Damos las gracias a Shanghai Tolo Biotech por su asistencia técnica durante el desarrollo de la norma C-Brick. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Investigación Prioritaria Estratégica de la Academia China de Ciencias (Grant No. XDB19040200).

1. Preparación de CRRNA <ol><li> Preparación de plantillas de CRRNA <ol><li> Re-suspender los oligonucleótidos individuales ( Tabla 1 ) en agua libre de RNasa a una concentración de 10 μM. </li><li> Se a~naden 22,5 μl de oligonucleótido de hebra superior (T7-F en la Tabla 1 ), 22,5 μl de oligonucleótido de cadena inferior ( Tabla 1 ) y 5 μl de tampón de recocido 10x a un tubo de PCR de 0,2 ml. Asegúrese de que el volumen total es de 50 μl. NOTA: En la Tabla 1 se muestran seis oligonucleótidos diferentes de hebras inferiores, cada uno de los cuales debería estar emparejado individualmente con la hebra superior T7-F. Las letras minúsculas de la Tabla 1 representan la secuencia a transcribir en la secuencia guía de CRRNA. Se puede usar tampón Taq PCR 10x en lugar del tampón de recocido 10x. </li><li> Coloque el tubo de PCR en un termociclador. </li><li> Ejecutar el programa de recocido: desnaturalización inicial a 95 ° C para5 min y luego un tiempo de reutilización de 95-20 ° C, con una disminución de 1 ° C por minuto en el termociclador. NOTA: Utilice inmediatamente las muestras para el paso 1.2.1. </li></ol></li><li> Transcripción y purificación de CRRNA <ol><li> Se añaden 38 μl de agua libre de RNasa, 8 μl de la plantilla de la etapa 1.1.4, 20 μl de tampón de transcripción 5x T7, 20 μl de mezcla NTP (10 μM), 4 μl de inhibidor RNasa recombinante (RRI) y 10 μL Μl de ARN polimerasa T7 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Asegúrese de que el volumen total es de 100 μL. </li><li> Se pone el tubo de microcentrífuga en un baño de agua a 37 ° C durante la noche (durante aproximadamente 16 h). </li><li> Utilice un kit de limpieza y concentración de ARN para purificar el ARN transcrito; Siga el protocolo del fabricante. </li><li> Cuantificar los ARNs con espectrofotómetros UV-Vis y diluir el ARN a una concentración de 10 μ M. Utilice las muestras inmediatamente o almacénelas a -80 ° C. NOTA: La secuencia de CRRNAS se enumeran en la Tabla 2 . </li></ol></li></ol> 2. Construcción de piezas de C-Brick ( es decir, la inserción de partes biológicas en un vector estándar de C-Brick) NOTA: Este paso tiene tres sub-pasos. Para las partes biológicas cortas ( por ejemplo, promotores y terminadores), es mejor utilizar el método de PCR directa para insertar las partes biológicas en un vector estándar de C-Brick 4 . La secuencia completa del vector se muestra en los datos suplementarios, y la secuencia de prefijo y sufijo se muestra en la Figura 1 (paso 2.1, más adelante). Para las partes biológicas que pueden obtenerse fácilmente mediante PCR ( por ejemplo, con plantillas de ADN genómico, plásmidos o secuencias de ADN sintetizadas de novo ), es mejor utilizar el método de ensamblaje sin costuras para insertar las partes biológicas en un vector estándar de C-Brick (Paso 2.2, más adelante). Para las partes obtenidas de las normas BioBrick y BglBrick, la restricciónSe puede usar la digestión mediada por enzima y la ligación mediada por ligasa de T4-ADN para insertar las partes biológicas en un vector estándar de C-Brick (etapa 2.3, más adelante). <ol><li> Construcción mediante amplificación directa por PCR <ol><li> Diseñar y ordenar oligonucleótidos para la amplificación por PCR. NOTA: El extremo 5 &#39;del oligonucleótido contiene la secuencia de la parte de ADN, y el extremo 3&#39; del oligonucleótido contiene la secuencia del vector ( es decir, &quot;GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG&quot; en el extremo 3 &#39;de la hebra delantera y &quot;GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG&quot; En la cadena inversa). En el extremo 5 &#39;del oligonucleótido no se puede diseñar ningún saliente ni un saliente de 20 pb. Ejemplos específicos se pueden encontrar en un estudio previo 4 . </li><li> Re-suspender oligonucleótidos individuales en agua ultra pura a una concentración de 10 μ M. </li><li> Preparar reacciones de PCR en hielo en un tubo de PCR de 0,2 ml: añadir 18 μl de agua ultra pura, 25 μL de 2x P1 μl de dNTPs (10 μM), 2,5 μl de cada uno de los cebadores directos e inversos (10 μM) del paso 2.1.2, 0,5 μl de vector estándar C-Brick (50 ng) como molde y 0,5 μl De DNA polimerasa de alta fidelidad. Asegúrese de que el volumen total es de 50 μl. </li><li> Coloque el tubo directamente en un termociclador e inicie el programa del termociclador. