The authors would like to acknowledge Dr. Ellen M. Fox for her work regarding this model of local anaphylaxis. This work was supported by the Uniformed Services University of the Health Sciences grant number R073UE.

1. Ratones Sensibilizar <ol><li> Preparar una solución madre de OVA mediante la dilución de OVA en PBS 1X a una concentración final de 20 mg / ml. Congele por alícuotas en crioviales y almacenar a -80 ° C para su uso futuro. </li><li> Traiga una o más alícuotas de 20 mg / ml OVA de stock a temperatura ambiente. Diluir OVA en PBS 1X a una concentración final de 1 mg / ml en un tubo de poliestireno de 5 ml de fondo redondo con una tapa. Vortex brevemente para mezclar. </li><li> Mientras sostiene el tubo de poliestireno que contiene el 1 mg / ml de OVA en un vórtice a velocidad media, añadir un volumen igual de bien homogeneizada Imject alumbre (40 mg / ml) gota a gota mientras se continúa vórtice del tubo para producir una proporción de 1: 1 de alumbre para inmunógeno. </li><li> Coloque el tapón de tubo de tubo y cinta para vórtice. Gire vórtice en posición más baja y deje OVA para adsorber al alumbre durante 30 min. <ol><li> No permita que una gran cantidad de tiempo que pase entre la preparación de OVA / Alum y sensibilizar a los ratones. Si sensibilización no se puede completar directamente después de OVA / Alum preparation, almacenar OVA / Alum a temperatura ambiente. Vortex durante 1 min antes de usar. </li></ol></li><li> Cargue una jeringa de insulina de 1 ml con mezcla de OVA / Alum. Tape la jeringa con aguja de calibre 27. </li><li> Inyectar 100 l de OVA / Alum en el peritoneo de ratones BALB / c para una dosis por ratón de 50 g de OVA y 2 mg de Alum. </li><li> Para un control negativo, sensibilizar a otro grupo de ratones a PBS. Preparar una mezcla 1: 1 de alumbre y PBS de la misma manera como se indica anteriormente, la omisión de OVA. </li><li> Sensibilizar a todos los ratones de control (OVA y PBS) una vez por semana durante 3 semanas para un total de 3 inyecciones. Después de la inyección final, espere por lo menos 2 semanas antes de realizar el ensayo de anafilaxis local. </li></ol> 2. Ensayo anafilaxia local <ol><li> Traiga OVA solución madre a temperatura ambiente. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, diluir 20 mg / ml de OVA de stock a una concentración final de 5 mg / ml con PBS (dilución 1: 4 de OVA en PBS 1X). Vortex brevemente para mezclar. </li><li> Anestesiar a los ratones utilizando RC 2 &lt;/ Sup&gt; Roedores Sistema de Anestesia (o sistema de entrega vaporizado comparable). Llene el depósito con isoflurano, y encienda el O 2 del flujo de aire. Coloque los ratones en cámara de inducción y ajustar dial de control de isoflurano al 5% para iniciar la anestesia. Una vez que los ratones se anestesiaron completamente, se indica por la falta de movilidad, ajuste dial de control de isoflurano al 3% para mantener la anestesia profunda. El propósito de la anestesia en este procedimiento es para inmovilizar el animal. Las inyecciones de la oreja y la cola de la vena no causan dolor significativo o trastornos a los animales. NOTA: El isoflurano puede tener efectos negativos sobre el sistema reproductivo humano. Asegúrese de utilizar en una habitación bien ventilada y adjuntar un bote de barrido a la cámara de inducción para neutralizar los gases residuales. Si usted está embarazada mientras está usando isoflurano, use una máscara de filtro de carbono para minimizar la exposición. </li><li> Cargar 10 l de 5 mg / ml de OVA en una jeringa de insulina 3/10 cc tapado con una aguja 31 G. Cargar otra jeringa de insulina 3/10 cc con 10 lPBS 1x. </li><li> Usando un microscopio de disección, inyectar 10 l de OVA en el oído derecho de un ratón anestesiado para una dosis de prueba de 50 g de OVA. Otros dosis, como 20 mg, también son aceptables. <ol><li> Para estabilizar el oído para inyección, envuélvalo con cinta scotch (parte adhesiva hacia arriba) en torno a un tubo cónico de 15 ml. Asegure el lado dorsal de la oreja derecha a la cinta. Inserte el lado bisel de la aguja entre las dos hojas de la oreja. Inyecte lentamente OVA en el centro del tejido de la oreja, con cuidado de no golpear a cualquier vaso sanguíneo. </li></ol></li><li> Usando el mismo método descrito anteriormente, se inyectan 10 l de PBS en la oreja izquierda como control negativo. </li><li> Espere 3 min. <ol><li> Durante este tiempo, coloque el ratón en un retenedor y sostenga la cola bajo una lámpara de calor o en un baño de agua tibia durante 1 min para dilatar los vasos sanguíneos. </li></ol></li><li> Usando una jeringa de 1 ml de insulina tapado con una aguja de 27 G, inyectar lentamente 200 l de 0,5% de colorante azul de Evans en la cola vein del ratón. Se administra por inyección rápida puede destruir la estructura de los vasos antes de la totalidad de los 200 l. Si esto ocurre, intente inyectar el volumen restante del medio de contraste en la vena en el lado opuesto de la cola. </li><li> Espere 10 min. </li><li> La eutanasia el ratón y quite los dos oídos utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas. <ol><li> Agarrar los bordes de la oreja con fórceps, asegurándose de que no se aplica presión al sitio de inyección en el centro de la oreja. Quite la mayor cantidad de tejido del oído como sea posible mediante la reducción de cerca, pero no a través de la cordillera de cartílago presentes en la base de la oreja. Pequeñas cantidades de la piel pueden estar presentes en el oído extirpado; esto no afectará el ensayo. </li></ol></li><li> Alícuota de 700 l de formamida en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Preparar un tubo por el oído (dos tubos por ratón). NOTA: La formamida es teratogénico, mutagénico, y un irritante. Usar guantes, protección para los ojos y la cara. Las mujeres embarazadas deben tener cuidado al manipular unas formamida puede ser fetotóxica. </li><li> Añadir oídos para formamida, tapar los tubos, y se incuba durante la noche en un baño de calor seco ajustado a 63 ° C. Orejas todavía pueden aparecer ligeramente azul después de la incubación; sin embargo la mayoría del colorante se extrajo en la formamida. </li><li> Añadir 300 l de cada muestra, por duplicado, a una placa de 96 pocillos. Evitar la transferencia de la piel, si está presente en la muestra. Asegúrese de que no hay burbujas presentes en los pozos, ya que afectarán a la lectura de absorbencia. </li><li> Añadir 300 l de formamida, por duplicado, a la placa de 96 pocillos. Estos pozos se utilizarán como espacios en blanco. </li><li> Utilice un espectrofotómetro para medir la absorbancia a 620 nm. Pozos de formamida Restar de cada lectura de la muestra. NOTA: Todos los experimentos se realizaron bajo los protocolos aprobados por el Comité Institucional Cuidado de Animales y el empleo de los Servicios Uniformados Universidad. </li></ol>

