Yazarlar Andy Poczobutt ve Dr. Jori Leszczynski onların değerli yardım ve düzenlemeleri için bu el yazması için teşekkür etmek istiyorum.  Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 ve RO3 HL095439) ve gazileri departmanı işleri (Merit Review) alınan hibe tarafından desteklenen.

Tüm ilgili uluslararası, ulusal ve/veya kurumsal yönergeleri bakım ve hayvanlar (fare) kullanımı için bu el yazması açıklanan deneylerde takip edildi.
Bu yöntem FVBN yetişkin fareler, 16-20 hafta, bu çalışmanın amaçları için en uygun olduğu tespit yaşlı kullanır. 2 gün 6 ile 7 (Şekil 1) içerir ve adım 1-5 gün 1 içerir.
1. ekipman hazırlık
<ol><li>Ketamin/xylazine anestezik olarak (önerilen) kullanılıyorsa, steril, tek kullanımlık şırınga ve iğne, yeterli kaynağımız tutun. İsoflurane anestezik kullanılırsa, oksijen tüpü ve isoflurane başlamadan önce deney için yeterli malzeme olduğundan emin olmak için sıvı seviyesi kontrol edin. De, devreler nefes nosecone montajı ve indüksiyon kutusuna ekleyebilirsiniz; Yeni kömür kutu nefes devreler ekleyin. İndüksiyon kutusu üzerinde oksijen dönüm ve ikinci aşamada yaklaşık 50 psi okur ascertaining hazırlayın.</li>
	<li>37 ° c ısıtma yastığını açmak</li>
	<li>Rektal sıcaklık probu ameliyat için hazırlayın.</li>
</ol>2. fare hazırlık
Bu adım, anestezi, epilasyon ve konumlandırma (yetişkin FVBN fareler-yaş 16-20 hafta) içerir.
<ol><li>Fareler tartmak ve ağırlıkları kaydedin.</li>
	<li>Fareler anestezi.<ol>
<li>Ketamin ve xylazine IP yönetmek (80-100 mg/kg ve 7,5-16 mg/kg, sırasıyla). Ancak, ketamin ve xylazine daha düşük doz ile başlamak tavsiye edilir (30 mg/kg ve 6 mg/kg, sırasıyla).</li>
		<li>Anestezi ile yaklaşık 0.1 korumak - ketamin/xylazine ameliyat boyunca doz 0.25 kez ilk. Ketamin ve xylazine daha fazla tekrarlanabilirlik ve Beka gözlendi olarak anestezik temsilcisi belirli bu çalışmada tercih edildi. Anestezik temsilcisi seçim diğer çalışmalarda farklı olduğu tespit.  İsoflurane kullandıysanız, fare bir indüksiyon odasında koymak ve isoflurane %5 için fareyi tam bilincini kaybeder kadar açmak. Daha sonra 1,5-%2,5 isoflurane yordamı kalanı boyunca ayarlamak bir burun nosecone kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fareler her 2-3 dk uygun anestezi derinliği için kontrol etmek için ayak çimdik tarafından izlemek.</li>
	<li>Fare ventral boyun bölgesi tıraş.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış panelindeki sırtüstü pozisyonda fareyi getirin. Pençeleri ve ayak bandı ile cerrahi yüzeye fare güvenli.</li>
	<li>Suni gözyaşı merhem ameliyat sırasında kurumasını önlemek için gözlerinin üzerine yerleştirin.</li>
</ol>3. cerrahi ayrıntıları
<ol><li>1 cm kesi şu ventral boynundan juguler ven içinde olun.</li>
	<li>Lidocaine (% 1-2) bir veya iki damla ağrı yönetimi için ve vazodilatasyon tanıtmak için kesi bölgeye uygulanır. Lidokain etkili olması için 2 dk. bekleyin.</li>
	<li>Ortaya çıkarmak ve künt diseksiyon ile Şu iç juguler ven yalıtır. Ven 4-0 sütür ile bağlayın ve yavaşça bir hemostat ile gemi rostral sonu geri çek. Bir delik, ince makas, yaklaşık 3 mm aşağıda veya kaudal bağlamak için damar çapı yaklaşık olarak yarısına kullanarak.</li>
	<li>Bir PV-1 Polivinil kateter sonundan itibaren 1.5 cm işaretlemek ve juguler ven bir gemi dilatör kullanarak delikten takın ve kateter gemi, yaklaşık olarak 1.5 cm kaudal sonuna doğru iplik.</li>
	<li>Kaudal bölümü (aşağıda kesim), geminin içinde güvenli bir şekilde kateter ile 4-0 ipek. Kateter dışarıya adım 3.3 rostral juguler ven bağlamaya kullanılan dikiş gevşek uçları ile gemi rostral parçası bağla.</li>
	<li>Tack cilt gevşek geri birlikte vücut ısı kaybı ve kurutulma dokuların önlemeye yardımcı olmak için 4-0 ipek sondayla çevresinde.</li>
	<li>Kateter heparinized serum fizyolojik (10 U/mL) içeren bir şırınga bağlanmak ve kateter floş.</li>
</ol>4. enjeksiyonları
<ol><li>Evans mavi çözüm (% 0,9 normal, unheparinized serum fizyolojik veya yaklaşık 50 mg/kg 30 mg/mL solüsyon 50 μL) çizgi temizlemek için heparinized serum küçük bir birim tarafından takip juguler ven kateteri içine enjekte.</li>