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C. </li><li> Programa termociclador: un ciclo durante 3 min a 98 ° C; Treinta ciclos durante 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C y 2 min a 72 ° C; Y un ciclo durante 10 min a 72 ° C. Mantenga la muestra a 16 ° C. </li><li> Añadir 9 μl de la mezcla de la etapa 2.1.4 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Añadir 1 μl de DpnI e incubar durante 1 h en un baño de agua a 37 ° C. NOTA: Si los cebadores no tienen secuencias solapadas, añada 0,5 μL de polinucleótido quinasa T4 (PNK) y 0,5 μL de T4 DNA ligasa e incube enUn baño de agua a 22 ° C durante 1 h. De lo contrario, si los cebadores contienen una secuencia de superposición de ~ 20 nt, transformar directamente los productos tratados con DpnI en células compatibles con E. coli (DH10B) (etapa 2.4). El producto de PCR linealizado será circularizado por el sistema de recombinación en el huésped. </li><li> Utilice las muestras inmediatamente o guárdelas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Construcción a través de un montaje sin fisuras <ol><li> Diseñar y ordenar oligonucleótidos para la amplificación por PCR. NOTA: El extremo 3 &#39;del oligonucleótido contiene la secuencia terminal de la parte de ADN y el extremo 5&#39; del oligonucleótido contiene el terminal de la secuencia de vector estándar linealizada de C - Brick ( es decir, &quot;CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC&quot; para el extremo 5 &#39; -end de la cadena delantera y &quot;CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC&quot; para el extremo 5 &#39;de la cadena inversa). Ejemplos específicos se pueden encontrar en un estudio previo 4 . </li><li> Re-suspender el individuoUal en agua ultrapura a una concentración de 10 μM. </li><li> Preparar reacciones de PCR en hielo en un tubo de PCR de 0,2 ml: añadir 18 μl de agua ultra pura, 25 μL de tampón de PCR 2x, 1 μl de dNTP (10 μM), 2,5 μl de cada uno de los cebadores directos e inversos (10 μM ) De la etapa 2.2.2, 0,5 μl de plantilla (20-500 ng) y 0,5 μl de ADN polimerasa de alta fidelidad. Asegúrese de que el volumen total es de 50 μl. </li><li> Coloque el tubo directamente en el termociclador y ejecute el programa del termociclador. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C. NOTA: Ajuste el programa del termociclador a: un ciclo durante 3 min a 98 ° C; 30 ciclos durante 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C (según la temperatura de recocido del cebador) y 1 min (según la longitud de las partes biológicas) a 72 ° C; Y un ciclo durante 10 min a 72 ° C. Mantenga la muestra a 16 ° C. </li><li> Purificar el producto de PCR utilizando un sistema de limpieza de PCRKit de temperatura; Siga el protocolo del fabricante. </li><li> Digerir el vector estándar C-Brick con BamHI: añadir 34 μl de agua ultra pura, 10 μL de plásmido (1 μg), 5 μL de tampón 10x y 1 μl de BamHI al tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Purificar el producto anterior usando un kit de sistema de limpieza de gel; Siga el protocolo del fabricante. </li><li> Añadir 2 μl de vector linealizado (50 ng) de la etapa 2.2.7, 5 μl de fragmento (200 ng) de la etapa 2.2.4, 2 μl de tampón de ensamblaje sin costura 5x y 1 μl de enzima de ensamblaje sin costura de un kit de ensamblaje sin costura A un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Asegúrese de que el volumen total es de 10 μl. </li><li> Colocar esto en un baño de agua a 37 ° C durante 30 min. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Construcción mediante digestión mediada por enzimas de restricción y ligación mediada por ligasa de T4 ADN. NOTA: Para las partes obtenidas de las normas BioBrick (etapa 2.3.4-2.3.7) y BglBrick (etapa 2.3.1-2.3.3), se puede utilizar la digestión mediada por enzimas de restricción y la ligación mediada por ligasa de T4-ADN para insertar la Biológicas en un vector estándar de C-Brick. <ol><li> Digerir las partes estándar de BglBrick con BamHI y BglII: añadir 34 μl de agua ultra pura, 10 μL de plásmido (2 μg), 5 μL de tampón 10x, 0,5 μL de BamHI y 0,5 μL de BglII en el tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Ejecutar una electroforesis en gel de agarosa al 1% y purificar el fragmento usando un kit de sistema de limpieza de gel. </li><li> Ligar el fragmento y el vector estándar de C-Brick: añadir 2 μl de vector linealizado (50 ng) de la etapa 2.1.12 y 6 μl de fragmento (200 ng) de la etapa 2.3.3 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 1 μ l de 10 x T4 ADN ligasa buffer y 1 μ l de T4 DNA ligase. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Utilice las muestras inmediatamente o freezE y almacenarlos a -20 ° C. </li><li> Digerir las partes estándar de BioBrick con XbaI y SpeI: añadir 34 μL de agua ultra pura, 10 μL de plásmido (2 μg), 5 μL de tampón 10x, 0,5 μL de XbaI y 0,5 μL de SpeI al tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Digerir el vector estándar de C-Brick con XbaI y SpeI: añadir 34 μL de agua ultrapura, 10 μL de plásmido (1 μg), 5 μl de tampón 10x, 0,5 μL de XbaI y 0,5 μl de SpeI al tubo de microcentrífuga . Incubar durante 2 h en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Ejecutar una electroforesis en gel de agarosa al 1% y purificar el fragmento de la etapa 2.3.4 y el vector linealizado de la etapa 2.3.5 con un kit de sistema de limpieza de gel; Siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Ligar el fragmento y el vector C-Brick: añadir 2 μl de vector linealizado (50 ng) de la etapa 2.3.5 y 6 μl de fragmento (200 ng) de la etapa 2.3.4 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. AnuncioD 1 μl de tampón de ADN ligasa 10 x T4 y 1 μl de ADN ligasa T4. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Añadir 10 μl de los productos de la etapa 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 o 2.3.7 para la transformación química en las células competentes de E. coli (DH10B). </li><li> Recoger varios clones a un líquido de 5 ml Luria-Bertani (LB) tubo e incubar a 37 ° C en un agitador (220 rpm) durante la noche. </li><li> Extraer el plásmido usando un kit de preparación de plásmido; Siga el protocolo del fabricante. </li><li> Identificar los clones correctos mediante la secuenciación de Sanger 11 . </li></ol> 3. Ensamblaje del C-Brick ( Figura 2 ) <ol><li> Digestión del vector C-Brick con Cpf1 <ol><li> Añadir 22,5 μl de agua libre de RNasa, 4 μl de tampón Cpf1 10x, 10 μl del plásmido de la etapa 2.6 (1 μg), 0,5 μL de RRI y 1 μg de# 181; L de Cpf1 (5 μM) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. NOTA: Cpf1 puede adquirirse comercialmente o purificarse siguiendo el protocolo en un estudio previo 4 . </li><li> Para insertar un fragmento de ADN extraño en los sitios T1 y T2, añadir 1 μl de CRRNA-T2 (10 μM) e incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 30 min. A dd 1 μ l de CRRNA-T1 (10 μ M) y Cpf1 (5 μ M) durante otros 30 min. NOTA: Alternativamente, para insertar un fragmento de ADN extraño en los sitios T3 y T4, añadir 1 μl de CRRNA-T3 (10 μM) e incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 30 minutos. Añadir 1 μ l de CRRNA-T4 (10 μ M) durante otros 30 min. </li><li> Añadir 1 μl de fosfatasa alcalina termosensible e incubar el tubo en un baño de agua a 37 ° C durante otras 1 h. </li><li> Ejecutar una electroforesis en gel de agarosa y purificar el vector utilizando un kit de sistema de limpieza de gel. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C. </li></ol></Li <li> La digestión del fragmento de ADN con Cpf1 <ol><li> Añadir 21,5 μl de agua libre de RNasa, 4 μl de tampón Cpf1 10x, 10 μL de plásmido de la etapa 2.6 (2 μg), 0,5 μL de RRI y 2 μl de Cpf1 (5 μM) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Para insertar un fragmento de ADN extraño en los sitios T1 y T2, añadir 1 μl de CRRNA-T1 (10 μM) y 1 μl de CRRNA-T3 (10 μM) e incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 2 h. NOTA: Alternativamente, añada 1 μl de CRRNA-T2 (10 μM) y 1 μl de CRRNA-T4 (10 μM) e incube en un baño de agua a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Ejecutar una electroforesis en gel de agarosa y purificar el fragmento usando un kit de sistema de limpieza de gel. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Ensamblaje de C-Brick y verificación adicional <ol><li> Ligar el fragmento de ADN extraño y el vector C-Brick: añadir 2 μl del vector linealizado (50 ng) de la etapa 3.1.4 y 6 μl del fragmento de ADN (200 ng) de la etapa 3.2.3 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 1 μl de tampón de ADN ligasa 10 x T4 y 1 μl de ADN ligasa T4. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C. </li><li> Añadir 10 μl de los productos de ligación (etapa 3.3.1) para la transformación química en células competentes de E. coli (DH10B). </li><li> Se agregan varios clones a un tubo LB líquido de 5 ml y se incuba durante la noche en un agitador a 220 rpm y 37ºC. </li><li> Extraer el plásmido usando un kit de preparación de plásmido; Siga el protocolo del fabricante. </li><li> Identificar los clones correctos mediante la secuenciación de Sanger 11 . </li></ol></li><li> Realice una nueva ronda de ensamblaje C-Brick. Los clones correctos de la etapa 3.3.4 pueden usarse como un nuevo vector de C-Brick o parte de ADN para un montaje iterativo de C-Brick adicional, siguiendo el mismo protocolo de los pasos 3.1-3.3. NOTA: T2 &#39;y T3&#39; sItes están diseñados como la copia de seguridad de los sitios T2 y T3 ( Figura 1a ). Para los plásmidos obtenidos de la etapa 2.3.7, sólo pueden utilizarse T2 &#39;y T3&#39; para el ensamblaje estándar de C-Brick. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un procedimiento para el ensamblaje de ADN estándar C-Brick. El paso más importante en este protocolo es la linealización del vector estándar de C-Brick; La escisión incompleta del vector podría afectar seriamente la tasa de éxito. Adicionalmente, aunque Cpf1 escinde principalmente secuencias de ADN diana en el patrón de escisión &quot;18-23&quot;, también se detectó una escisión imprecisa cerca de las dos bases 4 , lo que puede causar un pequeño número de mu...

