reperfusión en la piel de la oreja del ratón para intravital n fotones de imágenes de la respuesta inmune

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke involves middle cerebral artery occlusion (MCAO). Infarct zone, brain edema and blood-brain barrier (BBB) breakdown are measured as parameters that reflect the extent of brain injury after MCAO. A significant limitation to this method is that these measurements are normally obtained in different rat brain samples, leading to ethical and financial burdens due to the large number of rats that need to be euthanized for an appropriate sample size. Here we present a method to accurately assess brain injury following MCAO by measuring infarct zone, brain edema and BBB permeability in the same set of rat brains. This novel technique provides a more efficient way to evaluate the pathophysiology of stroke.

This protocol describes a novel technique of measuring the three most important parameters of ischemic brain injury on the same set of rodent brain samples. Using only one brain sample is highly advantageous in terms of ethical and economic costs.

Medición del edema cerebral post-accidente cerebrovascular, zona infarta y descomposición de la barrera hematoencefálica en un solo conjunto de muestras cerebrales de roedores

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

Neurociencias

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

In vivo Lecturas de lesiones vasculares en la retina del ratón para promover la reproducibilidad

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

<meta charset="utf8"></head><body>Ensayo de fluorescencia para evaluar la permeabilidad de una barrera endotelial microvascular cardíaca en un modelo de isquemia/reperfusión en ratas

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Ensayo de fluorescencia para evaluar la permeabilidad de una barrera endotelial microvascular cardíaca en un modelo de isquemia/reperfusión en ratas

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby the permeability of the endothelium to blood cells, plasma macromolecules, and water can be adapted according to the physiological need. In certain diseases, cytokines and growth factors are released that target the endothelial barrier to transiently increase vascular permeability; however, their prolonged presence may cause chronic vascular hyperpermeability and thereby tissue-damaging edema. The Miles assay is an in vivo technique that allows researchers to study vascular hyperpermeability through the proxy measurement of vascular leakage. Here, we provide a detailed protocol on how to perform this procedure in the mouse, which is the most widely used model organism to study mammalian physiology and pathology. The procedure involves the intravenous injection of Evans blue dye to label the circulating albumin followed by multiple intradermal injections of permeability-inducing agents and vehicle control solutions into opposing flanks of the mouse. Consequently, Evans blue dye gradually leaks into the dermis, where it accumulates and can be extracted for quantification as leakage induced by the permeability-inducing agent relative to the vehicle. The Miles assay can be performed in wild type or genetically modified mouse models and may be combined with drug administration to study molecular mechanisms that regulate vascular permeability and identify agents/targets capable of inducing or blocking hyperpermeability.

Here, we present a protocol to measure the vascular leakage induced by intradermal administration of permeability promoting agents into the murine skin. This technique can be used to determine the ability of molecules to promote or inhibit vascular leakage or to study the molecular mechanisms that regulate vascular permeability.

Evaluación de agentes inductores de la hiperpermeabilidad Vascular en la piel con el ensayo de millas

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

Un optimizado Evans azul protocolo para evaluar la fuga Vascular en el ratón

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Ensayo de fluorescencia para evaluar la permeabilidad de una barrera endotelial microvascular cardíaca en un modelo de isquemia/reperfusión en ratas

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