	<li>2 dk sonra madde satırı temizlemek için heparinized serum küçük bir birim tarafından takip P (0.3 mikron çözüm % 0,9 normal, unheparinized serum fizyolojik veya 1 nmol/kg 100 μL), enjekte et. Madde P endotel katmanı üzerinden proteinler plazma ekstravazasyonu zenginleştirerek; Bu protokol için rutin olarak plazma ekstravazasyonu değerleri ölçmek daha kolay hale bir büyütme plazma ekstravazasyonu değerleri arasında yaklaşık 1.5-fold neden olmaktadır.</li>
	<li>Madde P enjekte sonra 18 dk bekleyin. Bu süre boyunca, Evans mavi boya equilibrate ve dolaşımda.</li>
	<li>Deney 18 dk madde P (20 dk sonra Evans mavi enjeksiyon) enjeksiyon sonra fare ile servikal çıkığı feda ederek sona erdirmek. Fareyi doğrudan cervically olabilir muhtemelen çıkık, anestezi, aşırı dozda vermeden faredir muhtemelen hala iyi imzalat ameliyattan. Eğer gerekirse, ancak, aşırı doz anestezikler ketamin/xylazine, isoflurane veya Fentobarbital, servikal çıkığı tarafından takip verilebilir.</li>
</ol>5. yalıtım organları
<ol><li>Göğüs boşluğu fare derini yüzüp, kalp ve kan damarlarının 50 mL 50 mM sodyum sitrat, pH 3.5 ile (bir yükseklikten 51 cm veya 20") yerçekimi sıvı. pH 3.5 muhtemelen Evans mavi bağlayıcı albumin için korur.</li>
	<li>1-5 ilgili organları (mendil) (Örneğin idrar kesesi, böbrek, mide, karaciğer, pankreas, distal veya proksimal kolon, ileum, oniki parmak bağırsağı, gögüs deri, kulaklar, kuyruk, kalp, ve/veya akciğer) parçalanmış bir neşter ile tüketim ve eğer herhangi bir kalıntı içeriği kaldırmak mevcut.</li>
	<li>Oda sıcaklığında (RT) fosfat tamponlu tuz (PBS; Na2HPO4, KH2PO4, 8.0 g 0,24 g NaCl 1.44 g ve 1 L, pH 7.4 KCl 0.20 g) organları durulayın.</li>
	<li>Doku organlarla leke, her organ yarıya ve her yarı ağırlığında (ıslak ağırlıkları, g).</li>
	<li>Bir kuru bir kurutma fırın 48 h için folyo üzerinde 150 ° C'de dokusunda yarısı.</li>
	<li>Formamide bir microfuge içinde tutarlı hacmi (en fazla 200 µL) ikiye tüp 48 h için (ve en fazla 72 s) diğer doku yerleştirmek mavi Evans ayıklamak için.</li>
</ol>6. ölçüm doku OD
<ol><li>Evans mavi-infüzyon formamide (48-72 h RT kuluçka sonra) 50 µL microfuge tüp ve yer 96-şey polistiren tabakta bir kuyunun içine çıkarın. Doku parçaları ile birlikte formamide aktarmak için dikkatli olun.</li>
	<li>Yeni, saf formamide her iki boş Wells 96-şey plaka boşlukları için yer 50 µL.</li>
	<li>Ölçü ve kaydı 96-şey plaka üzerinde bir absorbans plaka okuyucu her şey OD620 . 620 nm olduğunu absorbans max Evans mavi.</li>
</ol>7. plazma ekstravazasyonu hesaplanması
<ol><li>Kuru doku tartmak yarısı 48 h fırında olmuştur.</li>
	<li>Bu aynı doku kuru ağırlığının tarafından yarı bölünmüş belirli organ dan bireysel her fare (içinde elde edilen adım 5,4), yarı başlayan bu doku ıslak ağırlık ile ilgi (içinde elde edilen adım 7.1) ıslak ağırlık/Kuru ağırlık oranını hesaplamak.</li>
	<li>Kuru ağırlık (g) dokusunun formamide ikiye yarısı daha önce yerleştirilir (5.4. adımda elde) formamide tarafından ıslak mendil ıslak ağırlığına bölünerek hesaplamak: Kuru ağırlık oranı (7,2 adımda hesaplanır) ilgi belirli organ için.</li>
	<li>OD620 düzeltilmiş değerleri hesaplar. İle OD620 başlangıç değeri (Evans formamide 6,3. adımda elde her dokusundan mavi-infüzyon içeren) 96-şey plaka deneysel her kuyudan çıkarmak boş iyi OD620 değeri (ortalama OD620 değeri saf formamide, 6.2, adımda hazırlanan içeren iki kuyu 6.3. adımda elde620 değerleri OD) deneysel her değerinden.</li>
	<li>Plazma ekstravazasyonu değer doku kuru ağırlığının tarafından düzeltilen OD620 (içinde hesaplanan adım 7,4) bölerek formamide (içinde hesaplanan adım 7.3) ikiye hesaplayın. Plazma ekstravazasyonu birim OD620/g kuru ağırlık olacaktır.</li>
	<li>Verileri çözümlemek ve SEM istatistiksel ortalama ± karşılaştırmak gibi gruplar t testi veya tek yönlü varyans analizi ve Scheffé'ın çoklu karşılaştırma testi (lycofs01.lycoming.edu), uygun olarak ifade eder.</li>
</ol>