La estandarización de las partes biológicas del ADN es importante para el desarrollo de la biología sintética 1 . El desarrollo de un procedimiento de ensamblaje de ADN puede reemplazar diseños experimentales ad hoc y eliminar muchos de los resultados inesperados que surgen durante el ensamblaje de componentes genéticos en sistemas más grandes. El estándar BioBrick (BBF RFC 10) fue uno de los primeros estándares de ensamblaje de ADN propuestos. Utiliza la secuencia de prefijo (que contiene sitios de corte EcoRI y XbaI) y la secuencia de sufijo (que contiene sitios de corte SpeI y PstI) 2 , 3 . Debido a que XbaI y SpeI tienen extremos cohesivos complementarios, las partes de ADN de BioBrick que se cortan con XbaI y SpeI se pueden unir, generando una nueva BioBrick para un montaje iterativo adicional. Algunos defectos han sido identificados con el uso del estándar BioBrick 4 . Por ejemplo, produce una cicatriz de 8 pbEntre las partes de ADN, que no permite la construcción de proteínas en fusión. Además, los cuatro tipos de sitios de restricción de 6 pb mencionados anteriormente deben retirarse de las partes de ADN, lo cual es muy inconveniente. El estándar BglBrick se estableció para resolver el primer problema 5 . Crea una cicatriz de 6 pb &quot;GGATCT&quot;, produciendo Gly-Ser y permitiendo la fusión de múltiples proteínas o dominios de proteínas. IBrick fue desarrollado para hacer frente al segundo problema 6 . Utiliza endonucleasas homing (HEs) que reconocen largas secuencias de ADN. Como los sitios de reconocimiento de HE rara vez existen en secuencias de ADN naturales, el estándar iBrick puede ser usado para la construcción directa de partes de iBrick sin modificar sus secuencias de ADN. Sin embargo, el estándar de iBrick deja una cicatriz de 21 pb entre las partes de ADN, lo que podría ser la razón de su impopularidad. En los últimos años, las repeticiones palindrómicas cortas intercaladas con intervalos regulares (CRISPR) se ha desarrollado rápidamente 7 , 8 . Entre las proteínas asociadas a CRISPR (Cas), la endonucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes es ahora ampliamente utilizada. En su mayor parte introduce introducciones de doble cadena de ADN (DSB) con extremos romos 9 . En 2015, Zhang y compañeros de trabajo caracterizaron Cpf1 (CRISPR de Prevotella y Francisella 1) por primera vez. Pertenece al sistema de tipo 2 CRISPR-Cas de tipo V y es una endonucleasa guiada por ARN de CRISRP (crRNA) 10 . A diferencia de Cas9, Cpf1 introduce un DSB con un 4 o 5 nt 5 &#39;sobresaliente 10 . Basándose en esta característica, Cpf1 se utilizó para desarrollar un estándar de ensamblaje de ADN, C-Brick 4 . En un vector estándar de C-Brick, cuatro sitios objetivo Cpf1 de T1 / T2 prefijados y T3 / T4 sufijados flanquean las partes biológicas; Esto es similar al estándar BioBrick. Como la escisión de los sitios T2 y T3 pProduce extremos pegajosos complementarios, es posible realizar el montaje iterativo de partes de ADN mientras se genera una cicatriz &quot;GGATCC&quot; entre las partes. Cabe destacar que el estándar C-Brick tiene dos ventajas principales: reconocer secuencias largas de blanco y dejar cicatrices cortas. La cicatriz de 6 pb &quot;GGATCC&quot; generada por C-Brick codifica Gly-Ser, que permite la construcción de proteínas de fusión. Además, el estándar C-Brick es también parcialmente compatible con los estándares BglBrick y BioBrick.