<ol>
	<li>Kojima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+and+Bbasophils+are+selectively+activated+in+vitro+and+in+vivo+through+CD200R3+in+an+IgE-independent+manner.">Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner.</a> The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).</li><li>Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+enzymes+in+mast+cell+granules+and+their+potential+role+in+allergic+rhinitis.">Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis.</a> Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).</li><li>Amin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mast+cells+in+allergic+inflammation.">The role of mast cells in allergic inflammation.</a> Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).</li><li>Nakaya, M., Takeuchi, N., Kondo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+histamine+receptor+subtypes+in+human+inferior+turbinates.">Immunohistochemical localization of histamine receptor subtypes in human inferior turbinates.</a> Annals of Otology, Rhinology &amp; Laryngology. 113 (7), 552-557 (2004).</li><li>Ramsdell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Trypan+Blue+to+demonstrate+the+immediate+skin+reaction+in+rabbits+and+guinea+pigs.">The use of Trypan Blue to demonstrate the immediate skin reaction in rabbits and guinea pigs.</a> The Journal of Immunology. 15 (4), 305-311 (1928).</li><li>Chase, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+sensitization+of+animals+with+simple+chemical+compounds:+X.+Antibodies+inducing+immediate-type+skin+reactions.">Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds: X. Antibodies inducing immediate-type skin reactions.</a> The Journal of Experimental Medicine. 86 (6), 489-514 (1947).</li><li>Goose, J., Blair, A. M. J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+cutaneous+anaphylaxis+in+the+rat,+induced+with+two+homologous+reagin-like+antibodies+and+its+specific+inhibition+with+disodium+cromoglycate.">Passive cutaneous anaphylaxis in the rat, induced with two homologous reagin-like antibodies and its specific inhibition with disodium cromoglycate.</a> Immunology. 16, 749-760 (1969).</li><li>Ovary, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+cutaneous+anaphylaxis+in+the+mouse.">Passive cutaneous anaphylaxis in the mouse.</a> The Journal of Immunology. 81 (4), 355-357 (1958).</li><li>Ovary, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+reactions+in+the+skin+of+experimental+animals+provoked+by+antibody-antigen+interactoin.">Immediate reactions in the skin of experimental animals provoked by antibody-antigen interactoin.</a> Progress in Allergy. 5, 459-508 (1958).</li><li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitiative+evaluation+of+passive+cutaneous+anaphylaxis+(PCA)+using+a+hand-held+spectrophotometer.">Quantitiative evaluation of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using a hand-held spectrophotometer.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 19 (8), 1112-1114 (1996).</li><li>Teshima, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+spectrophotometric+analysis+of+passive+and+active+ear+cutaneous+anaphylaxis+in+the+mouse.">Simple spectrophotometric analysis of passive and active ear cutaneous anaphylaxis in the mouse.</a> Toxicology Letters. 95 (2), 109-115 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Numerosos marcadores de la enfermedad alérgica se utilizan para evaluar la solidez de las respuestas alérgicas tras la exposición de alérgenos, incluyendo cambios en los niveles de histamina circulantes, la producción de citocinas Th2, y el reclutamiento de células en el líquido broncoalveolar en el ajuste de la impugnación de las vías respiratorias. Mientras seguimiento de los cambios en estos parámetros es importante para el estudio de las reacciones alérgicas, marcadores biológicos no siempre se correlacionan con la enfermedad alérgica clínica. El ensayo de anafilaxis locales descrito en este protocolo proporciona una medición reproducible de la permeabilidad vascular localizada como un correlato de la enfermedad alérgica localizada. Mediante el uso de colorante azul de extravasación, este protocolo permite tanto la visualización y cuantificación relativa de una reacción alérgica localizada. En contraste con los ensayos de alergia que se basan en la puntuación clínica, el resultado primario de este ensayo (tinte extravasación azul medido por absorbancia espectrofotométrica) no está fácilmente sujeto a sesgo del observador. Otra Advantage es que los animales son sacrificados poco después de la exposición, lo que limita las molestias potencialmente causada por la exposición al alérgeno y la administración del colorante. El uso alternativo de un espectrofotómetro de mano descrito por Akiyama et al. 10 permite la medición continua de cambios en la permeabilidad vascular. Sin embargo, colorante azul de Evans