Die Novo Nordisk Stiftungszentrum für metabolische Grundlagenforschung ist ein unabhängiges Forschungsinstitut an der Universität Kopenhagen, teilweise durch eine freie Spende von Novo Nordisk Stiftung finanziert.

1. Einschränkung Enzymbehandlung
<ol><li>Linearisieren Sie MtDNA durch die Behandlung der gesamten menschlichen DNS mit dem Restriktionsenzym BamHI, das an Position 14258 in der menschlichen mitochondrialen DNA schneidet. Hinweis: Für Maus-DNA, verwenden Sie das Restriktionsenzym BglII unter identischen Bedingungen wie folgt.</li>
	<li>Für jede Probe wo MtDNA Methylierung soll beurteilt werden, bereiten ein 0,2 mL Reaktionsgefäß und fügen Sie die folgende Mischung: 3 μg genomischer DNA (gemessen durch Fluorometry), 15 μl Puffer 3, 3 μL BamHI und Wasser bis zu 150 μL</li>
	<li>Platz Rohre in einem Thermocycler für 4 h bei 37 ° C.</li>
</ol>(2) Bisulfit-Konvertierung
<ol><li>BamHI-behandelte DNA mit Natrium Bisulfit an anderer Stelle beschriebenen29zu konvertieren.</li>
	<li>Verwenden Sie 200-500 ng BamHI-behandelte DNA für jede Konvertierung Reaktion in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Die DNA-Erholung ist 50-70 %.</li>
	<li>Eluieren Sie Bisulfit umgewandelt DNA in 10 μL Elution Puffer.</li>
	<li>Die einsträngige DNA durch Fluorometry zu quantifizieren.</li>
	<li>Optional: Speichern Sie bevor Sie fortfahren, die restlichen des Protokolls Bisulfit umgewandelt DNA bei-20 ° C. Für die langfristige Lagerung speichern Sie konvertiert Bisulfit DNA bei-80 ° C</li>
</ol>3. Gestaltung von Bisulfit Sequenzierung Primer
<ol><li>Primer für Bisulfit-Sequenzierung mit dem online-Tools Methprimer30 und BiSearch31,32zu entwerfen. Hinweis: Methprimer und BiSearch lassen sich Grundierung Bindung Sequenzen auf Genomsequenzen suchen wo Cytosines in Thymines, ähnlich wie bei Post-Bisulfit Behandlung umgewandelt.</li>
	<li>Für optimale und unvoreingenommene Verstärkung vermeiden CpG dinucleotid in die Primer und design der Amplifikate Größe zwischen 100-300 bp.</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass gestaltete Primer für die mitochondriale DNA, die mit BiSearchs Funktion Primer Suchespezifisch sind. Legen Sie die bereits gestalteten Bisulfit konvertiert Primer, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bisulfit und gehören ein Referenz-Genom und PCR-Parameter. Hinweis: Es wird eine Liste der möglichen PCR-Produkte angezeigt.</li>
	<li>Kopieren Sie oben 1-5 Grundierung Sequenzen zu und fügen Sie sie in ein Bestellformular für Oligonukleotid-Synthese. Hinweis: Eine Liste von Mensch und Maus MtDNA-Primer-Sequenzen, die im Labor validiert wurde ist in Tabelle 1dargestellt.</li>
	<li>Test-Primer mit Bisulfit konvertiert PCR nach Agarose-Gelelektrophorese, wie in Schritt 4 beschrieben. Testen Sie und optimieren Sie alle Primer Paare getrennt und sicherzustellen Sie, dass die richtige Amplikons Größe auf dem Agarosegel angezeigt wird. Hinweis: Wenn multiplexing Primer benötigt werden, fügen Sie hinzu, mehrere Primer zu einem einzelnen PCR-Reaktion und visualisieren die PCR-Produkte auf Agarose-Gelelektrophorese oder eine mehr auflösenden Methode wie Polyacrylamid Gelelektrophorese, um ähnliche Produkte zu unterscheiden Größe.</li>
</ol>4. Bisulfit umgewandelt, PCR und Gel Extraction
<ol><li>Um die Regionen von Interesse zu verstärken, führen Sie durch PCR mit einem Heißstart Taq Polymerase. Kurz, Mix 100 ng umgewandelt DNA, 500 µM und Anti-Sinn Primer 1 µL dNTP-Mix (10 µM jedes dNTP) und Polymerase über 7,5 U/Reaktion in einem Gesamtvolumen von 50 µL. laufen PCR mit den folgenden Bedingungen: 5 min bei 95 ° C (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 Zyklen; 10 min 72 ° C. Primer verwenden, entweder separat oder Multiplex.</li>
	<li>Optional: Wenn Primer multiplexing, Einsatz 200 ng konvertiert, DNA und die folgenden Bedingungen, Radfahren: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 Zyklen; 10 min 72 ° C. Hinweis: Die Temperatur variieren je nach der Schmelztemperatur der Primer.</li>
	<li>Thema PCR-Produkte, gel-Elektrophorese auf 2 % Agarose bei 100 Volt.</li>
	<li>Unter sanften UV-Licht PCR-Produkte mit einem Skalpell zu extrahieren und mikroröhrchen hinzufügen. Setzen Sie nicht PCR-Produkte, übermäßige UV-Licht, DNA-Schäden zu vermeiden. Vermeiden Sie Belichtungszeit über 30 s.</li>