<table><tbody><tr><td>Comercial Oligonucleotide</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Taq PCR Buffer</td><td>Transgen</td><td>#J40928</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>5x RNA Transcription Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0441</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EP0111</td><td></td></tr><tr><td>NTP mixture</td><td>Sangon</td><td>#ND0056</td><td></td></tr><tr><td>RRI (Recombinant RNase Inhibitor)</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nano-Drop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>2x Phanta Max Buffer</td><td>Vazyme</td><td>PB505</td><td>PCR buffer</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Transgen</td><td>AD101</td><td></td></tr><tr><td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Vazyme</td><td>P505-d1</td><td></td></tr><tr><td>Ezmax for One-step Cloning</td><td>Tolobio</td><td>24303-1</td><td>seamless assembly kit</td></tr><tr><td>5x Buffer for Ezmax One-step Cloning</td><td>Tolobio</td><td>32006</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>#R0136L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>#R3136L</td><td></td></tr><tr><td>BglII&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>#R0144L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>#R0145L</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>NEB</td><td>#R3133L</td><td></td></tr><tr><td>10x Buffer 3</td><td>NEB</td><td>#B7003S</td><td></td></tr><tr><td>10x CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase Buffer</td><td>Tolobio</td><td>32002</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Tolobio</td><td>32206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Tolobio</td><td>32210</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>#R01762</td><td></td></tr><tr><td>SV Gel and PCR clean-up system</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Mini Kit I</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>plasmid preparation kit</td></tr><tr><td>thermosensitive alkaline phosphatase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EF0651</td><td>FastAP</td></tr><tr><td>10x Cpf1 buffer</td><td>Tolobio</td><td>32008</td><td></td></tr><tr><td>Cpf1</td><td>Tolobio</td><td>32105</td><td>FnCpf1</td></tr><tr><td>thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>veriti 96 well</td><td></td></tr><tr><td>C-Brick standard vector</td><td>Tolobio</td><td>98101</td><td></td></tr><tr><td>E. coli [DH10B]</td><td>Invitrogen</td><td>18297010</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani media (tryptone)</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani media (yeast extract)</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani media (NaCl)</td><td>Sangon Biotech</td><td>B126BA0007</td><td></td></tr></tbody></table>