<ol><li>Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pain%22%5BJournal%5D)">Substance P.</a> Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).</li>
<li>Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+neutral+endopeptidase+attenuates+substance+P-induced+plasma+extravasation+in+the+guinea+pig+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).</li>
<li>Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+and+epithelial+permeability+measurements+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals.</a> Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).</li>
<li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+assay+to+test+blood+vessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An in vivo assay to test blood vessel permeability.</a> J Vis Exp. (73), e50062(2013).</li>
<li>Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+Evans+Blue+dye+as+a+marker+of+albumin+clearance+in+murine+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury.</a> Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).</li>
<li>Figini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P+and+bradykinin+stimulate+plasma+extravasation+in+the+mouse+gastrointestinal+tract+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas.</a> Am J Physiol. 272 (4), Pt 1 785-793 (1997).</li>
<li>Awad, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+sphingosine+1-phosphate+1+receptor+activation+reduces+ischemia-reperfusion+injury+in+mouse+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).</li>
<li>Lu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+microvascular+permeability+and+blood+pressure+by+neutral+endopeptidase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase.</a> Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).</li>
<li>Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D'Orleans-Juste, P., Regoli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+urotensin-II+enhances+plasma+extravasation+in+specific+vascular+districts+in+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).</li>
<li>Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+blood-retinal+barrier+breakdown+quantitation+using+Evans+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).</li>
<li>Saria, A., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evans+blue+fluorescence%3A+quantitative+and+morphological+evaluation+of+vascular+permeability+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues.</a> J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).</li>
<li>Fricke, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+neurogenesis+-+the+role+of+the+blood+brain+barrier+in+an+experimental+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis - the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson's disease.</a> Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).</li>
<li>Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+and+quantitation+of+vascular+permeability+in+vivo%3A+implications+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery.</a> PLoS One. 7 (3), 33760(2012).</li>
<li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).</li>
<li>Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+vascular+permeability+and+lymphatic+drainage+using+labeled+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin.</a> Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).</li>
<li>Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase+dysbalance+in+pathology%3A+the+neprilysin+%28NEP%29+and+angiotensin-converting+enzyme+%28ACE%29+families%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%29%22%5BJournal%5D)">Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).</li>
<li>Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutral+endopeptidase+modulates+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Neutral endopeptidase modulates septic shock.</a> Ann N Y Acad Sci. 780, Mar 22 156-163 (1996).</li>
<li>Dempsey, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neprilysin+null+mice+develop+exaggerated+pulmonary+vascular+remodeling+in+response+to+chronic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia.</a> Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).</li>
<li>Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neprilysin+regulates+pulmonary+artery+smooth+muscle+cell+phenotype+through+a+platelet-derived+growth+factor+receptor-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism.</a> Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).</li>
<li>Chu, P., Arber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin-section+detection+of+CD10+in+505+nonhematopoietic+neoplasms.+Frequent+expression+in+renal+cell+carcinoma+and+endometrial+stromal+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma.</a> Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).</li>