	<li>Reinigen Sie die PCR-Produkte mit Gel Reinigung wie oben beschrieben3.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die gereinigte DNA aus Schritt 4.5 mit Fluorometry. Fahren Sie mit Schritt 5 oder Shop-Proben bei-20 ° C.</li>
</ol>5. Bisulfit Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung
<ol><li>Durchführen Sie Bibliothek-Vorbereitung von Bisulfit-konvertiert PCR-Produkte. Optional: multiplex-PCR-Produkte in diesem Stadium.</li>
	<li>Führen Sie Ende-Reparatur mit bis zu 100 ng PCR-Produktes. 55.5 µL PCR-Produkt in einer 0,2 mL Tube 3 µL Ende Prep Enzym und 6,5 µL Ende Reparatur Reaktion Puffer (10 X) hinzufügen. Platzieren und Rohr in einem Thermocycler für 30 min bei 20 ° C, gefolgt von 30 min bei 65 ° c inkubieren</li>
	<li>Sequenzierung Adapter verbinden, durch das Mischen der Ende repariert DNS mit 15 µL Blunt/TA-Ligase Mix, 2,5 µL Adapter und 1 µL Ligation Enhancer. Wenn mit < 100 ng PCR-Produkt als Eingabe, verdünnen Adapter 10-mal.</li>
	<li>Legen Sie die Mischung (Schritt 5.3) in einem Thermocycler und inkubieren Sie 15 min bei 20 ° C. Anhalten der Thermocycler und 3 µl Benutzer hinzufügen Enzym am Rohr. Mischen Sie und legen Sie das Rohr zurück in den Thermocycler und inkubieren 15 min bei 37 ° c</li>
	<li>Größe wählen Sie die Adapter ligiert DNA mittels Solid Phase Reversible Immobilisierung (SPRI) Perlen mit unterschiedlichen Verhältnissen von Perlen an DNA PCR Produkt abhängig.</li>
	<li>13.5 µL H2O Adapter ligiert DNA aus Schritt 5.4 und 55 µL Nukleinsäuretablette SPRI Perlen hinzufügen. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min und Platz auf einem Magnetstativ. Wenn die Lösung klar ist, übertragen Sie den überstand zu, zu einem neuen Schlauch und verwerfen Sie Röhrchen mit den Perlen zu. Hinweis: Der Überstand enthält die Adapter ligiert DNA und große unerwünschte Fragmente sind verpflichtet, die ausrangierten Perlen.</li>
	<li>Der Überstand von Schritt 5.6 25 µL Nukleinsäuretablette SPRI Perlen hinzufügen, mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie das Rohr auf die Magnetstativ und verwerfen Sie den überstand zu, wenn die Lösung klar ist. Hinweis: Der ausrangierte überstand enthält unerwünschte DNA, während die Adapter ligiert DNA an Perlen gebunden ist.</li>
	<li>Während das Rohr auf die Magnetstativ ist, fügen Sie 200 µL 80 % Ethanol (frisch zubereitet) um die Perlen zu waschen. Inkubieren Sie 30 s und entfernen und entsorgen der Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Gesamtmenge von 2 Wäschen.</li>
	<li>Luft trockenere Perlen für 5 min, während das Rohr auf Magnetstativ mit offenen Deckel.</li>
	<li>Entfernen Sie den Schlauch aus der Magnet, eluieren Sie DNA in 23 µL Elution Buffer und mischen. In 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ und wenn die Lösung klar ist, übertragen Sie 2 µL auf einer 96-Well-PCR-Platte für die Pre-PCR-Amplifikation (Schritt 5.14).</li>
	<li>Der Rest ungefähr 21 µL auf eine neue 0,2 mL Tube für PCR-Amplifikation (Schritt 5.17) übertragen. Hinweis: Achten Sie nicht darauf, Perlen zu übertragen, wie Perlen enzymatische Reaktionen über die nächsten Schritte hemmen können.</li>
	<li>Fahren Sie mit Schritt 5.14 oder Shop-Proben bei-20 ° C.</li>
	<li>Führen Sie Pre-PCR Verstärkung durch RT-qPCR Schätzung die Anzahl der Zyklen erforderlich, um die Adapter ligiert DNA zu verstärken. Pro Reaktion, fügen Sie Folgendes in der 96-Well-PCR Platte mit 2 µL DNA (Schritt 5.11): 0.4 µL Index Grundierung, 0.4 µL universal PCR Primer, 7,2 µL H2O, 10 µL RT-qPCR-master-Mix.</li>
	<li>Die Platte in einer Echtzeit-PCR-Maschine und die Platte mit den folgenden Bedingungen zu unterwerfen: 30 s bei 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 Zyklen; 5 min 65 ° C.</li>
	<li>Schätzen Sie die Anzahl der Verstärkung Zyklen benötigt für jede Probe durch Subtraktion eines Ct-Wert der Ct-Wert von der Vorverstärkung RT-qPCR entsprechend an das Ende der linearen Phase der PCR-Reaktion.</li>
	<li>Verstärken Sie die Adapter ligiert DNA aus Schritt 5.12 durch Mischen: 21 µL DNA, 25 µL PCR-master-Mix, 1 µL Index Grundierung, 1 µL Universal PCR Primer und 2 µL H2O. In einem Thermocycler unterziehen jede Probe mit den nachfolgenden Bedingungen: 30 s bei 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> [berechnete Ct aus Schritt 5.16] Zyklen; 5 min 65 ° C. Hinweis: Denken Sie daran, nur eine Index-Grundierung pro Probe zu Multiplexen. Der Index ist während der PCR eingesetzt.</li>
	<li>Reinigen Sie die amplifizierten DNA SPRI-Perlen und eluieren in 22 µL Elution Puffer.</li>
