Dieses Video zeigt eine einfache Methode zur parallelen Untersuchung mehrerer Kandidatengene in AML unter Verwendung des Crisper-Cas9-Systems in Kombination mit dem strömungszytometriebasierten Wettbewerbswachstumstest. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie schnell und skalierbar ist. Demonstrieren sie das Verfahren wird Bo Rui Chen, ein Post-Doc aus unserem Labor.
Eine webbasierte CRISPR-Designsoftware wird verwendet, um vier bis sechs einzelne Führungs-RNAs für das Gen von Interesse zu entwerfen. Geben Sie zunächst die entsprechenden Informationen in die Felder mit Sternchen ein. Wählen Sie dann das Zielgenom für das RNA-Design mit einer einzigen Führung aus.
Fügen Sie die Zielsequenz in das Sequenzfeld ein, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Absenden". Zum Klonen im gewünschten Single-Guide-RNA-Expressionsplasmid setzen Die Nukleotide CACC dem Sinnesoglionukleotid und AAAC dem umgekehrten komplementären Antisense-Oligonukleotid voran. Vorgemischte Sinn- und Antisense-Oligonukleotide werden dann bei einer Firma in einer 96-Well-Platte mit der Bezeichnung Oligo Mix bestellt.
Legen Sie eine separate U-Bottom 96 Well Platte mit der Bezeichnung Annealing Plate fest. Bereiten Sie eine Master-Mischung aus einem Mikroliter T4-Polynukleotidkinase, einem Mikroliter 10x T4 DNA-Ligationspuffer und sechs Mikroliter Wasser pro Glühreaktion vor. Fügen Sie 8 Mikroliter der Master-Mischung zu jedem Brunnen der Glühenden Platte hinzu, gefolgt von 2 Mikrolitern vorgemischten Sinnessinns und Antisense-Oligonukleotiden.
Pipette zwei bis dreimal sanft gut zu mischen, und dann drehen Sie die Platte kurz, um die Mischungen auf den Boden der Brunnen zu bekommen. Verwenden Sie das folgende Glühprogramm in einer PCR-Maschine. 37 Grad Celsius für 30 Minuten, 95 Grad Celsius für zwei Minuten und 30 Sekunden, gefolgt von langsamer Abkühlung auf 22 Grad Celsius bei einer Geschwindigkeit von 0,1 Grad Celsius pro Sekunde.
Wenn das Glühen abgeschlossen ist, bereiten Sie eine frische 96 Brunnenplatte mit der Bezeichnung Diluted Oligo Mix vor, indem Sie die phosphorylierten und geglühten Oligonukleotide aus der Glühreaktion eins bis 200 mit Wasser verdünnen. Linearisieren Sie den single guide RNA Expression Vector, indem Sie fünf Mikrogramm des Vektors mit 1,5 Mikroliter n.B. BBS1-Restriktionsenzym verdauen und dabei einen geeigneten Puffer bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden verwenden. Als nächstes nehmen Sie eine frische 96 Well Platte mit der Bezeichnung Ligation Plate, und fügen Sie 20 Nanogramm des BBS1 verdaute Single Guide RNA Expressions Vektor zu einem gut pro gewünschten Single Guide RNA Ligation hinzu.
Dazu 2 Mikroliter phosphorylierte gegonukleotide aus der verdünnten Oligo-Mix-Platte. Fügen Sie zu jedem Brunnen, einen Mikroliter 10X T4 Ligase Puffer, und ein Mikroliter T4 Ligase-Enzym, und sanft Pipette zu mischen. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für zwei Stunden.
Etwa 10 Minuten vor der Ligationsreaktion 90 Mikroliter chemisch kompetenter E.coli-Zellen auf Eis füllen. 10 Mikroliter-Aliquots der zuständigen Zellen einzeln in jeden Brunnen einer separaten 96-Wellplatte übertragen. Fügen Sie die Ligationsmischung in die Brunnen, die die zuständigen Zellen enthalten.
