프로모터 및 증강과 같은 Cis 조절 요소는 유전자 발현의 주요 결정요인입니다. 이 요소를 연구하는 전통적인 접근은 힘들고 수시로 이종기자 유전자의 사용을 관련시킵니다. 여기서 우리는 백혈병 세포주에서 RUNX1 내성 소음기의 전사 적 역할을 검사하기 위해 CRISPR의 사용을 시연합니다.
프로토콜은 수행하기 쉽고 내인성 유전자 컨텍스트에서 유전자 조절 기능의 빠른 평가를 허용합니다. 조혈 세포는 종종 플라스미드 기반 방법으로 횡단하기가 어렵습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 전분해 된 Cas9, 가이드 RNA, 세포로 복합체를 제공하기 위해 전기 포공을 사용합니다.
이 방법의 장점은 향상된 편집 효율성과 세포 생존력뿐만 아니라 감소된 오프 타겟 효과의 사용을 포함합니다. 또한, 단편 해석의 후속 사용은 많은 양의 샘플에서 원하는 돌연변이 클론의 간단하고 빠른 검사를 가능하게한다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 기술자 인 육린 영 (Yuk-Lin Yung)이 될 것입니다.
먼저 두 개의 CRISPR RNA, 1개의 프라임 및 대상 시스 규제 요소 또는 CRE의 다른 3개의 프라임을 설계하는 것으로 시작합니다. NGG의 PAM이 Cas9 인식을 위해 대상 시퀀스의 바로 다운스트림에 있는지 확인합니다. gRNA 복합체를 형성하기 위해, 44 마이크로몰러의 최종 이중 농도를 위해, 원고 방향에 따라 TE 버퍼에 CRISPR RNA와 트레이서 RNA를 결합한다.
혼합물을 섭씨 95도에서 5분간 배양하여 실온으로 식힙니다. 36 마이크로몰라의 최종 뉴클레아제 농도를 위해 PBS로 재조합 Cas9 뉴클레아제를 희석한다. 그런 다음 각 gRNA 이중과 희석 된 뉴클레아제의 동일한 부피를 혼합하고 RNP 복합체가 형성 될 수 있도록 실온에서 20 분 동안 배양합니다.
원심분리기 250만 개의 세포는 5분 동안 500배 g에서 1.5 밀리리터 튜브에 있습니다. 그런 다음 상체를 버리고 페놀 레드 없이 RPMI 1640 배지의 163 마이크로리터에서 세포를 다시 중단한다. RNP 복합체의 16.7 마이크로리터와 100 마이크로몰러 전기기 증강제의 3.6 마이크로리터를 세포에 추가하고 혼합물을 0.2센티미터 간격 의 전기 기화 큐벳으로 옮기고, 어떤 거품도 도입하지 않도록 주의한다.
세포를 전기화하고 완전한 RPMI 1640 배지의 6 밀리리터를 포함하는 T-25 조직 배양 플라스크로 이송한다. 37°C의 세포에 5%의 이산화탄소를 증식합니다. 전기기화 후 하루, 완전한 RPMI 1640 배지에서 밀리리터 당 5000 세포로 세포를 희석시.
그리고 96웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액의 100 마이크로리터를 추가합니다. 7 일에서 14 일 동안 세포를 배양한 다음 고처리량 정화 시스템을 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다. 96웰 추출 플레이트의 각 웰에 플레이트 결합 및 용해 버퍼 100마이크로리터를 추가하고, 그 다음에 는 PBS 의 10 마이크로리터에서 50, 000 세포가 다시 매달려 있습니다.
위아래로 피펫팅하여 우물 내용을 섞는다. 유전체 DNA가 우물에 결합할 수 있도록 30분 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 조심스럽게 우물에서 용액을 흡인하고 세척 버퍼 의 120 마이크로 리터로 씻어.
접시를 건조. 각 웰에 PCR 믹스 20 마이크로리터를 추가하고 원고 지침에 따라 PCR을 실행합니다. 증폭이 완료되면, 불소계를 가진 선택한 수의 샘플의 농도를 측정하여 제품의 양을 추정한다.