<li>Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD10+expression+in+urothelial+bladder+carcinomas%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Urol+Int%22%5BJournal%5D)">CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study.</a> Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).</li>
<li>Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tumor+marker+for+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Urol%22%5BJournal%5D)">A new tumor marker for bladder cancer.</a> Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).</li>
<li>Wick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+vascular+leak+in+neprilysin+transgenic+mice+with+complex+overexpression+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern.</a> Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).</li>
<li>Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+hypoxia+and+hyperthermia+on+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats.</a> J Appl Physiol. 107 (4), (1985) 1348-1356 (2009).</li>
<li>Scholzen, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutral+endopeptidase+terminates+substance+P-induced+inflammation+in+allergic+contact+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis.</a> J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yukarıda da açıklandığı gibi plazma ekstravazasyonu çalışmanın sonuçta nedenleri ile ilgili yeni bilgi ya da inhibe veya plazma ekstravazasyonu tedavi etmek için yeni yollar açabilir. Başarılı kullanımı, plazma ekstravazasyonu Protokolü (üstte), Evans mavi boya, kullanarak geçerli el yazması kanıtlanmıştır. Her ne kadar gösterilen verileri NEP damarlara korusun hipotez plazma ekstravazasyonu karşı bu bir ikincil halen, kolayca ortalama laboratuvar için kullanılabilir en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı sunmak için birincil amaç ile hedeftir plazma ekstravazasyonu gelecekteki çalışma. Burada rapor protokol farklı hedefleri, hayvanlar, organ ve diğer koşulları ile gelecekteki çalışmaları için uyum odaklanmıştır ve bu iletişim kuralı için kullanımı kolay, güvenilir, ekonomik, özellikle yararlı olur ve dikkate alır general ortak malzemeler, reaktifler ve yetkili personel durumu. Bu, ancak, bu iletişim kuralını tekrarlar grup hayvan (8-12 tekrar önerilen) başına adil bir miktar gerektirecektir belirtilmektedir istatistiksel geçerli sonuçlar elde etmek için.
Çok sayıda çalışmalar ve vasküler geçirgenliği ve plazma ekstravazasyonu ölçmek için girişimleri ayrıntılı raporlar olmuştur. By far, bu raporlar çoğunu Evans mavi boya yöntemi ile birlikte plazma ekstravazasyonu ve vasküler geçirgenliği2,3,6,11, araştırmak için kullanılan bir yöntem permütasyon detay 12,13. Hangi Evans tüm3,13,15,24, mavi birleştirmek değil damar geçirgenliği yöntemlerden daha az rapor edilmiştir; Bu diğer yöntemleri karmaşık Yöntemler, özel ekipman ve personel gerektiren genel ortalama laboratuvar için daha az erişilebilir ve genellikle pahalıdır.
Yukarıdaki Evans mavi Protokolü gelişimi birçok farklı permütasyon ve değişiklikleri test dahil. Erken deneyler Evans fare kuyruğu ven mavi enjekte girişimlerini üzerinde durulmuştur. Ancak, teknik olarak zor ve juguler ven enjeksiyonları eklenmesi gerektirecek tutarsız sonuçlar içinde sonuçlandı oldu damar enjeksiyonları ve yukarıda açıklanan terminal cerrahi teknik takip et. Ayrıca yapılan mavi ve madde s. Evans uygun konsantrasyonlarda bulmaya çalışıyorum birçok ön deney vardı Evans mavi miktarı yaklaşık 200 mg/kg (50 mg/kg için şu anda kullanılan göre) aşağıda öyleydi ama madde bu deneylerde kullanılan P miktarı önemli olarak zorunlu olmak bulunamadı. Çok deneme sonra 1 nmole/kg exogenously eklenen madde P, 1.5-fold bir büyütme ile sonuçlanan (ve böylece daha kolay ölçülebilir) ideal konsantrasyonu bulundu plazma ekstravazasyonu değerleri. Ayrıca, bu yeterli zaman Evans mavi equilibrate izin gerekir bulundu (> 10 dk). Perfüzyon aşırı Evans mavi, kurban fare ama organ yalıtım önce sonra kaldırmak için kan damarlarının bir unsuru bu perfüzyon adım4içermez diğer protokolleri karşı mevcut Protokolü bulundu. (Yumuşak yerçekimi degrade tarafından teslim) perfusate 50 mL (hangi bağlama Evans mavi ve albümin teşvik) bir pH 3.5 çözüm olduğunu; paraformaldehyde, birçok diğer Evans mavi protokolleri6,10,25, yaygın olarak karşılaşılan bazı mevcut protokolünde atlandı. Bu protokol için çözümlenmiş diğer faktör doksisiklin chow içinde kullanılan boya ile OD620 nm ölçüm Evans mavi dokularda Sindirimsel evden gelen engelleyen olmasıdır. Böylece, boyanmamış doksisiklin chow yukarıda deneylerde kullanmak için gerekli idi. Ayrıca, bir önemli ve yararlı neredeyse herhangi bir organ fare tatmin edici izole ve mevcut protokolü üzerinden incelendiğinde bulgudur.