	<li>Bibliothek-Qualitätskontrolle durch Gel-Elektrophorese oder Alternative Methode. Achten Sie auf richtige Bibliothek Peak Größen (PCR-Produkt (e) Größe plus Adapter).</li>
	<li>Schätzen Sie die durchschnittliche Basenpaar Größe der Bibliothek-Produkte durch Abstrich Analyse: im erweiterten globalen Einstellungen, doppelklicken Sie auf "Tabelle" unter Abstrich Analyse. Definieren der Region von 100-1000 bp und klicken Sie auf "OK". Unter Region-Tabelledie definierte Region erscheint und Bibliothek Durchschnittsgröße (bp) wird berechnet.</li>
	<li>Bibliotheken von Fluorometry zu quantifizieren. Fahren Sie mit Schritt 6 oder Shop-Bibliotheken bei-20 ° C.</li>
</ol>(6) next Generation Sequencing
<ol><li>Berechnen Sie die nM-Konzentration der Bibliotheken mit der Formel: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>Verdünnen Sie Bibliotheken, die die gleichen nM Konzentration z.B. 2 nM (Wählen Sie 4 nM, 2 nM, 1 nM oder 0,5 nM je nach Bibliothek Konzentrationen). Bündeln Sie alle Bibliotheken um einen Pool von 2 nM Bibliotheken zu erreichen.</li>
	<li>Denaturieren und Bibliotheken nach der Sequenzierung Instrument Guide zu verdünnen. Kurz gesagt: 2 nM Pool durch Zugabe von 0,2 N NaOH denaturieren und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. verdünnt denaturierte Pool zu einer Endverdünnung von 22:00. Denaturieren Sie und verdünnen Sie eine handelsübliche Steuerelementbibliothek zu einer endgültigen Verdünnung der 12:05. Mischen Sie zu einem neuen Schlauch 22:00 Pool mit 20 % 12:05-Steuerelementbibliothek. Hinweis: Bisulfit Konvertierung führt sehr geringen Komplexität. Bessere Qualität der Sequenzierung führen Bibliothek Spike-in 20 % Kontrolle.</li>
	<li>Führen Sie ein 150 bp gepaart-End Sequenzierung mit einem tiefen Sequenzierung Instrument.</li>
</ol>(7) computergestützte Analyse - Schätzung Methylierung Ebenen
<ol><li>.Fastq Dateien (hier als sample1_R1.fastq.gz und sample1_R2.fastq.gz) zu erzeugen, erzeugen einen Bismark-Index des gesamten Genoms von Interesse (hier in einem Ordner namens BismarkIndex) und stellen Sie sicher, dass die genomische Sequenz ChrM in Fasta verfügbar ist Format (hier in einem Ordner namens ChrM).</li>
	<li>Vorverarbeitung von liest entfernen Sie Adapter und Bias eingeführt durch die Primer: Verwenden Sie das Tool Trim_galore33. Entfernen Sie zwei Nukleotide aus 5'-Ende der vorwärts und rückwärts liest. Trim_galore - clip_R1 2 - clip_R2 2 -o. /--trim1--gepaart sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz</li>
	<li>Richten Sie vorbearbeitet liest, das gesamte Genom mit Bismark34 Bismark - Schwalbenschwanz - Bam -o. /. / BismarkIndex /-1-2./sample1_R1_val_1.fq.gz./sample1_R2_val_2.fq.gz Hinweis: Wenn eine andere Aligner verwendet wird, stellen Sie sicher, dass Lesevorgänge, die eindeutig ausgerichtet werden können nicht verworfen werden.</li>
	<li>Extrakt liest Mapping auf dem Chromosom M, hier mit Samtools35 Samtools sortieren -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.BAM Samtools Index sample1_sorted.bam Samtools anzeigen -u sample1_sorted.bam ChrM | Samtools sortieren - n - O BAM -o sample1_chrM.bam</li>
	<li>Die Methylierung Informationen extrahieren Bismark_methylation_extractor -p--CX--Cytosine_report--umfassende--Genome_folder. / ChrM./sample1_chrM.bam</li>
	<li>Verwenden Sie die .bedGraph, die .cov oder die CX_report.txt-Dateien für die weitere Analyse. Verwenden Sie die sample1_chrM.CX_report.txt-Datei für die Visualisierung und testen.</li>
	<li>Führen Sie weiter Ausschnitt in der Vorverarbeitung Schritt aus, wenn mehrere Regionen verhört und eine Grundierung Vorspannung möglicherweise sichtbar in den M-Bias Parzellen erzeugt beim Mapping. Finden Sie in der Bismark-Dokumentation für weitere Informationen.</li>
</ol>(8) computergestützte Analyse - Test Unterschiede
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass die CX_report.txt-Datei für jedes C auf Chromosom M 7 Spalten, Chromosom (hier ChrM), Position, Ausrichtung, Anzahl der methylierten liest, unmethylated liest, C Kontext und umliegenden Sequenz enthält.</li>
	<li>Da die CX_report ChrM in seiner Gesamtheit erfasst, überprüfen Sie die Teilmenge, die Region(en), verstärkt wird.</li>
	<li>Verwenden Sie nicht-parametrischen Tests für Unterschiede zwischen den Proben, wie ein Fishers exakter Test für einzelne C oder ein Zeichen-Test für eine ganze Region. Hinweis: Quantifizierung werden oft in der Nähe von 0 % Methylierung, das ist der Grund, warum die Annahme von Normalität nicht angebracht ist.</li>