모든 샘플을 미세 리터 당 0.5 나노그램으로 희석하여 뉴클레아제 프리 워터를 사용하여 희석합니다. 희석된 PCR 제품의 마이크로리터 1개를 탈이온화된 포름아미드 8.5 마이크로리터와 유전 분석기와 호환되는 96웰 플랫에 형광염 염료 라벨 크기 표준 0.5 마이크로리터를 혼합합니다. 플레이트 패시파로 플레이트를 덮고 온도 순환기에서 3 분 동안 섭씨 95도에서 샘플을 변성하십시오.
모세관 전기포고를 수행하여 표지된 PCR 제품을 분리하고 분석 소프트웨어에서 결과를 분석합니다. 주황색 아이콘을 확인하여 레이블이 표시된 조각과 크기 표준을 확인하여 크기 호출의 품질을 평가합니다. 그런 다음 파란색 아이콘을 확인하여 레이블이 지정된 PCR 제품을 확인합니다.
야생 형 및 돌연변이 제품에 해당하는 피크를 식별하고 야생 유형 및 돌연변이 피크 아래 영역의 합계로 돌연변이 피크 아래 영역을 분할하여 각 샘플의 돌연변이 레벨을 추정합니다. 추가 직렬 희석을 위해 예상되는 삭제 수준이 높은 여러 셀 풀을 선택합니다. DNA 추출, 형광 PCR 및 모세관 전기 포근 단계를 반복하고 후속 분석을 위해 돌연변이 수준이 95 % 이상인 클론을 선택합니다.
선택한 클론에서 총 RNA를 추출하고 무료 DNA 합성을 수행합니다. 원고 방향에 따라 RNA를 폴리-T 프라이머 및 dNTP와 혼합하고 5 분 동안 섭씨 65도에서 배양하십시오. 그런 다음, 적어도 1 분 동안 얼음에 반응을 배치합니다.
반응에 cDNA 합성 믹스의 10 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 온도 50도에서 50분, 온도 85도에서 5분간 시료를 배양하여 열순환기에서 5분간 배양합니다. cDNA 합성 후, RNase H의 마이크로 리터 1개로 샘플을 치료하고 20분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.
설계 프라이머와 TaqMan 프로브는 특히 대체 프로모터에서 생성된 개별 성적증명서 차이를 위해 프로브하고 특정 성적증명서 서열을 포함하는 DNA 단편을 플라스미드 DNA로 복제한다. 재조합 플라스미드의 10배 희석 시리즈를 성적증명서 정량화를 위한 표준 곡선으로 만듭니다. 각 샘플에 대해 PCR 믹스 20마이크로리터를 준비하고 원고 방향에 따라 실시간 PCR을 실행합니다.
결과를 분석하고 가사 유전자를 사용하여 각 샘플의 표적 성적증명서의 카피 수를 정규화한다. 이 프로토콜은 RUNX1 내성 소음기를 삭제하는 데 성공적으로 사용되었으며 모세관 젤 전기포고로 삭제가 확인되었습니다. 야생형 및 돌연변이 PCR 제품의 예상 크기는 각각 약 500개의 기본 쌍과 230개의 기본 쌍입니다.
돌연변이 제품의 크기는 분열 부위에 형성된 인델 때문에 클론마다 다를 수 있다. Sanger 시퀀싱은 삭제의 신원을 확인하는 데 사용되었습니다. RUNX1 유전자에는 P1에 의한 RUNX1c, P2에 의한 RUNX1a 및 RUNX1b: 3개의 주요 mRNA 성적증명서를 생산한 두 개의 프로모터, P1 및 P2가 포함되어 있습니다. 실시간 정량적 PCR을 사용하여 소음기 요소의 삭제가 이러한 성적증명서의 발현에 미치는 영향을 확인할 수 있습니다.
CRISPR RNA의 좋은 디자인은 실험평가에 중요합니다. CRSIPR RNA가 의도된 삭제 부위에 밀접하게 포장되어 있는지 확인합니다. 또한 PAM 시퀀스가 Cas9 인식을 위한 대상 시퀀스의 하류에 위치하고 있는지 확인합니다.
CREs를 공부하는 것 외에도, 이 전략은 유전자 위치 연구 결과를 위해 이용될 수 있고 유전자 기능을 검토하기 위하여 RNA 간섭에 대한 대안으로 봉사할 수 있습니다. 염색체 변형 포획 기술과 결합하여 CRISPR은 확실히 암같이 각종 건강 문제에 연결된 변경한 게놈 조직 및 유전자 발현에 있는 CREs의 연루를 해독하는 것을 도울 것입니다.