es tóxico, y la inyección en última instancia conducir a los animales que necesitan ser sacrificados. Mientras que este ensayo tiene una serie de fortalezas, tiene la limitación de ser un poco un desafío técnico. Fiabilidad de los resultados depende de inyecciones consistentes y exitosos del oído y de la vena de la cola. Si la dosis entera reto no se administra en el oído, si los resultados de inyección de oído en la punción obvia de un vaso sanguíneo, o si la inyección intravenosa azul de Evans no está completo, el animal deben excluirse del análisis. En nuestro laboratorio, los investigadores han tenido que practicar las inyecciones intradérmicas de oído para several semanas antes de desarrollar la competencia. Además, es importante para ejecutar controles apropiados para el ensayo. Específicamente, la inyección de PBS rutinariamente se debe utilizar como un control interno, como animales parecen responder de forma ligeramente diferente a los daños causados ​​por la inserción de la aguja. La lectura PBS da una medida de línea de base para los cambios en la permeabilidad vascular inducida por la propia inyección. En lugar de utilizar inyecciones intradérmicas de oído, el ensayo también se puede aplicar a la piel de la espalda de los ratones. Los investigadores pueden encontrar esta ruta sea menos difícil técnicamente, y, además, permite la prueba de antígenos múltiples simultáneamente. El ensayo de la anafilaxia local es extremadamente versátil, ya que la dosis de desafío se puede manipular dependiendo del experimento. Si es necesario observar los cambios en las respuestas alérgicas, puede ser beneficioso usar una dosis más baja OVA desafío, tal como 20 g. Esto permite un aumento de la sensibilidad en el monitoreo de los cambios en la absorción, comoque será menos probable que se alcance el punto de saturación para la activación de las células. Además, este ensayo puede ser usado para estudiar la anafilaxis cutánea pasiva (PCA). En esta configuración, la IgE específica de antígeno se inyecta en una oreja y vehículo a la otra. 24 horas más tarde, el animal se da una exposición intravenosa de antígeno y colorante azul de Evans. El modelo PCA puede reducir el tiempo que se necesita para completar el experimento, el número de animales utilizados, y permitir a los investigadores a examinar los efectos específicos de IgE entrecruzamiento. A pesar de tomar más tiempo para llevar a cabo, hay algunas ventajas de utilizar el modelo activo anafilaxia cutánea (ACA) se describe en este documento. Sensibilización a través de la exposición semanal al antígeno imita el proceso por el cual los individuos desarrollan la enfermedad alérgica, como la sensibilización suele ser sistémica y la gente en general tienen tanto alérgeno-específicas de IgE e IgG en la circulación. Mientras IgE reticulación es el principal medio de mala desgranulación de células st, los mastocitos también responden a IgG reticulación. Por lo tanto, el modelo ACA permite a los investigadores estudiar los mecanismos de respuestas alérgicas, además de la enfermedad sólo mediada por IgE. En conclusión, mientras que el método de la sensibilización utilizado es a discreción del investigador, el ensayo de la anafilaxia local es versátil y se puede utilizar con una variedad de metodologías de sensibilización. Hinchazón del oído, un marcador comúnmente utilizado para evaluar las respuestas alérgicas, también se puede medir después del desafío OVA. Hemos encontrado que los oídos desafiados con OVA tienen significativamente más hinchazón de los oídos desafiados con PBS a 1 hr después de la inyección. En contraste con la prueba de azul de Evans, hemos observado que las mediciones de grosor de la oreja son menos sensibles que la extravasación de colorante y muestran una mayor variabilidad entre los investigadores como grosor de la oreja puede ser alterado por la compresión de la oreja cuando se utilizan dispositivos de medición. Ratón cepas que no seaBALB / c se puede utilizar para el ensayo de la anafilaxia local; Sin embargo las lecturas de absorbancia variarán ligeramente en función de la cepa utilizada. Debido a su propensión a desarrollar fuertes respuestas de Th2, los ratones BALB / c generalmente producen lecturas fiables, reproducibles con este ensayo. Este ensayo permite la cuantificación de las respuestas alérgicas localizadas en los animales sensibilizados a una variedad de antígenos. La selección de antígeno es flexible, ya que el ensayo se ha realizado con éxito con los alergenos comunes, tales como OVA y hemocianina de lapa californiana (KLH). Además, en lugar de la sensibilización, una reacción alérgica local se puede provocar en un animal mediante la inyección de anticuerpos ingenua de que los receptores de reticulación de IgE o de IgE sobre basófilos y mastocitos, o por ligación de receptores de activación no IgE en estas células, tales como CD200R3 1 .