	<li>In ähnlicher Weise für die Visualisierung, Quantile zu visualisieren oder binomische Anteil Konfidenzintervall berechnen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Falkenberg, M., Larsson, N. -. G., Gustafsson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+and+transcription+in+mammalian+mitochondria.">DNA replication and transcription in mammalian mitochondria.</a> Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).</li><li>Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -. H., Kaufman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+intact+mitochondrial+DNA+agarose+electrophoresis+reveals+the+structural+complexity+of+the+mammalian+mitochondrial+genome.">Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).</li><li>Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+Suggesting+Absence+of+Mitochondrial+DNA+Methylation.">Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation.</a> Front Genet. 8, 166 (2017).</li><li>Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amount+and+distribution+of+5-methylcytosine+in+human+DNA+from+different+types+of+tissues+of+cells.">Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells.</a> Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).</li><li>Lister, R., Pelizzola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences.">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li><li>Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+non-CpG+methylation+in+mammals.">Evidence for non-CpG methylation in mammals.</a> Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).</li><li>Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evidence+for+functional+non-CpG+methylation+in+mammalian+cells.">The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells.</a> Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).</li><li>Nass, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+methylation+of+mitochondrial+and+nuclear+DNA+in+cultured+mouse,+hamser+and+virus+trasnforemd+hamser+cells+in+vivo+and+in+vitro+methylation.">Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation.</a> J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).</li><li>Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methyltransferase+1,+cytosine+methylation,+and+cytosine+hydroxymethylation+in+mammalian+mitochondria.">DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria.</a> PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).</li><li>Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+Region+of+Mitochondrial+DNA+Shows+an+Unusual+CpG+and+Non-CpG+Methylation+Pattern.">The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern.</a> DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).</li><li>Jia, Y., Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Low-Protein+Diet+Affects+Epigenetic+Regulation+of+Hepatic+Mitochondrial+DNA+Transcription+in+a+Sex-Specific+Manner+in+Newborn+Piglets+Associated+with+GR+Binding+to+Its+Promoter.">Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).</li><li>Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Betaine+Supplementation+during+Gestation+Enhances+Expression+of+mtDNA-Encoded+Genes+through+D-Loop+DNA+Hypomethylation+in+the+Skeletal+Muscle+of+Newborn+Piglets.">Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets.</a> J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).</li><li>Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+methyl+cycle+affects+mitochondrial+methyl+availability+and+glutathione+level+in+Down's+syndrome.">Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome.</a> Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).</li><li>Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+valproic+acid+on+mitochondrial+epigenetics.">Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics.</a> Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).</li><li>Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+5-hydroxymethylcytosine+in+brain+mitochondria.">Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).</li><li>Menga, A., Palmieri, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC25A26+overexpression+impairs+cell+function+via+mtDNA+hypermethylation+and+rewiring+of+methyl+metabolism.">SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism.</a> FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).