אלמנטים Cis-רגולטוריים כמו מקדמים משפרי הם הקובעים העיקריים של ביטוי גנים. גישות מסורתיות לחקר אלמנטים אלה הן מייגע ולעתים קרובות כרוך בשימוש בגנים כתב הטרולוגי. כאן אנו מדגימים את השימוש ב- CRISPR כדי לבחון את תפקידו התמלולי של משתיק בלתי טרון RUNX1 בקו תא לוקמיה.
הפרוטוקול הוא פשוט לבצע ומאפשר הערכות מהירות של פונקציות רגולטוריות גנים בהקשר הגנים אנדוגני. תאים hematopoietic הם לעתים קרובות קשה לשנות עם שיטות מבוססות פלסמיד. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים באלקטרופוזיה כדי לספק Cas9 מורכב מראש, מדריך RNA, קומפלקסים לתוך התאים.
היתרונות של גישה זו כוללים שימוש ביעילות עריכה משופרת וכדאיות התא, כמו גם אפקטים מחוץ ליעד מופחת. כמו כן, השימוש הבא בניתוח שברים מאפשר סינון פשוט ומהיר של שיבוטי המוטנטים הרצויים מכמות גדולה של דגימות. הדגמת ההליך תהיה יוק-לין יונג, טכנאי למעבדה שלי.
התחל בתכנון שני RNAs CRISPR, אחד חמישה ראשוניים ושלושת הפריים השני של רכיב cis-תקינה היעד, או CRE. ודא כי PAM של NGG ממוקם מיד במורד הזרם של רצף היעד עבור זיהוי Cas9. כדי ליצור את קומפלקס gRNA, שלב את ה- CRISPR RNA ואת ה- RNA של המעקב במאגר TE בהתאם לכיווני כתב היד, לריכוז דופלקס סופי של 44 מיקרומולרים.
הדגירה את התערובת ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר. לדלל את גרעין Cas9 רקומביננטי עם PBS עבור ריכוז גרעין סופי של 36 מיקרומולר. לאחר מכן מערבבים נפח שווה של הגרעין המדולל עם כל אחד מדופלקסים gRNA ו דגירה אותם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את קומפלקס RNP להיווצר.
צנטריפוגה 2.5 מיליון תאים בצינור 1.5 מיליליטר ב 500 פעמים g במשך חמש דקות. ואז להשליך את supernatant מחדש להשעות את התאים 163 microliters של RPMI 1640 בינוני ללא פנול אדום. הוסף 16.7 microliters של קומפלקס RNP ו 3.6 microliters של 100 מיקרומולרי אלקטרופוזיה משפר לתאים ולהעביר את התערובת 0.2 ס"מ-פער אלקטרופורציה cuvette, דואג לא להציג בועות.
אלקטרופולטורה התאים ולהעביר אותם לבקבוק תרבות רקמה T-25 המכיל 6 מיליליטר של מדיום RPMI מלא 1640. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני. יום אחד לאחר אלקטרופורציה, לדלל את התאים ל 5000 תאים למיליליטר במדיום RPMI 1640 מלא.
ולהוסיף 100 microliters של ההשעיה התא לתוך כל באר של צלחת תרבות רקמות 96 היטב. תרבות התאים במשך שבעה עד 14 ימים ואז לחלץ DNA גנומי באמצעות מערכת טיהור תפוקה גבוהה. הוסף 100 microliters של לוח מחייב מאגר תזה לכל באר של צלחת מיצוי 96-welled, ואחריו 50, 000 תאים מושעה מחדש ב 10 microliters של PBS.
מערבבים את תכולת הבאר על ידי צינור למעלה ולמטה. להדגרת הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות כדי לאפשר לדנ"א הגנומי להיקשר ל הבארות. לאחר מכן בזהירות שאפו את הפתרון מה בארות ולשטוף אותם עם 120 microliters של חיץ לשטוף.
האוויר מייבש את הצלחת. הוסף 20 microliters של PCR לערבב לכל באר ולהפעיל PCR על פי הוראות כתב יד. לאחר השלמת ההגברה, להעריך את כמות המוצר על ידי מדידת הריכוז של מספר נבחר של דגימות עם פלואורומטר.