Hipersensibilidad de tipo I está mediada por reticulación inducida por el antígeno de la IgE en la superficie de mastocitos y basófilos. Esto da como resultado la desgranulación celular y la liberación de mediadores vasoactivos y proinflamatorios tales como histamina, triptasa, y factor activador de plaquetas 2. Después de la liberación de mediadores preformados durante la degranulación de los mastocitos sintetizan y liberan prostaglandinas y leucotrienos, que aumentan aún más la permeabilidad vascular 3. La respuesta clínica inicial se produce rápidamente y se conoce como una &quot;reacción inmediata&quot;. En la piel, una respuesta de roncha y eritema es fácilmente visible a pocos minutos de la exposición al antígeno. Dependiendo de la dosis del desafío, es posible observar una &quot;respuesta de fase tardía&quot; unos pocos horas más tarde. Hinchazón de fase tardía se debe a edema localizado y el reclutamiento de leucocitos en los tejidos 2. La histamina, generalmente considerado como el principal mediador de participar enrespuestas alérgicas inmediatas, actúa sobre los receptores de histamina 1 (HR1) expresó en los buques y los receptores de histamina 2 (HR2) expresado en el músculo liso. El efecto combinado aumenta el flujo sanguíneo y la permeabilidad vascular en el sitio de la inflamación 4. Una variedad de modelos animales de la alergia se han desarrollado con el fin de estudiar los mecanismos implicados en la inflamación alérgica, incluyendo modelos de asma alérgica, anafilaxis sistémica y anafilaxia locales. La administración del colorante por vía intravenosa se ​​ha utilizado para medir las respuestas alérgicas localizadas en modelos animales durante casi un siglo, con publicaciones que describe esta técnica que se remonta a la década de 1920 5. Los conejos y conejillos de Indias fueron los primeros modelos animales utilizados para probar las reacciones de hipersensibilidad inmediatas, y las respuestas más sensibles se encuentran generalmente en el oído 5,6. El ensayo fue posteriormente validada para su uso en ratas y ratones 7 8. Históricamente, losuna variedad de métodos experimentales se han utilizado, incluyendo la inyección del antígeno antes de la inyección de colorante, la inyección de colorante antes de la inyección del antígeno, y la inyección simultánea de tinte y antígeno. La administración del colorante por vía intravenosa como un medio para la medición de las respuestas alérgicas es un ensayo versátil ya que puede ser utilizado para medir activo, pasivo, y revertir reacciones pasivas 5,9. Numerosos colorantes se han utilizado para evaluar las respuestas alérgicas, incluyendo azul de tripano, pontamina cielo azul, azul de Evans, Geigy Azul 536, y tinta de la India 5,6,9. Una solución de 0,5% azul de Evans es actualmente el colorante estándar utilizado para medir las respuestas alérgicas en la piel. La respuesta anafiláctica a desafío es transitoria; intensidad máxima se alcanza de 10 - 15 min de la inyección de colorante, y no hay reacción es visible si tinte se administra más de 30 min después de la exposición, independientemente de las especies animales utilizadas 9. La cuantificación de la extravasación de colorante era originalLY obtiene midiendo el tamaño de la roncha como se indica por el colorante azul 7-9. Además, los recuentos de mastocitos desgranulados se pueden cuantificar mediante la escisión de tejido de la piel en el sitio de la reacción y la tinción con azul de toluidina 7. Degranulación de los mastocitos se utiliza a menudo como un marcador para cutánea, las respuestas alérgicas mediadas por IgE, como mastocitos son la principal población celular local que expresa el receptor de IgE de alta afinidad Fc RI. Se desarrollaron técnicas espectrofotométricas para la medición de la extravasación de colorante en el tejido de la anafilaxia cutánea pasiva (PCA) en la rata y el ratón 10 11 en los años 1990. El siguiente protocolo de ensayo de la anafilaxia local fue adaptado de Kojima et al. 1, y utiliza la ovoalbúmina de huevo de pollo (OVA) como antígeno para provocar respuestas alérgicas. Sin embargo, los antígenos distintos de OVA se pueden usar si se desea. El ensayo se utiliza colorante azul de Evans para monitorear cambios en permeabilit vasculary que se producen debido a mastocitos IgE entrecruzamiento y la liberación de histamina.