</li><li>Frommer, M., McDonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).</li><li>Byun, H. -. M., Panni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+airborne+pollutants+on+mitochondrial+DNA+Methylation.">Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation.</a> Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).</li><li>Janssen, B. G., Byun, H. -. M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+mitochondrial+methylation+and+exposure+to+airborne+particulate+matter+in+the+early+life+environment:+An+ENVIRONAGE+birth+cohort+study.">Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study.</a> Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).</li><li>Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+is+associated+with+epigenetic+and+genetic+regulation+of+mitochondrial+DNA+in+obese+humans.">Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans.</a> Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).</li><li>Byun, H. -. M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Air+Pollution+and+Blood+Mitochondrial+DNA+Methylation+on+Markers+of+Heart+Rate+Variability.">Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability.</a> J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).</li><li>Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrion.">Mitochondrion.</a> MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).</li><li>Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mitochondria-targeted+DNA+methylation+identifies+GpC+methylation,+not+CpG+methylation,+as+potential+regulator+of+mitochondrial+gene+expression.">Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression.</a> Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).</li><li>Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNMT3A+and+DNA+methylation+in+skeletal+muscle+and+CNS+of+transgenic+mouse+models+of+ALS.">Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS.</a> Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).</li><li>Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-methylcytidylic+acid:+absence+from+mitochondrial+DNA+of+frogs+and+HeLa+cells.">5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells.</a> Science. 184 (4132), 80-81 (1974).</li><li>Gama-Sosa, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).</li><li>Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionally+specific+and+genome-wide+analyses+conclusively+demonstrate+the+absence+of+CpG+methylation+in+human+mitochondrial+DNA.">Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA.</a> Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).</li><li>Liu, B., Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+methylation+patterns+ofhuman+mitochondrial+DNA.">CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA.</a> Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).</li><li>Donkin, I., Versteyhe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+Bariatric+Surgery+Drive+Epigenetic+Variation+of+Spermatozoa+in+Humans.">Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans.</a> Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).</li><li>Li, L. C., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MethPrimer:+designing+primers+for+methylation+PCRs.">MethPrimer: designing primers for methylation PCRs.</a> Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).</li><li>Tusn&#225;dy, G. E., Simon, I., V&#225;radi, A., Ar&#225;nyi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiSearch:+primer-design+and+search+tool+for+PCR+on+bisulfite-treated+genomes.">BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).</li><li>Ar&#225;nyi, T., V&#225;radi, A., Simon, I., Tusn&#225;dy, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BiSearch+web+server.">The BiSearch web server.</a> BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).</li><li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bismark:+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications.">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Ramos, A., Barbena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+insertions+of+mitochondrial+origin:+Database+updating+and+usefulness+in+cancer+studies.">Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies.</a> Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).</li><li>Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing.">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).</li></ol>

Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt zu erklären.

Hier bieten wir ein Bisulfit-Sequenzierung-Protokoll, das speziell für die MtDNA-Methylierung zu befragen. Die Unterschiede mit Bisulfit-Sequenzierung Protokolle für genomische DNA liegt bei der Verwertung von eine vorherige Beschränkung Enzym Verdauung Schritt und eine bioinformatische Analyse Urteil, falsche positive aus NUMT Sequenzen.
Wir bieten ein Protokoll zur Bisulfit-Sequenzierung Artefakte zu vermeiden, bei der Untersuchung von MtDNA-Methylierung. Bisulfit Sequenzierung Artefakte ...

Das mitochondriale Genom ist eine kreisförmige, doppelsträngige Struktur von rund 16,5 Kilo Base (kb) lang, bilden eine schwere und eine leichte Faser. Das mitochondriale Genom ist in mehrere Kopien in jeder Zelle, mütterlich vererbt, und wesentliche Bestandteile der Atmungskette komplexe1kodiert. Ähnlich wie bei bakteriellen Genome und anders als das Kerngenom, des mitochondrialen Genoms in zahlreichen sekundären und tertiären Strukturen, wie z. B. gewickelten und supercoiled Strukturen2, gliedert sich in die Zugang schwierig, während der Sequenzierung machen können Experimente-3.
Im Zellkern ist Methylierung der DNA ein ausgiebig studierte epigenetische Markierung, die in zahlreiche Prozesse, vor allem in der Regulation der Genexpression eine Rolle spielt. In Säugetier-Genome tritt DNA-Methylierung in erster Linie auf der 5-Position der Pyrimidine Ring der Deoxycytidines, meistens auf CG dinucleotid (oder CpG). Cytosin Methylierung findet sich bei 70 % von allen CpG im Erbgut von Körperzellen und Konten für ~ 1 % der gesamten DNA4Basen. DNA-Methylations ist auch in nicht-CpG zusammenhängen, wie CpA, CpT und CpC beschrieben worden und existieren in verschiedenen Mengen in Kern-DNA, mit Werten bis zu 25 % von allen methylierte Cytosines in embryonale Stammzellen5,6,7.
Während Cytosin Methylierung von das Kerngenom weithin anerkannt ist, ist die Existenz der mitochondrialen DNA (MtDNA) Methylierung noch umstritten. Die erste Studie untersucht MtDNA Methylierung erfolgte in kultivierten Zellen wo MtDNA Methylierung bereitwillig erkannt wurde, obwohl auf einem niedrigeren Niveau im Vergleich zu nuklearen DNA-8. In menschlichen und murinen Zellen wurde MtDNA Methylierung auch auf einem niedrigen Niveau (2-5 %) festgestellt. Mit Berufung auf 5 Methylcytosine erfassen wie METHYLIERTE DNA Immunopräzipitation (MeDIP) gefolgt von quantitativen PCR Assays, MtDNA Methylierung wurde auch in verschiedenen Maus und Mensch erkannt und Zellen Linien9,10, 11,12. Mit Antikörpern gegen 5 Methylcytosine in einem ELISA-Test oder Massenspektrometrie, waren wesentliche Ebenen der DNA-Methylierung von gereinigten mitochondriale Fraktionen13,14,15, erkannt. 16. jedoch der Großteil der Assays in den genannten Studien verwendet Techniken, die nicht entworfen waren, um absolute Quantifizierung der DNA-Methylierung in der einzigen Basis-Auflösung bieten.
Quantitative und auflösenden DNA-Methylierung Analyse durch eine Technik namens "Bisulfit Sequenzierung", lässt sich die Vorteile des Eigentums von Natrium Bisulfit unmethylated Cytosin in Uracil in einzelsträngiger DNA Kontext17 konvertieren . Eine Konstellation von Studien erkannt mit Bisulfit-Sequenzierung, die Anwesenheit von Cytosin Methylierung auf verschiedenen Ebenen. Im menschlichen18,19,20,21,22,23 und Maus24 wurde bereitwillig Methylierung MtDNA in der D-Loop-Region, der 12 s oder 16 s Region erkannt. Geweben und Zellen, jedoch mit einer faszinierenden Variabilität, von 1-20 % des gesamten Cytosines in Studien.
Im Vergleich zu diesen zahlreichen Studien haben nur wenige Studien, unter anderem von unserer Fraktion bestritten die Anwesenheit von MtDNA Methylierung3,25,26,27 oder in Frage gestellt die biologische Relevanz der sehr niedrige Niveaus von MtDNA (unter 2 %)28. Vor kurzem berichteten wir die Beobachtung eines potenziellen Bisulfit-Sequenzierung Artefakts in ganzen mitochondriale Bisulfit Sequenzierung3. Wir haben nachgewiesen, die die Sekundärstruktur der mitochondrialen DNA zu Fehlalarmen in Bisulfit-Sequenzierung, könnte damit überschätzen Methylierung Ebenen. Wir bieten hier ein Protokoll um ein Artefakt der Bisulfit-Umwandlung von MtDNA zu verhindern. Dieses Protokoll verwendet eine einfache enzymatische Verdauung von DNA zu stören MtDNA Sekundärstrukturen und vollen Zugriff auf Bisulfit nach einem Bisulfit-Sequenzierung-Protokolls zu ermöglichen. Darüber hinaus bieten wir eine begleitende Bioinformatik-Pipeline für die Analyse von Bisulfit-Sequenzierung.

