Estos métodos permiten una evaluación rápida de si una manipulación experimental, una proteína causante de la enfermedad o un ARN pueden afectar los procesos sinápticos, y si los compuestos terapéuticos pueden restaurar la función. Estas técnicas proporcionan una lectura confiable de la función sináptica de un grupo de neuronas en un período de tiempo relativamente corto en comparación con la electrofisiología. Este protocolo se puede aplicar a cualquier enfermedad del desarrollo o degeneración neuronal.
Esto funciona bien para cultivos neuronales primarios de roedores y para neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas. Para comenzar, optimice la configuración de adquisición de imágenes utilizando el software de adquisición de imágenes confocales. Mantenga constante el tiempo de exposición de la potencia de excitación, la ganancia del detector y la velocidad de fotogramas en todas las muestras.
Para las imágenes de lapso de tiempo, seleccione una relación de aspecto de 512 por 512 y una velocidad de fotogramas de dos imágenes por segundo para minimizar el blanqueamiento del tinte. A continuación, seleccione las combinaciones de excitación por fluorescencia, dicroico y filtro de emisión para GCaMP seis M/GCaMP tres con Fitzy y tinte estearoil con Trixi. Para evitar la deriva Z durante las imágenes de lapso de tiempo, utilice la función de enfoque perfecto del software de adquisición de imágenes confocales.
A continuación, seleccione la pestaña de hora en el panel de adquisición de imágenes. Para la fase uno, establezca un intervalo de 500 milisegundos y una duración de tres a cinco minutos. Y para la fase dos, establezca el intervalo de 500 milisegundos y la duración, cinco minutos.
Luego, para ensamblar el aparato de perfusión por gravedad para líquido cefalorraquídeo artificial o ACSF, cargue el tampón ACSF de cloruro de potasio alto en una jeringa de 50 mililitros en la parte superior del aparato y ajuste la velocidad de flujo a un mililitro por minuto. Luego, cargue un plato de vidrio de 35 mililitros que contenga neuronas en la etapa de imagen confocal con el extremo del tubo de perfusión colocado en el borde del plato y elija el campo para la obtención de imágenes. 48 horas después de la transfección, incubar las neuronas corticales o motoras primarias en un tampón ACSF bajo en cloruro de potasio durante 10 minutos a 37 grados centígrados.
Luego retire el tampón por aspiración y usando una pipeta, cargue las neuronas en la oscuridad en una placa de Petri con fondo de vidrio llena de ACSF que contiene cloruro de potasio 50 milimolares y 10 colorantes de espirilo micromolar. Después de cinco minutos, retire la solución de carga y bañe las neuronas en un tampón ACSF bajo en cloruro de potasio a 37 grados Celsius durante 10 minutos para eliminar la carga de tinte inespecífica. Luego coloque el plato en la etapa de imágenes del microscopio confocal invertido y observe las células bajo un objetivo de aire 20 veces o un objetivo de inmersión de aceite 40 veces.
Excite el tinte de acero con un láser de 546 nanómetros y recoja la emisión utilizando un filtro de paso de banda de 570 a 620 nanómetros. Después de seleccionar el campo de imagen y el enfoque perfecto, tome una sola imagen fija con campo brillante, Trixi y canales marcadores de fluorescencia para marcar los límites neuronales. Luego inicie Run Now en el software de adquisición y realice el registro basal durante tres a cinco minutos para excluir las variaciones en la intensidad del tinte.
Justo en el cambio a la fase dos, active el botón de encendido para el sistema de perfusión y perfunda constantemente cloruro de potasio milimolar 50 a las neuronas para facilitar la descarga del tinte. Realice las grabaciones durante cinco minutos y luego active el interruptor de apagado para el sistema de perfusión. Guarde el experimento para el análisis de datos más tarde utilizando el software confocal.
48 horas después de la transfección con GCaMP seis M, incubar las neuronas corticales primarias de roedores con bajo contenido de cloruro de potasio ACSF durante 15 minutos. Luego monte el plato en la plataforma de imágenes y visualice la fluorescencia GCaMP de seis M utilizando un filtro Fitzy y un objetivo de 20 veces o 40 veces. Después de seleccionar el campo de imagen y el enfoque perfecto atractivo, tome una sola imagen fija con canales de marcadores de campo brillante, Fitzy y fluorescencia para marcar los límites neuronales.
A continuación, inicie Run Now en el software de adquisición y realice la grabación basal durante tres a cinco minutos. Luego perfunda ACSF que contiene cloruro de potasio 50 milimolar a las neuronas como se demostró anteriormente y registre durante cinco minutos. Cuando se detenga la adquisición de la imagen, guarde el experimento y proceda al análisis de datos utilizando el software confocal.
Para el análisis de imágenes, abra las imágenes de lapso de tiempo en el software confocal y alinee las imágenes haciendo clic en Imagen, seguido de procesamiento, seguido de alinear documento actual y, a continuación, seleccione Alinear con el primer fotograma. Seleccione las regiones de interés a lo largo de las neuritas utilizando la herramienta de selección de ROI y también marque un ROI que represente la intensidad de fluorescencia de fondo. A continuación, inicie la función de medición desde el panel de medición de tiempo para medir la fluorescencia bruta a lo largo del tiempo para los ROI seleccionados.
Después de la medición, exporte las intensidades de fluorescencia en bruto al software de hoja de cálculo. Aquí se muestran las neuronas corticales primarias de rata cultivadas cargadas con colorante de estirilo. La especificidad de la carga del colorante se determinó mediante el coetiquetado con el marcador de vesícula sináptica sinaptofisina y la mayoría de los puntos positivos de colorante estéril son copositivos para este marcador.
El análisis de los valores de intensidad bruta durante todo el período de imagen revela que la sinaptofisina y la intensidad permanecen constantes, mientras que la intensidad del tinte de estirilo disminuye después de la estimulación. Para las neuronas de control transfectadas por proteínas fluorescentes verdes, la liberación exitosa de vesículas sinápticas resultó en la sorprendente pérdida de fluorescencia del colorante tras una alta despolarización de cloruro de potasio. Este video representativo muestra una neurona descargando selectivamente el tinte de estirilo en una nueva región derecha después de la estimulación.
En contraste, en las neuronas transfectadas con un C nueve ORF 72 vinculado a la construcción de repetición del péptido de colorante a GA 50, la transmisión sináptica deteriorada está representada por la fluorescencia del colorante retenida incluso después de una alta despolarización de cloruro de potasio. Aquí se muestran imágenes representativas de fluorescencia de neuronas corticales transfectadas con GCaMP seis M antes y después de la despolarización del cloruro de potasio. El aumento de los valores de fluorescencia y las neuronas corticales transfectadas con GCaMP seis M indican la entrada de calcio en las neuritas después de la despolarización inducida por cloruro de potasio.
Al final del período de registro basal, las neuronas expresaron GCaMP seis M con una baja fluorescencia. Luego se observa un aumento dramático de la fluorescencia al comienzo de la estimulación. Asegúrese de que los registros de referencia de fluorescencia para el tinte de estirilo y GCaMP sean estables.
Siempre use un enfoque perfecto para evitar la deriva de la imagen, lo que haría que el procesamiento de datos de imágenes posteriores sea un desafío. No se recomienda un mayor cultivo de neuronas, ya que los platos se exponen al aire durante la profusión. Sin embargo, la inmunomantación o la extracción de proteínas o ARN pueden evaluar las posibles causas de las alteraciones sinápticas.
