Cis-regulatorische Elemente wie Promotoren und Enhancer sind Schlüsselfaktoren für die Genexpression. Herkömmliche Ansätze zur Untersuchung dieser Elemente sind mühsam und beinhalten oft die Verwendung heterologer Reportergene. Hier zeigen wir den Einsatz von CRISPR zur Untersuchung der Transkriptionsrolle eines RUNX1 intronic Schalldämpfers in der Leukämie-Zelllinie.
Das Protokoll ist einfach durchzuführen und ermöglicht schnelle Bewertungen von Genregulierungsfunktionen im endogenen Genkontext. Hämatopoetische Zellen sind oft schwer mit einem Plasmid-basierten Methoden zu transfekieren. In diesem Protokoll verwenden wir die Elektroporation, um vormontierte Cas9, Führungs-RNA, Komplexe in die Zellen zu liefern.
Zu den Vorteilen dieses Ansatzes gehören die Nutzung einer verbesserten Bearbeitungseffizienz und Zelllebensfähigkeit sowie reduzierte Off-Target-Effekte. Auch die nachfolgende Verwendung der Fragmentanalyse ermöglicht ein einfaches und schnelles Screening der gewünschten mutierten Klone aus einer großen Anzahl von Proben. Demonstriert wird das Verfahren von Yuk-Lin Yung, Techniker für mein Labor.
Beginnen Sie mit dem Entwerfen von zwei CRISPR RNAs, einem fünf Prim- und dem anderen drei Primzahlelement des Ziel-cis-regulatorischen Elements (CRE). Stellen Sie sicher, dass sich ein PAM von NGG unmittelbar unterhalb der Zielsequenz für die Cas9-Erkennung befindet. Um den gRNA-Komplex zu bilden, kombinieren Sie die CRISPR-RNA und die Tracer-RNA im TE-Puffer nach Manuskriptanweisungen für eine endgültige Duplexkonzentration von 44 Mikromolaren.
Inkubieren Sie die Mischung bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen. Verdünnen Sie die rekombinante Cas9-Nuklease mit PBS für eine endgültige Nukleasekonzentration von 36 Mikromolaren. Mischen Sie dann ein gleiches Volumen der verdünnten Nuklease mit jedem der gRNA-Duplexe und inkubieren Sie sie für 20 Minuten bei Raumtemperatur, damit sich der RNP-Komplex bilden kann.
Zentrifugieren Sie 2,5 Millionen Zellen in einem 1,5 Milliliter-Rohr bei 500 mal g für fünf Minuten. Dann entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 163 Mikroliter rpMI 1640 Medium ohne Phenolrot. Fügen Sie 16,7 Mikroliter des RNP-Komplexes und 3,6 Mikroliter 100 mikromolareElektroporationsverstärker zu den Zellen hinzu und übertragen Sie das Gemisch auf eine 0,2 Zentimeter lange Elektroporationsküvette, wobei darauf geachtet wird, keine Blasen einzuführen.
Elektroporate die Zellen und übertragen sie in einen T-25 Gewebekulturkolben mit 6 Milliliter nkompletten RPMI 1640 Medium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Einen Tag nach der Elektroporation verdünnen Sie die Zellen auf 5000 Zellen pro Milliliter in komplettem RPMI 1640 Medium.
Und fügen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in jeden Brunnen einer 96-Well-Gewebekulturplatte hinzu. Kultur die Zellen für sieben bis 14 Tage dann extrahieren genomische DNA mit einem Hochdurchsatz-Reinigungssystem. Fügen Sie 100 Mikroliter Plattenbindung und Lysepuffer zu jedem Brunnen einer 96-welled Extraktionsplatte hinzu, gefolgt von 50.000 Zellen, die in 10 Mikroliter PBS wieder aufgehängt werden.
Mischen Sie den Brunneninhalt, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit sich die genomische DNA an die Brunnen binden kann. Dann die Lösung vorsichtig aus den Brunnen absaugen und mit 120 Mikroliter Waschpuffer waschen.
Luft trocknen Sie die Platte. Fügen Sie 20 Mikroliter PCR-Mix zu jedem Brunnen und pcR nach Manuskript Richtungen laufen. Sobald die Verstärkung abgeschlossen ist, schätzen Sie die Menge des Produkts, indem Sie die Konzentration einer ausgewählten Anzahl von Proben mit einem Fluorometer messen.
Alle Proben mit nukleasefreiem Wasser auf 0,5 Nanogramm pro Mikroliter verdünnen. Mischen Sie einen Mikroliter des verdünnten PCR-Produkts mit 8,5 Mikroliter entionisiertem Formamid und 0,5 Mikroliter fluoreszierenden Farbfarb-markierten Größenstandard in einem 96-Well-Plat-Kompatiblen mit dem genetischen Analysator. Bedecken Sie die Platte mit einer Plattensepta und denaturieren Sie die Proben bei 95 Grad Celsius für drei Minuten in einem Thermocycler.