Organlarda vasküler sızıntı ekstravazasyonu için başvurur veya kan plazma arasındaki endotel üretilen geçitlerden kaçağı sonrası kapiller venüller organlarda. Bu plazma ekstravazasyonu veya bazı tip bir enflamatuar yanıt ortaya çıkabilecek, artmış vasküler geçirgenliği ciddi sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, bu fenomen, nedenleri, modülatörler ve sonuçları, okudu ve anlaşılır, aynı şekilde, müfettişler kadrini ve araçları protokol önemli ve onları çalışma kullanılacak. Endotel boşluklar uyaran bir dizi üretilen ama genellikle peptid nörotransmitter ve/veya tachykinins endothelia üzerinde eylem tarafından üretilmektedir. Artmış plazma ekstravazasyonu oluşur, bu sürecin önemli doğal olarak meydana gelen arabulucular biridir undecapeptide tachykinin peptit, madde P1.
Evans mavi boya albümin-bağlama özelliği kullanmak, araştırmak ve vasküler geçirgenliği veya plazma ekstravazasyonu, ölçmek için yöntemler geliştirilmiştir ve genellikle onların doğruluğu, basitlik, ekonomi, güvenlik ve izin yeteneği için bilinen Hemen, plazma ekstravazasyonu birkaç doku üzerinden belirlenmesi Eğer öyleyse istenen2,3,4,5,6,7,8,9 . Plazma ekstravazasyonu organlarda FVBN farelerin değerlendirmek için bu Evans mavi iletişim kuralı tüm bunlar kullanır, ancak genellikle yararlı ve gelecekteki araştırmalar yapar veya olacak ortalama laboratuvar içeren, uyarlanabilir olsun bazı önemli değişiklikler ekler plazma ekstravazasyonu veya vasküler geçirgenliği ile ilişkili faktörler önemli çalışmalar yapmak. Bu protokol için madde P 1 nmol/kg, hangi 1.5-fold tarafından plazma ekstravazasyonu zenginleştirerek fareler için verilir. Bu daha kolay gözlemlenebilir ve elde edilebilecek sonuçlarında ortaya çıkan protokolü, hassasiyeti artırır. Geçirgenliği gibi çeşitli diğer peptidler, kimyasal madde veya toksik yaralanma, bazı türlerinin etkileyen diğer faktörler kullanılan ya da istediğiniz gibi diğer laboratuvarlar tarafından okudu. Juguler ven enjeksiyonları terminal ameliyat gerektiren Evans mavi ve madde P sistemik, tanıtmak için bu protokol için kullanılır. Ancak, juguler ven enjeksiyonları5,7,10, hatta gerekli terminal cerrahi teknikleri, dikkate sonra daha kolay usta ve diğerinden daha tutarlı sonuçlar üretim yol venöz enjeksiyonu, kuyruk dahil olmak üzere enjeksiyonları4,9damar. Retro-orbital venöz sinüs enjeksiyonları tarafından teslim edilmek üzere mavi Evans için mümkün olabilir, ancak hiçbir başvuru literatürde teslimat Evans mavi bu yöntemi kullanan tespit edilmiştir. Ancak, kuyruk ven enjeksiyon gelince, yüksek seviyede uzmanlık ve büyük ölçüde bu tekniği tekrarlanarak master için pratik kullanımı başarılı Evans mavi enjeksiyonlar için sınırlar. Buna ek olarak, alternatif juguler ven enjeksiyon yöntemi bizim iletişim kuralında, açıklandığı gibi teknik olarak elde edilebilecek bir çözüm sunar. Bir çok önemli fare damar, perfüzyon için müdahalede sonra sadece mavi periosteum Evans fare kurban aşırı Evans mavi boya kaldırır ve bu protokol için standart. Perfüzyon, önceden açıklanan yöntemleri dikkatle inceledi ve mevcut prosedür elde etmek için değiştirilebilir. Burada açıklanan diğer değişiklikler tüm en iyi duruma getirilmiş, basit ve ucuz.
Evans mavi boya yönteminin önemli bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, bazen bu yöntemle ilişkili düşük duyarlılık Evans mavi enjekte hayvanlardan dokuların bazı ek brüt patolojik ve histolojik muayene engelleyebilir. Ancak, bu ve diğer sınırlamalar alternatif yöntemler ve yine de, hala Evans mavi kullanan modelleri gelişmesine yol açmıştır. Evans mavi ölçümü Floresan (yerine göre görsel menzilli) spektroskopisi yönteminin duyarlılığını artabilir. Ayrıca, floresans mikroskobu Evans mavi lekeli dokuların daha farklı yerlerde11vasküler sızıntı gözlenmesi için izin vermek için geliştirilmiştir. Ayrıca, tüm vücut görüntüleme ve yaşayan bir hayvan tarama daha önce mavi12 Evans mavi konsantrasyonları incelenmesi için sürekli bir şekilde sağlar Evans ile enjekte yerine bir belirli zaman seçilmiş deneme üzerine gelin. Ancak, bu yöntem uygun görüntüleme özellikleri gerektirir ve çok pahalı olabilir. Değişiklikler, Evans mavi ve gerçekleştirilen bir vitro tür modeli içeren gibi bir hücreye kültür ya da piliç chorioallantoic modeli13 (CAM) Ayrıca tarif edilmiştir. Bu modeller floresans ve intravital14 mikroskobu, tarafından izlenir ve vasküler permeabilite değişiklikleri miktar, zaman içinde izin ama doğru modelleme ile ilgili sorular vivo durumlardan artırabilir ve de kullanabilirsiniz pahalı.
Evans mavi yönetim içermeyen diğer yöntemleri belirlemek ve vasküler sızıntı veya geçirgenliği, ölçmek için geliştirilmiş oldu. Bu Yöntemler (örneğin, albümin veya fluoresein) uygun bir floresan molekül veya canlı hayvanlar için bir isotopically etiketli veya başka bir şekilde etiketlenmiş molekül istihdam (veya modelleri13non-invaziv tarafından takip, kültür veya chorioallantoic (CAM) hücre için görüntüleme (PET tarama, MRI, intravital mikroskobu, tüm vücut tarama) veya invaziv görüntüleme (Floresan Mikroskobu)3,12,15. Her ne kadar bu teknikler mavi yöntemleri bir dizi diğer Evans avantajlar sunabilir, aynı zamanda onların önemli karmaşıklığı, gerekli uzmanlık, kaynak ve yüksek parasal maliyeti içerebilir dezavantajları var.
Neprilysin16 (peptidaz enzim NEP, olarak da bilinen CD10, MME veya Enkephalinase) plazma ekstravazasyonu, en azından bölümünde, enzimatik metabolizma ve endojen madde p. inactivation inhibe içinde dahil olmak için önerilen Böylece, hücre yüzey peptidaz NEP oluşmasına neden olan dokularda olabilir bir zayıflama etkisinin bir madde P, muhtemelen NEP. peptidaz etkinliği tarafından