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td># R0136</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA methylation-lightning kit</td><td>Zymo Research</td><td># D5030&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ssDNA assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q10212</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q32856</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq plus DNA polymerase kit</td><td>Qiagen</td><td># 203603&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td># 28704</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7370S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7335S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td># A63881</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA chip</td><td>Agilent</td><td># 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Qubit high sensitivity dsDNA assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33230</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq reagent kit v2 300 cycles</td><td>Illumina</td><td># MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX control v3</td><td>Illumina</td><td># FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td># S5881</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler C1000</td><td>Biorad</td><td># 1851148</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time PCR detection system</td><td>Biorad&amp;nbsp;</td><td>#1855195</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td># G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq instrument</td><td>Illumina</td><td># SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

methodology for accurate detection of mitochondrial dna methylation

Quantifizierung der DNA-Methylierung kann erreicht werden mit Bisulfit-Sequenzierung, die Vorteile des Eigentums von Natrium Bisulfit unmethylated Cytosin in Uracil in einem einzelsträngigen DNA-Kontext zu konvertieren. Bisulfit-Sequenzierung können gezielt (mittels PCR) oder auf das gesamte Genom durchgeführt und bietet absolute Quantifizierung von Cytosin Methylierung in der einzigen Basis-Auflösung. Angesichts der deutlichen der nuklearen und mitochondriale DNA, vor allem in der Sekundärstruktur, sollten Anpassungen von Bisulfit Sequenzierung Methoden für die Untersuchung von Cytosin Methylierung in MtDNA erfolgen. Sekundäre und tertiäre Struktur der MtDNA führt in der Tat zu Bisulfit Artefakte zu Fehlalarme aufgrund von unvollständigen Denaturierung schlechte Anbindung von Bisulfit einzelsträngigen DNA-Sequenzierung. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit einer enzymatischen Verdauung der DNA mit BamHI gepaart mit bioinformatische Analyse Pipeline ermöglichen genaue Quantifizierung von Cytosin Methylierung Ebenen in MtDNA. Darüber hinaus bieten wir Richtlinien für die Gestaltung von Bisulfit Sequenzierung Primer spezifisch für MtDNA, zur Vermeidung von unerwünschten nuklearen mitochondriale Segmente gezielt (NUMTs) in das Kerngenom eingesetzt.

Zwei Schritte in diesem Protokoll sind von entscheidender Bedeutung bei der Untersuchung von MtDNA-Methylierung. (1) die Eröffnung der Sekundärstruktur und (2) die Gestaltung der mitochondrialen DNA-spezifischen Primer.
Durch Verdauung menschliche genomische DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Abbildung 1), die mitochondriale DNA-Struktur wird an Nukleotid Position 14.258 geschnitten werden und d...

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Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um genaue Quantifizierung der mitochondrialen DNA (MtDNA) Methylierung. In diesem Protokoll beschreiben wir eine enzymatische Verdauung von DNA mit BamHI gepaart mit einem bioinformatische Analyse Pipeline die Überschätzung der MtDNA Methylierung Ebenen verursacht durch die Sekundärstruktur des MtDNA zu vermeiden verwendet werden können.

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K Aufrufe.  University of Copenhagen. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um genaue Quantifizierung der mitochondrialen DNA (MtDNA) Methylierung. In diesem Protokoll beschreiben wir eine enzymatische Verdauung von DNA mit BamHI gepaart mit einem bioinformatische Analyse Pipeline die Überschätzung der MtDNA Methylierung Ebenen verursacht durch die Sekundärstruktur des MtDNA zu vermeiden verwendet werden können.

