小鼠神经干细胞和脑中5-羟基甲基细胞氨酸的检测

在这里，我们提出了一个方案，利用免疫荧光、新方法和DNA点斑点检测细胞和脑组织中5-羟基霉素。5-羟基霉素，即5hmC，减轻表观遗传修饰，在调节基因表达和参与多种神经系统疾病方面起着重要作用。

实际上，我们的方法可用于检测多个细胞和组织中的5hmC。它很方便，可以在实验室中使用通用设备执行。首先将鼠标面朝上放在塑料板上，然后用胶带固定每个肢体。

使用手术剪刀切开皮肤和肌肉，并打开胸腔。用精细的手术剪刀暴露心脏并切断右心房的一小部分。使用 10 毫升一次性消毒注射器，将鼠标从左心室中用冷 PBS 排出。

然后，用 4%PFA 将鼠标注入，直到鼠标变硬。然后，用骨钳打开头骨，取出大脑。将大脑放入一个15毫升的离心管中，里面装满了5毫升4%PFA的离心机，并将其储存在4摄氏度。

24小时后，将大脑转移到30%蔗糖溶液中，并留在4摄氏度下进行完全脱水。在切块之前，将大脑用最佳的切割温度复合物吸收，并冷却到零下20摄氏度至少一小时。使用低温计子微原子进行厚度为20至40微米的分段大脑样本。

将部分收集到 PBS 中，并在摄氏四度时存储。拿起感兴趣的大脑部分，并把它们放入一个24井板与PBS。在摇床上用 PBS 清洗部分 10 分钟。

取出PBS，在37摄氏度下用预热的一摩尔盐酸处理30分钟。盐酸具有腐蚀性，请准备在化学保持中。然后，用PBS清洗样品三次五分钟，用含有3%正常山羊血清和0.1%Triton X-100的PBS进行阻断。

将样品放在室温下摇床上一小时。向各部分添加特定的原抗体，并在四摄氏度的摇床上孵育过夜。第二天，将样品拿出来，在室温下留一小时。

用PBS清洗样品三次，并添加二次抗体。用铝盖住盘子，在摇动时在室温下保持一小时。孵育后，用PBS清洗样品三次，然后将它们安装到幻灯片上。

加入 100 到 150 微升的防褪色安装介质，用优质盖玻璃盖住，用指甲油密封。用普通显微镜或共体显微镜成像大脑部分。要分离基因组DNA，首先解剖冰冷盘上的海马、皮层和小脑组织。

加入一毫升的DNA解液缓冲液，研磨组织。将样品转移到干净的微离心管中，每600微升解液缓冲液加入250微克蛋白质酶-K。然后，每样本加入约50微克的RNase A，在37摄氏度下孵育至少12小时。

孵育后，加入同等体积的苯酚氯仿异丙酰醇，并彻底混合。根据手稿指示将混合物离心，然后将上一代转移到新管中。在上清液中加入 600 微升氯仿，根据手稿指示彻底混合和离心机。

将上流液转移到新管中，并添加 500 微升异丙醇。彻底混合并再次离心，沉淀DNA。离心后，丢弃上经剂，然后根据手稿指示用70%乙醇清洗DNA颗粒。

空气完全干燥DNA颗粒，然后溶解在Tris-HCl缓冲液中。在开始之前，根据手稿指示准备所需的溶液和样品混合物。将DNA样本加热至100摄氏度10分钟，然后放在冰上。

切下尼龙膜的适当尺寸，然后用 6X SSC 冲洗。将膜放在点印装置上，然后连接真空泵。在膜上发现六微升点，在 80 摄氏度下混合 30 分钟。

然后，用无脂牛奶和Tris缓冲盐水（TBS）阻断样品膜一小时。将多克隆兔抗5-羟基霉素抗体加入膜，并在4摄氏度下孵育过夜。第二天，将样品膜留在室温下一小时，然后用TBS洗涤膜三次。

用抗兔二级抗体孵育膜30分钟，然后用TBS洗涤三次。该协议可用于在成年小鼠的海马体中可视化5-羟基霉素，或5hmC。

5hmC 的免疫荧光与神经元细胞的抗体，揭示了神经元中 5hmC 的富集。在神经元发育过程中，5hmC的动力学可以通过从增殖和分化的成人神经干细胞中分离出的DNA样本进行点-斑点测定来测定。在分化过程中，5hmC的全球水平显著增加，神经元中5hmC的水平高于神经干细胞。

这种方法的关键步骤是确保DNA样本完全变性。