<table><tbody><tr><td>BALB/c Mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>651</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Quality Biologic</td><td>114-058-101</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>Sigma</td><td>A5503-10G</td><td></td></tr><tr><td>Imject Alum</td><td>Thermo Scientific</td><td>77161</td><td>Mix thoroughly before use</td></tr><tr><td>Evans Blue Dye</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>295876</td><td>99%+ Spectrophotometric grade</td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-474-06</td><td></td></tr><tr><td>1cc Insulin syringes</td><td>BD</td><td>329654</td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle</td><td>Terumo</td><td>NDC 100861</td><td></td></tr><tr><td>27 G Needles</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>F.S.T.</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>F.S.T.</td><td>14070-12</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene round-bottom tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge tubes</td><td>Medical Supply Partners</td><td>15-1151</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottom 96 well plate</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Rodent Anesthesia System</td><td>VetEquip</td><td>922100</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Model G560 with 3 inch platform</td></tr></tbody></table>

measuring local anaphylaxis in mice

Las respuestas alérgicas son el resultado de la activación de los mastocitos y basófilos y la posterior liberación de mediadores vasoactivos y proinflamatorios. La exposición a un alérgeno en un individuo sensibilizado puede dar lugar a síntomas clínicos que varían desde leves hasta anafilaxia eritema que amenazan la vida. En el laboratorio, se han desarrollado diversos modelos animales para comprender los mecanismos que impulsan respuestas alérgicas. En este documento, se describe un método detallado para medir los cambios en la permeabilidad vascular para cuantificar las respuestas alérgicas localizadas. El ensayo de la anafilaxia local fue reportado por primera vez en la década de 1920, y ha sido adaptada de la técnica publicada por Kojima et al. en 2007 1. En este ensayo, los ratones sensibilizados a OVA son desafiados en el oído izquierdo con vehículo y en la oreja derecha con OVA. Esto es seguido por una inyección intravenosa de colorante azul de Evans. Diez minutos después de la inyección de azul de Evans, el animal es sacrificado y el tinte que se ha extravasado enpara los oídos se extrae durante la noche en formamida. La absorbancia del colorante extraído se cuantificó luego con un espectrofotómetro. Este método da con fiabilidad una manifestación visual y cuantificable de una respuesta alérgica local.