Pipette sanft auf und ab und bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubieren. Pipette fünf Mikroliter der Bakterien DNA mischen aus jeder Transformationsreaktion direkt in einen Brunnen einer 6-Well-Platte, enthält LB Agar mit 100 Milligramm pro Milliliter Ampicillin. Fügen Sie etwa fünf bis acht Glasperlen zu jedem Brunnen hinzu und schütteln Sie die 6 Wellplatte acht- bis zehnmal in einer kreisförmigen Bewegung.
Die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten. Am nächsten Tag, wählen Sie ein bis zwei einzelne Kolonien aus jedem Brunnen, mit einer sterilen 20 Mikroliter Pipettenspitze, und streifen Sie es auf eine beschriftete Stelle auf einer sterilen 10 Zentimeter Petrischale, mit LB Agar und 100 Milligramm pro Milliliter Ampicillin Nach dem Streichen auf die LB-Platte, werfen Sie die Spitze in drei Milliliter Ampicillin Medium in einem 14 Milliliter runden Unterrohr , mit der entsprechenden bakteriellen Klonnummer gekennzeichnet. Die Bakterienplatte wird dann direkt zur Sanger-Sequenzierung geschickt.
Nach einer Sequenzbestätigung der geklonten Single Guide RNAs, reinigen Sie die DNA aus dem entsprechenden 14 Milliliter Rohr, mit einem Miniprep-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Single Guide RNA lentivirale Partikel werden in einem 96-Well-Format produziert, wie im Textprotokoll beschrieben. Und der virale Überstand wird sofort bei minus 80 Grad Celsius eingefroren.
Einen Tag vor der Transduktion von Single Guide RNAs in AML Cas9-Zellen, beschichten Sie eine flache Boden nicht Gewebekultur behandelt 96 Brunnenplatte, mit 100 Milliliter rekombinanten menschlichen Fibronectin-Fragment in einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter. Wickeln Sie die Platte mit Klebefolie, um Verdunstungsverlust zu vermeiden, und lassen Sie es über Nacht auf der Bank. Entfernen Sie am nächsten Tag das rekombinante menschliche Fibronectin-Fragment aus jedem Brunnen der 96-Well-Platte.
Den viralen Überstand jeder einzelnen Führungs-RNA bei Raumtemperatur auftauen. Fügen Sie 50 Mikroliter viralen Überstand aus jedem Rohr zu jedem beschichteten Brunnen der Transduktionsplatte hinzu. Wickeln Sie die Platte mit Klebefolie, um eine mögliche Kontamination während der Zentrifugation zu vermeiden.
Drehen Sie die Platte bei 1, 300 mal g bei 35 Grad Celsius für 90 Minuten. Gegen Ende der Spritzinfektion zählen Sie die hohen Cas9-Ausdrückel-Klon-B3-Zellen aus dem Kulturkolben. Drehen Sie nach dem Zählen die erforderliche Anzahl von Zellen herunter, und setzen Sie sie in frischem Medium wieder auf.
Verwenden Sie nach der 90-minütigen Spritzinfektion eine auf 50 Mikroliter eingestellte Mehrkanalpipette, um den Überstand langsam aus allen Brunnen zu entfernen, indem Sie die Platte kippen. Fügen Sie 100 Mikroliter der Kultur der Klon-B3-Zellen zu jedem Brunnen langsam, gleiten von der Felge nach unten. Drehen Sie die Platte bei 1, 300 mal g bei 35 Grad Celsius für zwei Minuten, damit sich die Zellen nach unten absetzen.
Übertragen Sie die Platte auf einen 37 Grad Celsius Gewebekultur Grad Inkubator. Am nächsten Tag 100 Mikroliter frisches Medium zu jedem Brunnen hinzufügen, der einzelne RNA-transduzierte Zellen enthält, so dass das endgültige mittlere Volumen 200 Mikroliter beträgt. Geben Sie die Platte an den Inkubator zurück.
72 Stunden nach der Transduktion, überprüfen Sie den Prozentsatz der Single-Guide-RNA, die BFP-positive Zellen in jedem Brunnen durch Durchflusszytometrie enthält. Verwenden Sie einen Zelllebensfähigkeitsfarbstoff, um abgestorbene Zellen zu markieren und aus der Analyse auszuschließen. Setzen Sie nach jeder Faktenanalyse einen Teil der Zellen in neue Brunnen mit frischem Medium zurück, um ein Überwuchern während des Assays zu vermeiden.