protocols for c-brick dna standard assembly using cpf1

La proteína Cpf1 asociada a CRISPR cliva ADN de doble cadena bajo la guía de ARN CRISPR (CRRNA), generando extremos pegajosos. Debido a esta característica, Cpf1 se ha utilizado para el establecimiento de un estándar de ensamblaje de ADN llamado C-Brick, que tiene la ventaja de sitios de reconocimiento largos y cicatrices cortas. En un vector estándar de C-Brick, hay cuatro sitios de reconocimiento Cpf1 - el prefijo (sitios T1 y T2) y el sufijo (sitios T3 y T4) - partes flanqueantes de ADN biológico. La escisión de los sitios T2 y T3 produce extremos pegajosos complementarios, que permiten el ensamblaje de partes de ADN con sitios T2 y T3. Mientras tanto, se genera una cicatriz corta &quot;GGATCC&quot; entre las piezas después del montaje. Como el plásmido recién formado contiene de nuevo los cuatro sitios de escisión de Cpf1, el método permite el ensamblaje iterativo de partes de ADN, que es similar a las de los patrones de BioBrick y BglBrick. Un procedimiento que describe el uso de la norma C-Brick para ensamblar partes de ADNSe describe aquí. El estándar de C-Brick puede ser ampliamente utilizado por científicos, estudiantes de posgrado y de pregrado, e incluso aficionados.

<html> Este protocolo demostró el ensamblaje de tres casetes de cromoproteína (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012), y amilGFP (BBa_K592010)). En primer lugar, las secuencias codificantes de los tres genes y terminadores mencionados anteriormente se clonaron individualmente en un vector estándar de C-Brick. Partes cortas de ADN, promotor y terminador, se introdujeron en el vector C-Brick mediante amplificación por PCR usando cebadores que contenían las partes cortas de ADN en ...