Los animales que han sido sometidos a la prueba con éxito tendrán la piel y los ojos que aparecen de color azul. PBS animales sensibilizados no deben reaccionar a PBS o desafío OVA, por lo tanto ambos oídos deben permanecer blanco (Figura 1A). En los animales sensibilizados OVA, el oído recibir el desafío PBS (izquierda) debe ser completamente blanco o ligeramente azul en forma localizada en el sitio de inyección. El oído recibir el desafío OVA (derecha) debe convertirse en progresivamente más oscuro azul durante 10 min después de la administración del colorante (Figura 1B). PBS animales sensibilizados tendrán lecturas de absorbancia insignificantes, tanto para el PBS y el desafío OVA (Figura 2A). Para los animales sensibilizados OVA, inyección de PBS generalmente resulta en una lectura de la absorbancia media de 0,13 y una desviación estándar de 0,04. Por el contrario, unos 50 mg OVA resultados de desafío en una lectura de la absorbancia media de 0,58 y una desviación estándar de 0,18 (Figura 2B). La cantidad de OVA utilizado para el desafío se puede ajustar para los experimentos individuales si es necesario. Por ejemplo, un reto OVA 20 mg resulta en una absorbancia media de 0,30 y una desviación estándar de 0,10 (Figura 2C), sin embargo, un reto menos de 20 g pueden no dar resultados fiables. Los cambios en la concentración de OVA deben ser optimizados y validados antes de su uso. Los resultados pueden ser emparejados gráficamente, con PBS absorbancia en comparación con OVA absorbancia. Alternativamente, los resultados pueden ser graficados como un valor único, con la absorbancia PBS resta de la absorbancia OVA para cada animal individual. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52005/52005fig1highres.jpg" /> Figura 1: pigmentación del oído en los animales PBS y OVA sensibilizado. (A). La pigmentación del oído en PBS sensibilizado animales. La oreja izquierda (desafiado con PBS) y la oreja derecha (desafiados con 50 g OVA) muestran poca o ninguna extravasación de colorante. (B). Pigmentación de la oreja en los animales sensibilizados OVA. No hay respuesta alérgica en el oído izquierdo (desafiado con PBS), como se indica por la ausencia de colorante azul de extravasación. La oreja derecha (desafiados con 50 g OVA) muestra una coloración azul brillante indicativo de aumento de la permeabilidad vascular, un resultado directo de la activación de células en el tejido de la oreja. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52005/52005fig2highres.jpg" /> Figura 2: valores de DO representativos para animales sensibilizados OVA valores de DO obtenidos de mediciones espectrofotométricas tomadas a 620 nm (A)... 50 g desafío OVA en PBS animales sensibilizados. Valores de DO para tanto desafío PBS y OVA son insignificantes. (B). 50 mg OVA desafío en los animales sensibilizados OVA. Resultados de desafío de PBS en los valores de DO &lt;0,2 y OVA desafío results en valores de DO&gt; 0,3. (C). 20 mg OVA desafío. Resultados de desafío de PBS en los valores de DO &lt;0,2. Las orejas derechas han reducido ligeramente los valores de DO debido a una menor dosis de desafío de OVA utilizado.

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Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Las respuestas alérgicas, caracterizados por la activación de los mastocitos y basófilos, están impulsados ​​por la reticulación de IgE y liberación de mediadores proinflamatorios. Una evaluación cuantitativa de las respuestas alérgicas se puede lograr mediante el uso de colorante azul de Evans para monitorear los cambios en la permeabilidad vascular después de la provocación con alergeno.

Medición anafilaxia local en ratones

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.2K vistas.  Uniformed Services University of the Health Sciences.  Las respuestas alérgicas, caracterizados por la activación de los mastocitos y basófilos, están impulsados ​​por la reticulación de IgE y liberación de mediadores proinflamatorios. Una evaluación cuantitativa de las respuestas alérgicas se puede lograr mediante el uso de colorante azul de Evans para monitorear los cambios en la permeabilidad vascular después de la provocación con alergeno. 

Video: Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

Modelo murino de asma inducida por alergenos

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

One desirable endpoint of general anesthesia is the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is less straightforward than it is in human patients. A widely used behavioral surrogate for hypnosis in rodents is the loss of righting reflex (LORR), or the point at which the animal no longer responds to their innate instinct to avoid the vulnerability of dorsal recumbency. We have developed a system to assess LORR in 24 mice simultaneously while carefully controlling for potential confounds, including temperature fluctuations and varying gas flows. These chambers permit reliable assessment of anesthetic sensitivity as measured by latency to return of the righting reflex (RORR) following a fixed anesthetic exposure. Alternatively, using stepwise increases (or decreases) in anesthetic concentration, the chambers also enable determination of a population's sensitivity to induction (or emergence) as measured by EC50 and Hill slope. Finally, the controlled environmental chambers described here can be adapted for a variety of alternative uses, including inhaled delivery of other drugs, toxicology studies, and simultaneous real-time monitoring of vital signs.

Loss of the righting reflex has long served as a standard behavioral surrogate for unconsciousness, also called hypnosis, in laboratory animals. Alterations in volatile anesthetic sensitivity caused by pharmacological interventions can be detected with a carefully controlled high-throughput assessment system, which may be adapted for delivery of any inhaled therapeutic.

La evaluación de cambios en la volátil Anestésico general La sensibilidad de los ratones después de la intervención farmacológica local o sistémica

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

Medicina

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain perception in rodents. Withdrawal thresholds can be measured first at baseline and then following drug, venom, injury, allergen,&#160;or otherwise evoked inflammation by applying an accurate force on very specific areas of the skin. An electronic von Frey apparatus allows precise assessment of mouse hind paw withdrawal thresholds that are not limited by the available filament sizes in contrast to classical von Frey measurements. The ease and rapidity of measurements allow for incorporation of assessment of tactile sensitivity outcomes in diverse models of rapid-onset inflammatory and neuropathic pain as multiple measurements can be taken within a short time period. Experimental measurements for individual rodent subjects can be internally controlled against individual baseline responses and exclusion criteria easily established to standardize baseline responses within and across experimental groups. Thus, measurements using an electronic von Frey apparatus represent a useful modification of the well-established classical von Frey filament-based assays for rodent mechanical allodynia that may also be applied to other nonhuman mammalian models.