Başlangıçta, madde P kaynaklı plazma ekstravazasyonu bu değiştirilmiş Evans mavi iletişim kuralı, FVBN vahşi türü (WT) ve NEP nakavt (KO) fare ile kullanmak için test ettik. Madde P artar plazma ekstravazasyonu NEP katılımı bu ilk çalışmalardan şüphelenildi ve bunlar tarif ve daha fazla plazma ekstravazasyonu içeren NEP'ın rolü deneyler. Ancak, bu yazının odak NEP veya plazma ekstravazasyonu rolü değil, ama oldukça plazma ekstravazasyonu kendilerini deneyler. Değiştirilmiş bu iletişim kuralı kullanımı ile elde edilen sonuçlar tür temsilcisi NEP sonuçlarıdır. Evans mavi yöntem plazma ekstravazasyonu ölçmek için en iyi duruma getirilmiş ve FVBN fareler için ayrıntılı olarak açıklandığı gibi değiştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>isoflurane</td><td>Vet One</td><td>200-070</td><td>inhaled anesthetic</td></tr><tr><td>ketamine</td><td>Vet One</td><td>200-055</td><td>injectable anesthetic</td></tr><tr><td>xylazine</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td>injectable anesthetic</td></tr><tr><td>syringes (10,3 &amp;amp; 1 cc)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604, 309657, 309659</td><td></td></tr><tr><td>needles (20G1,23G1 &amp;amp; 26G1/2)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305178, 305193, 305111</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane induction chamber</td><td>VetEquip</td><td>941443</td><td>1 Liter</td></tr><tr><td>nosecone breathing circuits&amp;nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>RC2</td><td>Rodent Circuit Controller 2</td></tr><tr><td>oxygen tank</td><td>Airgas</td><td>UN 1072</td><td>100% medical</td></tr><tr><td>heating pad</td><td>CWE Inc.</td><td>TC-1000</td><td>temperature controller</td></tr><tr><td>rectal temperature probe</td><td>CWE Inc.</td><td>10-09012</td><td>mouse</td></tr><tr><td>balance (for rodents)</td><td>Ohaus</td><td>CS 2000</td><td></td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>15000-00</td><td>Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11151-10</td><td>Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)</td></tr><tr><td>surgical tools-hemostats</td><td>Fine Science tools</td><td>13009-12</td><td>Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)</td></tr><tr><td>surgical tools -suture drivers</td><td>Fine Science tools</td><td>12502-12</td><td>Olsen-Hegar suture drivers (suturing)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11627-12</td><td>Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)</td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14110-15</td><td>Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>18025-10</td><td>suture tying forceps (used for Millar cath)</td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14078-10</td><td>Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11254-20</td><td>Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)</td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14082-09</td><td>Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11051-10</td><td>10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11251-35</td><td>Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)</td></tr><tr><td>surgical tools-retractors</td><td>Fine Science tools</td><td>17012-11</td><td>Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11294-00</td><td>Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11297-00</td><td>Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)</td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14058-11</td><td>tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11009-13</td><td>serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)</td></tr><tr><td>surgical tools-hemostats</td><td>Fine Science tools</td><td>13003-10</td><td>Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11006-12</td><td>Adson serrated forceps (tissue grasping)</td></tr><tr><td>clippers</td><td>Oster</td><td>A5</td><td></td></tr><tr><td>tape</td><td>Fisherbrand</td><td>159015G</td><td></td></tr><tr><td>artificial tear ointment</td><td>Akorn Inc</td><td>13985-600-03</td><td></td></tr><tr><td>lidocaine</td><td>Hospira</td><td>0409-4277-01</td><td>2% injectable</td></tr><tr><td>polyvinyl catheters</td><td>Tygon</td><td>PV-1</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Substance P</td><td>Bachem&amp;nbsp;</td><td>H-1890</td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25201-400-10</td><td>1000 U/ml</td></tr><tr><td>saline solution</td><td>Hospira</td><td>0409-7138-09</td><td>0.9% sodium chloride</td></tr><tr><td>phenobarbital&amp;nbsp;</td><td>Vortech</td><td>0298-9373-68</td><td></td></tr><tr><td>sodium citrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-50TAB&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes for blotting</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47670</td><td></td></tr><tr><td>microbalance</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>microfuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-534</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene 96 well plate</td><td>Becton Dickenson</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>absorbance plate reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>polyacrylamide gels</td><td>Bio-Rad</td><td>3450014&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>protein molecular weight standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Protran supported nitrocellulose</td><td>Amersham (GE)</td><td>10600015</td><td></td></tr><tr><td>gel box</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-1379</td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>primary NEP polyclonal antibody&amp;nbsp;</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>AF1182</td><td></td></tr><tr><td>doxycycline chow</td><td>Teklad (HARLAN)</td><td>TD.130750&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FVB/NJ wild type mice</td><td>Jackson</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>secondary antibody (goat anti-rabbit)</td><td>ZyMed</td><td>81-6120</td><td></td></tr><tr><td>ECL solution-Western Lightening Plus</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>film</td><td>Pierce</td><td>34091</td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse

Vasküler sızıntı veya plazma ekstravazasyonu, bir nedeni vardır ve ciddi sonucu veya bir enflamatuar yanıt belirtisi olabilir. Bu çalışmada sonuçta nedenleri ile ilgili yeni bilgi ya da inhibe veya plazma ekstravazasyonu tedavi etmek için yeni yollar açabilir. Araştırmacılar plazma ekstravazasyonu çalışmak için en iyi yöntemler kullanılabilir, dahil olmak üzere uygun araçlara sahip önemlidir. Bu makalede, biz FVBN farelerin organlarda plazma ekstravazasyonu değerlendirmek için Evans mavi boya yöntemini kullanarak bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı kasten basittir, için iyi bir derece, mümkün olduğunca ama sağlar yüksek kalitede veri. Evans mavi boya öncelikle çünkü kullanmak ortalama laboratuvar için kolay seçildi. Enzim neprilysin plazma ekstravazasyonu karşı damarlara korusun hipotez için kanıt ve destek sağlamak için bu protokolü kullanmış. Ancak, bu iletişim kuralını deneysel olarak kullanılan olabilir ve kolayca anlama, önlenmesi ve tedavisinde önemli diğer faktörler içerebilir çalışmaları için diğer suşların fareler veya diğer türler, birçok farklı organ veya doku, kullanılacak adapte plazma ekstravazasyonu. Bu iletişim kuralı kapsamlı bir şekilde optimize edilmiş ve kullanımı, ekonomi ve genel availability-in malzeme ve ekipman, bu iletişim kuralını kullanmak ortalama laboratuvar için üstün yapım kolaylığı varolan iletişim kuralları ve birleştiren güvenilirlik modifiye, plazma ekstravazasyonu düşük organlarını miktarının.