Wiederholen Sie alle zwei bis drei Tage die Faktenanalyse, um den relativen Anteil der BFP-positiven Zellen im Vergleich zu den negativen BFP-Gegenstücken zu überprüfen. Analysieren Sie den Prozentsatz der BFP-positiven Zellen für jeden Zeitpunkt mithilfe einer Faktenanalysesoftware. Der Schlüssel zum Erfolg des wettbewerbsfähigen Proliferations-Assays besteht darin, die richtigen Gating-Techniken zu verwenden, um sicherzustellen, dass die letztendlichen Anzahl von Lebenden Zellen korrekt ist.
Ziehen Sie FCS-Dateien für jedes Beispiel in die Software. Doppelklicken Sie auf eine beliebige Beispieldatei, und zeichnen Sie ein Punktdiagramm mit Vorwärtsstreuung versus Seitenstreuung mit Vorwärtsstreuung auf der x-Achse und Seitenstreuung auf der y-Achse. Tor alle Zellen.
Doppelklicken Sie auf die gated Cells, und zeichnen Sie den Flecken für die Lebensfähigkeit auf der y-Achse im Vergleich zur Punkthöhe oder flächenpunktförmigen Fläche nach vorne. Gate die Lebensfähigkeit Fleck negative Zellen. Doppelklicken Sie auf die abgesperrten Live-Zellen, und zeichnen Sie BFP auf der y-Achse im Vergleich zur Vorwärtsstreuung auf der x-Achse.
Gate die BFP-positiven Zellen. Wenden Sie alle diese Gates auf alle Beispiele an, indem Sie das ausgewählte Beispiel auf alle Samples unter der Registerkarte Gruppe ziehen. Klicken Sie auf den Tabelleneditor, um eine Analysetabelle aller Stichproben zu erstellen.
Ziehen Sie die positive BFP-Anzahl von einem Beispiel auf die Tabelle, und klicken Sie auf die Anzeigeschaltfläche im Tabelleneditor, um einen Batchbericht aller Stichproben zu erstellen, wobei die Tabelle den Prozentsatz der BFP-positiven Zellen anzeigt. Speichern Sie die Tabelle als Excel-Datei. Dieses System wurde verwendet, um die Rolle von Genen zu untersuchen, die eine Rolle bei der Proliferation oder dem Überleben menschlicher und muriner AML-Zelllinien spielen können.
Die Ausrichtung auf den AAVS1 Safe-Harbor-Lokus mit zwei separaten Single-Guide-RNAs hatte keinen Einfluss auf die Proliferation menschlicher MOM13 Cas9-Zellen Im Gegensatz dazu wurde bei der Zielwirkung des DNA-Replikations-assoziierten Gens RPA3 ein progressiver und signifikanter Rückgang des Anteils der BFP-positiven Zellen im Vergleich zu den negativen nicht transduzierten BFP-Gegenstücken beobachtet. In ähnlicher Weise wurden die Auswirkungen von Single Guide RNAs, die auf Dot1l, einen epigenetischen Regulator, und Rhodopsin, das Augenpigmentierungsgen, abzielen, in Maus-MLL-AF9-Cas9-Zellen getestet. Einzelne-Guide-RNAs, die auf Dot1l abzielen, zeigten einen dramatischen und fortschreitenden Rückgang der wettbewerbsorientierten Proliferation im Gegensatz zu einzelnen-Guide-RNAs, die auf Rhodopsin abzielen.
Diese Ergebnisse zeigen die Verwundbarkeit der MLL-AF9, die Massenleukämiezellen gegen Dot1l-Erschöpfung ausdrückt, und bestätigen zuvor veröffentlichte Ergebnisse. Unter der Annahme von vier bis sechs Führungs-RNAs pro Gen eignet sich diese Methode gut für die parallele Prüfung von mindestens 16 bis 24 Genen und kann auch zur Erprobung von Genabhängigkeiten in jeder Krebszelllinie eingesetzt werden. Im Falle einer größeren Anzahl von Genen, wie z. B. einem gesamten molekularen Pfad, der in AML-Zellen getestet werden muss, werden Pool-CRISPR-Cas9-basierte Bildschirme nützlicher sein.