Electronic von Frey measurements are an effective and improved alternative to classical von Frey filaments, as they allow rapid and precise measurement of changes in rodent mechanical withdrawal thresholds to continuously applied pressure stimuli before and after an inflammatory event.

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

Neurociencias

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

A reversible, método no invasivo para las mediciones de resistencia de las vías y Toma de Muestras Líquido del Lavado broncoalveolar en ratones

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Biología

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for vaccination as well as understand how pathogenic antibody responses develop in allergies and autoimmune disease. Generating robust antigen-specific antibody responses is not always trivial. In mouse models, it often requires multiple rounds of immunizations with adjuvant that leads to a great deal of variability in the levels of induced antibodies. One example is in mouse models of peanut allergies where more robust and reproducible models that minimize mouse numbers and the use of adjuvant would be beneficial. Presented here is a highly reproducible mouse model of peanut allergy anaphylaxis. This new model relies on two key factors: (1) antigen-specific splenocytes are adoptively transferred from a peanut-sensitized mouse into a na&#239;ve recipient mouse, normalizing the number of antigen-specific memory B- and T-cells across a large number of mice; and (2) recipient mice are subsequently boosted with a strong multivalent immunogen in the form of liposomal nanoparticles displaying the major peanut allergen (Ara h 2). The major advantage of this model is its reproducibility, which ultimately lowers the number of animals used in each study, while minimizing the number of animals receiving multiple injections of adjuvant. The modular assembly of these immunogenic liposomes provides relatively facile adaptability to other allergic or autoimmune models that involve pathogenic antibodies.

Described is the preparation of antigenic liposomal nanoparticles and their use in stimulating B-cell activation in vitro and in vivo. Consistent and robust antibody responses led to the development of a new peanut allergy model. The protocol for generating antigenic liposomes can be extended to different antigens and immunization models.

Liposomas antigénicos para la generación de anticuerpos específicos de la enfermedad

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature readings is common, and they have been proven to be accurate and invaluable in this regard. However, this method of temperature measurement requires the mice to be anesthetized in order to insert the probe without injury to the animal. This limits the ability to observe other phenotypes of the mouse simultaneously. In order to investigate other phenotypes while measuring temperatures, rectal probes are not ideal, and another method is desired. Here, we introduce a noninvasive method of temperature measurement that foregoes the requirement for mouse anesthesia while maintaining equal reliability to rectal probes in measuring body temperature. We use an infrared thermometer that detects body surface temperatures at ranges between 2 and 150 mm. This method of body temperature measurement is successful in reliably replicating temperature change trends during passive system anaphylaxis experiments in mice. We show that body surface temperatures are about 2.0 &#176;C lower than rectal probe measurements, but the degree of temperature drop follows the same trend. Furthermore, we use the same technique to observe mice in a food allergy model to evaluate temperature and activity levels simultaneously.

Here we present a new method to accurately measure body temperature differences in passive systemic anaphylaxis (PSA) and food allergy mouse models using an infrared thermometer. This procedure has been accurately duplicated in previous PSA results.

Medición de la temperatura del cuerpo de ratón con termómetro infrarrojo pasiva Anafilaxia sistémica y evaluación de la alergia alimentaria

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

Cheek Injection Model for Simultaneous Measurement of Pain and Itch-related Behaviors

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts are typically counted to evaluate itch induced by pruritogens. However, previous reports have shown that algesic substances also induce scratching behaviors in a mouse neck injection model, which is the most common test used for scratching behaviors. This finding makes it difficult to study itch in mice. &#160;In contrast, capsaicin, a common algogen, reduced scratching behaviors in some neck injection experiments. Therefore, the effect of pain on scratching behaviors remains unclear. It is thus necessary to develop a method to concurrently investigate itch and pain sensation using behavioral tests. Here, a cheek injection model is introduced which can be used to simultaneously measure pain- and itch-related behaviors. In this model, pruritogens induce scratching behaviors while algesic substances induce wiping behaviors. Using this model, lysophosphatidic acid (LPA), an itch mediator found in cholestatic patients with itch, is shown to exclusively induce itch but not pain. However, in mouse models, LPA has been reported to be both a pruritogen and an algogen. Investigation into the effects of LPA in a mouse cheek injection model showed that LPA only induced scratching, but not wiping behaviors. This indicates that LPA acts as a pruritogen similarly in mice and humans, and demonstrates the utility of a cheek injection model for itch research.