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Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

La proteína Cpf1 asociada con CRISPR puede ser guiada por un ARN CRISPR (crRNA) especialmente diseñado para escindir ADN de doble hebra en los sitios deseados, generando extremos pegajosos. Basándose en esta característica, se estableció un estándar de ensamblaje de ADN (C-Brick), y se describe aquí un protocolo que detalla su uso.

Protocolos para el ensamblaje estándar de ADN de C-Brick usando Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

8.2K vistas.  Chinese Academy of Sciences.  La proteína Cpf1 asociada con CRISPR puede ser guiada por un ARN CRISPR (crRNA) especialmente diseñado para escindir ADN de doble hebra en los sitios deseados, generando extremos pegajosos. Basándose en esta característica, se estableció un estándar de ensamblaje de ADN (C-Brick), y se describe aquí un protocolo que detalla su uso. 

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A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Un juego de herramientas para la conversión de hidrocarburos en ambientes acuosos

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Investigación

Bioingeniería

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic engineering became applicable to a large range of systems. Moreover, many transcriptional and epigenomic engineering approaches are now generally feasible for the first time. One reason for the broad applicability of CRISPR lies in its bipartite nature. Small gRNAs determine the genomic targets of the complex, variants of the protein Cas9, and the local molecular consequences. However, many CRISPR approaches depend on the simultaneous delivery of multiple gRNAs into individual cells. Here, we present a customizable protocol for string assembly gRNA cloning (STAgR), a method that allows the simple, fast and efficient generation of multiplexed gRNA expression vectors in a single cloning step. STAgR is cost-effective, since (in this protocol) the individual targeting sequences are introduced by short overhang primers while the long DNA templates of the gRNA expression cassettes can be re-used multiple times. Moreover, STAgR allows single step incorporation of a large number of gRNAs, as well as combinations of different gRNA variants, vectors and promoters.

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

Here, we present string assembly gRNA cloning (STAgR), a method to easily multiplex gRNA vectors for CRISPR/Cas9 approaches. STAgR makes gRNA multiplexing simple, efficient and customizable.

Un protocolo adaptable para cadena montaje gRNA clonación (fantasía STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Genética

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

Motivos de ADN estable, 1D y 2D nanoestructuras construyen a partir de moléculas de ADN Circular pequeño

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Química

Captura de la conformación cromosómica (3C) para la investigación y la docencia de pregrado

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

Autor destacado: Obtener una A con las 3C: Captura de la conformación cromosómica para estudiantes universitarios  

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 &#176;C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatizado de montaje robotizada manipulación líquido de dispositivos modulares de la DNA

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Biología

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure. Each chromosome occupies a specific territory, that may change according to stage of development or cell cycle. Gene expression can occur in specialized transcriptional factories where chromatin segments may loop out from various chromosome territories, leading to co-localization of DNA segments which may exist on different chromosomes or far apart on the same chromosome. The Associated Chromosome Trap (ACT) assay provides an effective methodology to identify these long-range DNA associations in an unbiased fashion by extending and modifying the chromosome conformation capture technique. The ACT assay makes it possible for us to investigate mechanisms of transcriptional regulation in trans, and can help explain the relationship of nuclear architecture to gene expression in normal physiology and during disease states.

The associated chromosome trap (ACT) assay is a novel unbiased method for identifying long-range DNA interactions. The characterization of long range DNA interactions will allow us to determine the relationship of nuclear architecture to gene expression in both normal physiology and in diseased states.

Cromosómicas asociadas trampa para la identificación de largo alcance Interacciones ADN

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

Protocolos para el ensamblaje estándar de ADN de C-Brick usando Cpf1

Resumen

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Un juego de herramientas para la conversión de hidrocarburos en ambientes acuosos

Un protocolo adaptable para cadena montaje gRNA clonación (fantasía STAgR)

Motivos de ADN estable, 1D y 2D nanoestructuras construyen a partir de moléculas de ADN Circular pequeño

Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

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Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

Automatizado de montaje robotizada manipulación líquido de dispositivos modulares de la DNA

Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

Cromosómicas asociadas trampa para la identificación de largo alcance Interacciones ADN