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse at JoVE.com

An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Bu makalede, ekonomik, en iyi duruma getirilmiş ve basit bir protokol bu Evans mavi boya yöntemi diğer suşları, türler ve diğer organ veya doku kullanmak için adapte edilebilir FVBN farelerin organlarda plazma ekstravazasyonu değerlendirmek için kullandığı açıklanmıştır.

En iyi duruma getirilmiş bir Evans mavi Mouse vasküler sızıntı değerlendirmek için iletişim kuralı

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

an-optimized-evans-blue-protocol-to-assess-vascular-leak-in-the-mouse

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

26.4K Görüntüleme.  University of Colorado Denver. Bu makalede, ekonomik, en iyi duruma getirilmiş ve basit bir protokol bu Evans mavi boya yöntemi diğer suşları, türler ve diğer organ veya doku kullanmak için adapte edilebilir FVBN farelerin organlarda plazma ekstravazasyonu değerlendirmek için kullandığı açıklanmıştır.

Video: An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Kan-beyin bariyer bozulması arasında Rat Modeli Nörovasküler Therapeutics Hedefli izin ver için

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Tıp

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

An<em&gt; In vivo</emKan Gemi Geçirgenlik Test&gt; Test

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

Farelerde Yerel Anafilaksi Ölçme

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Aracı Olarak Adeno-ilişkili virüs kullanarak Hastalığında Retina Engelleri Eğitim için

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

Bağışıklık Yanıtları intravital multiphoton Görüntüleme Fare Kulak Skin uyaran İskemi-reperfüzyon yaralanması

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke involves middle cerebral artery occlusion (MCAO). Infarct zone, brain edema and blood-brain barrier (BBB) breakdown are measured as parameters that reflect the extent of brain injury after MCAO. A significant limitation to this method is that these measurements are normally obtained in different rat brain samples, leading to ethical and financial burdens due to the large number of rats that need to be euthanized for an appropriate sample size. Here we present a method to accurately assess brain injury following MCAO by measuring infarct zone, brain edema and BBB permeability in the same set of rat brains. This novel technique provides a more efficient way to evaluate the pathophysiology of stroke.

This protocol describes a novel technique of measuring the three most important parameters of ischemic brain injury on the same set of rodent brain samples. Using only one brain sample is highly advantageous in terms of ethical and economic costs.

Tek Bir Kemirgen Beyin Örneklerinde İnme Sonrası Serebral Ödem, Enfarktüs Bölgesi ve Kan-Beyin Bariyeri Kırılımının Ölçülmesi

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

Nörobilim

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

İn vivo Tekrarlanabilirliği Artırmak için Fare Retinasında Vasküler Yaralanma Okumaları

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

<meta charset="utf8"></head><body>Bir Sıçan İskemi/Reperfüzyon Modelinde Kardiyak Mikrovasküler Endotel Bariyerinin Geçirgenliğini Değerlendirmek İçin Bir Floresan Testi

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Bir Sıçan İskemi/Reperfüzyon Modelinde Kardiyak Mikrovasküler Endotel Bariyerinin Geçirgenliğini Değerlendirmek İçin Bir Floresan Testi

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby the permeability of the endothelium to blood cells, plasma macromolecules, and water can be adapted according to the physiological need. In certain diseases, cytokines and growth factors are released that target the endothelial barrier to transiently increase vascular permeability; however, their prolonged presence may cause chronic vascular hyperpermeability and thereby tissue-damaging edema. The Miles assay is an in vivo technique that allows researchers to study vascular hyperpermeability through the proxy measurement of vascular leakage. Here, we provide a detailed protocol on how to perform this procedure in the mouse, which is the most widely used model organism to study mammalian physiology and pathology. The procedure involves the intravenous injection of Evans blue dye to label the circulating albumin followed by multiple intradermal injections of permeability-inducing agents and vehicle control solutions into opposing flanks of the mouse. Consequently, Evans blue dye gradually leaks into the dermis, where it accumulates and can be extracted for quantification as leakage induced by the permeability-inducing agent relative to the vehicle. The Miles assay can be performed in wild type or genetically modified mouse models and may be combined with drug administration to study molecular mechanisms that regulate vascular permeability and identify agents/targets capable of inducing or blocking hyperpermeability.

Here, we present a protocol to measure the vascular leakage induced by intradermal administration of permeability promoting agents into the murine skin. This technique can be used to determine the ability of molecules to promote or inhibit vascular leakage or to study the molecular mechanisms that regulate vascular permeability.

Vasküler Hyperpermeability indükleyici ajanlar cilt mil tahlil ile değerlendirilmesi

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

En iyi duruma getirilmiş bir Evans mavi Mouse vasküler sızıntı değerlendirmek için iletişim kuralı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Kan-beyin bariyer bozulması arasında Rat Modeli Nörovasküler Therapeutics Hedefli izin ver için

An

Farelerde Yerel Anafilaksi Ölçme

Aracı Olarak Adeno-ilişkili virüs kullanarak Hastalığında Retina Engelleri Eğitim için

Bağışıklık Yanıtları intravital multiphoton Görüntüleme Fare Kulak Skin uyaran İskemi-reperfüzyon yaralanması

Tek Bir Kemirgen Beyin Örneklerinde İnme Sonrası Serebral Ödem, Enfarktüs Bölgesi ve Kan-Beyin Bariyeri Kırılımının Ölçülmesi

İn vivo Tekrarlanabilirliği Artırmak için Fare Retinasında Vasküler Yaralanma Okumaları

Bir Sıçan İskemi/Reperfüzyon Modelinde Kardiyak Mikrovasküler Endotel Bariyerinin Geçirgenliğini Değerlendirmek İçin Bir Floresan Testi

Bir Sıçan İskemi/Reperfüzyon Modelinde Kardiyak Mikrovasküler Endotel Bariyerinin Geçirgenliğini Değerlendirmek İçin Bir Floresan Testi

Vasküler Hyperpermeability indükleyici ajanlar cilt mil tahlil ile değerlendirilmesi