Typically, the mouse neck injection model is used for evaluate pruritogen-induced scratch behaviors. However, the model provides information only on itch, not pain. Here, a cheek injection model is introduced in mice which can be used to simultaneously measure pain and itch-related behaviors.

Modelo de inyección de mejillas para la medición simultánea del dolor y los comportamientos relacionados con la picazón

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts ...

Analysis of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor-Producing T Helper Cells in a Mouse Model of Contact Hypersensitivity

Parallel to traditional Th1/Th2/Th17/Treg lineages, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper (Th-GM) cells have been identified as a distinct subset of T helper cells (GM-CSF+ IFN-&#947;- IL-17A- IL-22- effector CD4+ T cells) in human and mice. Contact hypersensitivity (CHS) is considered an excellent animal model for allergic contact dermatitis (ACD) in human, manifesting an intact T cell-mediated immune response. To provide a standardized and comprehensive assay to analyze the Th-GM cell subset in the T cell-dependent immune response in vivo, a murine CHS model was induced by sensitization/challenge with a reactive, low-molecular-weight, organic hapten, 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB). The Th-GM subset in effector CD4+ T cells generated upon immunization with the hapten was analyzed by flow cytometry. We found that Th-GM was mainly expanded in lesions and draining lymph nodes in the DNFB-induced CHS mouse model. This method can be applied to further study the biology of Th-GM cells and pharmacological research of therapeutic strategies centered on GM-CSF in various conditions, such as ACD.

Here, we present a simple and standardized method of analyzing the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper subset in vivo.

Parallel to traditional Th1/Th2/Th17/Treg lineages, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper (Th-GM) cells have been identified ...

Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis

Contact hypersensitivity (CHS) is an experimental model of allergic contact dermatitis (ACD) that can be studied in mice. This study aims to present an objective laboratory method that may help to study the CHS reaction in mice, which can be measured and quantified by various tests. To induce CHS, on day "0", mice were sensitized on a previously shaved spot by abdominal skin painting with the hapten 2,4,6-trinitrochlorobenzene (TNCB) in an acetone-ethanol mixture, whereas negative control mice were sham sensitized with vehicle alone-acetone-ethanol mixture. On day "4", the baseline ear thickness was measured with a micrometer prior to the elicitation of CHS (challenge) by painting both ears with diluted TNCB both in the test and control groups. After 24 h, the ear swelling was measured with a micrometer. CHS is an example of a T cell-mediated immune response that causes swelling in inflamed tissue, peaking 24 h after the skin challenge with the same hapten. An increase in ear edema correlated with augmented ear weight, myeloperoxidase (MPO) activity, pro-inflammatory cytokine concentration in the ear extracts, increased thickening of the edematous dermis in the histological examination, and ear vascular permeability. There was also an increase in the concentration of TNP-specific IgG1 antibodies in the sera of the test group when compared with the control mice. Additionally, CHS can be successfully transferred with the CHS-effector cells obtained from donors previously sensitized with TNCB. The CHS-effector cells were administered intravenously into na&#239;ve recipient mice, which were subsequently challenged with the same diluted hapten. Ear swelling was measured with a micrometer 24 h later.

Contact hypersensitivity (CHS) is a murine experimental model of allergic contact dermatitis (ACD). CHS is based on sensitization with reactive hapten by painting the shaved skin of the chest and abdomen, with a subsequent ear skin challenge with a diluted hapten, causing a swelling reaction that is assessed in various ways.

Hipersensibilidad de contacto como modelo murino de dermatitis alérgica de contacto

Contact hypersensitivity (CHS) is an experimental model of allergic contact dermatitis (ACD) that can be studied in mice. This study aims to present an ...

A Mouse Ear Model for Allergic Contact Dermatitis Evaluation

Skin is the human body&#39;s first line of defense and one of the most exposed organs to environmental chemicals. Allergic contact dermatitis (ACD) is a common skin disease that manifests as a local rash, redness, and skin lesions. The occurrence and development of ACD are influenced by both genetic and environmental factors. Although many scholars have constructed a series of models of ACD in recent years, the experimental protocols of these models are all different, which makes it difficult for readers to establish them well. Therefore, a stable and efficient animal model is of great significance to further study the pathogenesis of atopic dermatitis. In this study, we detail a modeling method using 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) to induce ACD-like symptoms in the ears of mice and describe several methods for assessing the severity of dermatitis during modeling. This experimental protocol has been successfully applied in some experiments and has a certain promotional role in the field of ACD research.

Here, we describe the methods for inducing allergic contact dermatitis in mouse ears by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) and how to evaluate the severity of allergic contact dermatitis.

Un modelo de oreja de ratón para la evaluación de la dermatitis alérgica de contacto

Skin is the human body&#39;s first line of defense and one of the most exposed organs to environmental chemicals. Allergic contact dermatitis (ACD) is a ...