לדלל את כל הדגימות ל 0.5 ננוגרם למיקרוליטר עם מים חופשיים גרעין. יש לערבב מיקרוליטר אחד של מוצר PCR מדולל עם 8.5 מיקרוליטרים של נוקאמידים לא מיומנים ו-0.5 מיקרוליטרים של תקן גודל פלורסנט המסומן בצבע בפלטה של 96 באר התואמת לניתוח הגנטי. מכסים את הצלחת עם septa צלחת denature את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות בתרמוצ'יקה.
בצע אלקטרופורזה נימית כדי להפריד את מוצרי PCR המסווים ולנתח את התוצאות על תוכנת הניתוח. בדוק את הסמל הכתום כדי להציג את הקטעים המסווים ואת תקן הגודל כדי להעריך את איכות הקריאה לגודל. לאחר מכן, בדוק את הסמל הכחול כדי להציג את מוצרי PCR המסווים.
זהה את הפסגות המתאימות למוצרים מסוג בר ומוטנטים והערך את רמת המוטנטים בכל מדגם על ידי חלוקת האזור מתחת לשיא המוטנטים בסכום האזור מתחת לפסגות הבר והמוטנטים. בחר מאגרי תאים מרובים עם רמות גבוהות של המחיקות הצפויות לדילול טורי נוסף. חזור על מיצוי ה- DNA, PCR פלואורסצנטי, שלבי אלקטרופורזה נימי ובחר שיבוטים עם רמות מוטנטים גדולות מ - 95% לניתוח הבא.
לחלץ RNA הכולל מן השיבוטים שנבחרו ולבצע סינתזת DNA משלימה. מערבבים את ה- RNA עם פריימר פולי-טי ו- dNTPs בהתאם לכיווני כתב היד והידגירה ב-65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, מניחים את התגובה על קרח לפחות דקה אחת.
הוסף עשרה microliters של סינתזה cDNA לערבב לתגובה. ואז להדגיר את המדגם ב 50 מעלות צלזיוס במשך 50 דקות ו 85 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות בתרמוצ'יקלר. לאחר סינתזת cDNA, לטפל בדגימות עם microliter אחד של RNase H ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
עיצוב פריימרים ובדיקות TaqMan במיוחד עבור שונות תעתיק בודדים שנוצר מיזמים חלופיים לשכפל את שברי ה-DNA המכילים את רצפי התמליל הספציפיים לתוך DNA פלסמיד. הפוך סדרת דילול פי עשרה של פלסמידים רקומביננטי כמו עקומות סטנדרטיות לכמות תעתיק. הכינו 20 מיקרוליטרים של תערובת PCR לכל דגימה והפעילו את ה-PCR בזמן אמת בהתאם לכיווני כתב היד.
לנתח את התוצאות ולנרמל את מספר העותק של תעתיקי היעד בכל דגימה עם גן משק בית. פרוטוקול זה שימש בהצלחה למחיקת המשתיק האנטרוני RUNX1 והמחיקה אושרה עם אלקטרופורזה של ג'ל נימי. הגדלים הצפויים של מוצרי PCR מסוג פראי ומוטנטים הם כ-500 זוגות בסיסים ו-230 זוגות בסיסים בהתאמה.
גודל המוצרים המוטנטים יכול להשתנות בין השיבוטים בגלל הכופרים שנוצרו באתרי המחשוף. רצף סנגר שימש לאישור זהות המחיקות. הגן RUNX1 מכיל שני מקדמים, P1 ו- P2 אשר ייצרו שלושה תעתיקי mRNA עיקריים:RUNX1c על ידי P1, ו RUNX1a ו RUNX1b על ידי P2. PCR כמותי בזמן אמת יכול לשמש כדי לקבוע כיצד המחיקה של אלמנט משתיק המשפיעים על הביטוי של תעתיקים אלה.
עיצוב טוב של CRISPR RNAs חשוב להערכת הניסוי. ודא ש- CRSIPR RNA ארוז באופן הדוק לאזור המחיקה המיועד. כמו כן, ודא שרצף PAM ממוקם במורד הזרם של רצף היעד עבור זיהוי Cas9.
מלבד לימוד CREs, אסטרטגיה זו יכולה לשמש למחקרי מיקום גנים ומשמשת חלופה להתערבות RNA לבחינת תפקודי גנים. על ידי שילוב עם טכניקות לכידת קונפורמציה כרומוזום CRISPR בהחלט יעזור לפענח את המעורבות של CREs בארגון הגנום שונה ביטוי גנים הקשורים לבעיות בריאותיות שונות כמו סרטן.
