여기서, 우리는 면역 형광, 새로운 방법 및 DNA 점 얼룩을 사용하여 세포및 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸시토신을 검출하는 프로토콜을 제시한다. 5-하이드록시메틸시토신, 즉 5hmC, 완화된 후성유전학적 변형, 유전자 발현 조절에 중요한 기능을 담당하고 여러 신경 장애에 관여하는 것으로 보인다.
실제로, 우리의 방법은 다중 세포및 조직에서 5hmC를 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그것은 편리하고 실험실에서 일반적인 장비와 함께 수행 할 수 있습니다. 먼저 마우스를 플라스틱 보드에 올려 놓고 각 팔다리를 끈적거리는 테이프로 고정하는 것으로 시작합니다.
외과 가위를 사용하여 피부와 근육을 잘라 내고 흉부 구멍을 엽니다. 심장을 노출하고 미세 수술 가위로 오른쪽 아트리움의 작은 부분을 잘라. 10 밀리리터 일회용 살균 주사기를 사용하여 왼쪽 심실에서 마우스를 차가운 PBS로 견딜 수 있습니다.
그런 다음 마우스가 뻣뻣해질 때까지 4 %의 PFA로 마우스를 견딜 수 있습니다. 그런 다음 뼈 집게로 두개골을 열고 뇌를 제거합니다. 뇌를 4%PFA의 5밀리리터로 채워진 15밀리리터 원심분리기 튜브에 넣고 섭씨 4도에 보관하십시오.
24 시간 후에, 30% 자당 용액으로 두뇌를 전송하고 완전한 탈수에 대한 섭씨 4도에서 둡니다. 절개하기 전에 최적의 절삭 온도 화합물에 뇌를 침지하고 적어도 한 시간 동안 영하 20도까지 식힙니다. 저온 저온 마이크로토메를 사용하여 20~40마이크로미터두께의 뇌 샘플을 절개한다.
PBS로 섹션을 수집하고 섭씨 4도에 보관하십시오. 관심의 뇌 섹션을 선택하고 PBS와 24 잘 접시에 넣어. PBS로 섹션을 셰이커에 10분간 세척합니다.
PBS를 제거하고 예열된 1-어금다 염산으로 30분 동안 섭씨 37도에서 치료하십시오. 염산은 부식성이며 화학 적 보류로 준비하십시오. 그런 다음 PBS로 샘플을 5분 동안 세 번 세척하고 3%의 일반 염소 세럼과 0.1%트리톤 X-100을 함유한 PBS로 차단합니다.
샘플을 실온에서 1시간 동안 셰이커에 두십시오. 섹션에 특정 1 차 적인 항체를 추가 하 고 셰이커에 섭씨 4도에서 하룻밤 배양. 다음 날, 샘플을 꺼내 1 시간 동안 실온에서 둡니다.
PBS로 샘플을 세 번 세척하고 이차 항체를 추가합니다. 알루미늄으로 접시를 덮고 흔들면서 실온에서 1 시간 동안 둡니다. 인큐베이션 후 PBS로 샘플을 세 번 세척하고 슬라이드에 장착합니다.
페이드 방지 마운팅 매체100~150마이크로리터를 추가하고 프리미엄 커버 글래스로 커버하고 매니큐어로 밀봉합니다. 규칙적 또는 공초점 현미경으로 뇌 섹션을 이미지합니다. 게놈 DNA를 격리하려면 해마, 피질 및 소뇌 조직을 얼음 냉각 접시에 해부하는 것으로 시작합니다.
DNA 리시스 버퍼 1밀리리터를 추가하고 조직을 갈아. 샘플을 깨끗한 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 리스 버퍼의 600 마이크로 리터당 250 마이크로 그램의 단백질아제-K를 추가합니다. 그런 다음 샘플 당 약 50 마이크로 그램의 RNase A를 추가하고 섭씨 37도에서 적어도 12 시간 동안 배양하십시오.
인큐베이션 후 페놀 클로로폼 이소아밀 알코올의 동일한 볼륨을 추가하고 철저하게 혼합합니다. 원고 방향에 따라 혼합물을 원심 분리하고 상체를 새로운 튜브로 옮길 수 있습니다. 600 마이크로리터의 클로로폼을 상체에 넣고, 원고 의 지시에 따라 철저히 섞고 원심분리기를 섞습니다.
상체를 새로운 튜브로 옮기고 500 마이크로리터의 이소프로판올을 추가합니다. DNA를 침전시키기 위해 철저하게 혼합하고 원심분리기를 다시 섞습니다. 원심분리 후, 상체를 버리고, 원고 의 방향에 따라 DNA 펠릿을 70%에탄올로 씻는다.
공기는 DNA 펠릿을 완전히 건조한 다음 Tris-HCl 버퍼에 녹입니다. 시작하기 전에 원고 방향에 따라 필요한 솔루션 및 샘플 혼합물을 준비하십시오. DNA 샘플을 섭씨 100도까지 10분 간 가열한 다음 얼음 위에 놓습니다.
나일론 멤브레인의 적절한 크기를 잘라 6X SSC로 헹신다. 멤브레인을 도트 블롯 장치에 놓고 진공 펌프를 연결합니다. 멤브레인에 6 마이크로 리터 점을 발견하고 섭씨 80도에서 30 분 동안 혼성화하십시오.
그런 다음 무지방 우유와 트리스 완충식식염수 또는 TBS로 샘플 멤브레인을 1시간 동안 차단합니다. 다클론 토끼 항-5-하이드록시메틸시토신 항체를 막에 넣고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양한다. 다음 날, 1 시간 동안 실온에서 샘플 멤브레인을 두고 다음 TBS로 멤브레인을 세 번 세척하십시오.
항토끼 이차 항체로 멤브레인을 30분 동안 배양한 다음 TBS로 세 번 세척합니다. 이 프로토콜은 성인 마우스의 해마에서 5-하이드록시메틸시토신 또는 5hmC를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.
신경 세포에 대한 항체를 가진 면역 형광, 5hmC는 뉴런에 있는 5hmC의 농축이 있다는 것을 밝힙니다. 신경 발달 도중 5hmC의 역학은 증식및 분화한 성인 신경 줄기 세포에서 격리된 DNA 견본의 점 얼룩 분석으로 결정될 수 있습니다. 5hmC의 글로벌 수준은 분화 도중 현저하게 증가하고 뉴런에 있는 5hmC의 수준은 신경 줄기 세포에서 보다는 더 높습니다.
이 방법의 핵심 단계는 DNA 샘플의 완전한 거부를 확인하는 것입니다.