Führen Sie die Kapillarelektrophorese durch, um die beschrifteten PCR-Produkte zu trennen und die Ergebnisse der Analysesoftware zu analysieren. Überprüfen Sie das orangefarbene Symbol, um die beschrifteten Fragmente und den Größenstandard anzuzeigen, um die Qualität des Aufrufs der Größe zu bewerten. Überprüfen Sie dann das blaue Symbol, um die beschrifteten PCR-Produkte anzuzeigen.
Identifizieren Sie die Spitzen, die Wildtyp- und Mutantenprodukten entsprechen, und schätzen Sie den Mutantengehalt in jeder Probe, indem Sie die Fläche unter dem mutierten Gipfel durch die Summe der Fläche unter den Wildtyp- und Mutantenspitzen dividieren. Wählen Sie mehrere Zellpools mit hohen Mengen der erwarteten Löschungen für weitere serielle Verdünnungen aus. Wiederholen Sie die Schritte zur DNA-Extraktion, fluoreszierenden PCR und Kapillarelektrophorese und wählen Sie Klone mit Mutantenvonatagen von mehr als 95 % für die nachfolgende Analyse aus.
Extrahieren Sie die gesamte RNA aus den ausgewählten Klonen und führen Sie eine kostenlose DNA-Synthese durch. Mischen Sie die RNA mit einem Poly-T-Primer und dNTPs nach Manuskriptrichtungen und brüten bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten. Dann legen Sie die Reaktion mindestens eine Minute lang auf Eis.
Fügen Sie der Reaktion zehn Mikroliter cDNA-Synthesemix hinzu. Dann inkubieren Sie die Probe bei 50 Grad Celsius für 50 Minuten und 85 Grad Celsius für fünf Minuten in einem Thermocycler. Nach der cDNA-Synthese die Proben mit einem Mikroliter RNase H behandeln und bei 37 Grad Celsius 20 Minuten lang bebrüten.
Designprimer und TaqMan-Sonden speziell für einzelne Transkriptvarianz, die von alternativen Promotoren erzeugt werden, und klonen die DNA-Fragmente, die die spezifischen Transkriptsequenzen enthalten, in die Plasmid-DNA. Erstellen Sie eine zehnfache Verdünnungsreihe der rekombinanten Plasmide als Standardkurven für die Transkriptquantifizierung. Bereiten Sie 20 Mikroliter PCR-Mix für jede Probe vor und führen Sie die Echtzeit-PCR nach Manuskriptanweisungen aus.
Analysieren Sie die Ergebnisse und normalisieren Sie die Kopiernummer der Zieltranskripte in jeder Probe mit einem Housekeeping-Gen. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um den intronischen Schalldämpfer RUNX1 zu löschen und die Deletion wurde mit Kapillargelelektrophorese bestätigt. Die erwarteten Größen der Wildtyp- und Mutanten-PCR-Produkte betragen etwa 500 Basenpaare bzw. 230 Basenpaare.
Die Größe der mutierten Produkte kann zwischen den Klonen variieren, da sich an den Spaltstellen Einlegestellen gebildet haben. Sanger-Sequenzierung wurde verwendet, um die Identität der Löschungen zu bestätigen. Das RUNX1-Gen enthält zwei Promotoren, P1 und P2, die drei große mRNA-Transkripte produzierten: RUNX1c von P1 und RUNX1a und RUNX1b von P2. Die quantitative PCR in Echtzeit kann verwendet werden, um zu bestimmen, wie sich das Löschen des Schalldämpferelements auf die Expression dieser Transkripte auswirkt.
Ein gutes Design von CRISPR RNAs ist wichtig für die Bewertung des Experiments. Stellen Sie sicher, dass die CRSIPR-RNA eng an den vorgesehenen Löschbereich gebunden ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass sich eine PAM-Sequenz nach der Zielsequenz für die Cas9-Erkennung befindet.
Neben der Untersuchung von CREs kann diese Strategie für Gen-Standortstudien verwendet werden und dient als Alternative zu RNA-Interferenzen, um Genfunktionen zu untersuchen. Durch die Kombination mit Chromosomenkonformationserfassungstechniken wird CRISPR sicherlich dazu beitragen, die Beteiligung von CREs an der veränderten Genomorganisation und Genexpression im Zusammenhang mit verschiedenen Gesundheitsproblemen wie Krebs zu entschlüsseln.