Serie: Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Methylierte DNA Immunpräzipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Forschung

Biologie

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Neurowissenschaften

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) establish and maintain the DNA methylation pattern. Changes to the normal DNA methylation pattern are linked to cancer development and progression, making DNMTs potential cancer drug targets. Thus, identifying and characterizing novel small molecule inhibitors of these enzymes is of great importance. This paper presents a protocol that can be used to screen for DNA methyltransferase inhibitors. The continuous coupled kinetics assay allows for initial velocities of DNA methylation to be determined in the presence and absence of potential small molecule inhibitors. The assay uses the methyl-sensitive endonuclease Gla I to couple methylation of a hemimethylated DNA substrate to fluorescence generation.
This continuous assay allows for enzyme activity to be monitored in real time. Conducting the assay in small volumes in microtiter plates reduces the cost of reagents. Using this assay, a small example screen was conducted for inhibitors of DNMT1, the most abundant DNMT isozyme in humans. The highly substituted anthraquinone natural product, laccaic acid A, is a potent, DNA-competitive inhibitor of DNMT1. Here, we examine three potential small molecule inhibitors &#8212; anthraquinones or anthraquinone-like molecules with one to three substituents &#8212; at two concentrations to describe the assay protocol. Initial velocities are used to calculate the percent activity observed in the presence of each molecule. One of three compounds examined exhibits concentration-dependent inhibition of DNMT1 activity, indicating that it is a potential inhibitor of DNMT1.

DNA methyltransferases are potential cancer drug targets. Here, a protocol is presented to assess small molecules for DNA methyltransferase inhibition. This assay utilizes an endonuclease to couple DNA methylation to fluorescence generation and allows for enzyme activity to be monitored in real time.&#160;

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Biochemie

Hochdurchsatz-Quantifizierung der Synthese und Verteilung von mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells produce most of their ATP in the mitochondria by oxidative phosphorylation. Mitochondria are unique organelles because they have their own genome that is replicated and passed on to the next generation of cells. In contrast to the nuclear genome, there are multiple copies of the mitochondrial genome in the cell. The detailed study of the mechanisms responsible for the replication, repair, and maintenance of the mitochondrial genome is essential for understanding the proper functioning of mitochondria and whole cells under both normal and disease conditions. Here, a method that allows the high-throughput quantification of the synthesis and distribution of mitochondrial DNA (mtDNA) in human cells cultured in vitro is presented. This approach is based on the immunofluorescence detection of actively synthesized DNA molecules labeled by 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation and the concurrent detection of all the mtDNA molecules with anti-DNA antibodies. Additionally, the mitochondria are visualized with specific dyes or antibodies. The culturing of cells in a multi-well format and the utilization of an automated fluorescence microscope make it easier to study the dynamics of mtDNA and the morphology of mitochondria under a variety of experimental conditions in a relatively short time.

Autor im Rampenlicht: Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung  

A procedure for studying the dynamics of mitochondrial DNA (mtDNA) metabolism in cells using a multi-well plate format and automated immunofluorescence imaging to detect and quantify mtDNA synthesis and distribution is described. This can be further used to investigate the effects of various inhibitors, cellular stresses, and gene silencing on mtDNA metabolism.

Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

DNA-Methylierung: Bisulfit Modifikation und Analyse

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung für die Bewertung der DNA-Methylierung bei Basenpaar Auflösung

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms has increased in recent years due to the recently developed ability to produce models by mtDNA mutagenesis and a new appreciation of the association between mitochondrial genetic aberrations and common age-related diseases such as cancer, diabetes, and dementia. Pyrosequencing is a sequencing-by-synthesis technique that is widely employed across the mitochondrial field for routine genotyping experiments. Its relative affordability when compared to massive parallel sequencing methods and ease of implementation make it an invaluable technique in the field of mitochondrial genetics, allowing for the rapid quantification of heteroplasmy with increased flexibility. Despite the practicality of this method, its implementation as a means of mtDNA genotyping requires the observation of certain guidelines, specifically to avoid certain biases of biological or technical origin. This protocol outlines the necessary steps and precautions in designing and implementing pyrosequencing assays for use in the context of heteroplasmy measurement.

Pyrosequencing assays enable the robust and rapid genotyping of mitochondrial DNA single nucleotide polymorphisms in heteroplasmic cells or tissues.

Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen im mitochondrialen Genom durch Pyrosequenzierung

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Methylierte DNA Immunpräzipitation

Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung

Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung

Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung

DNA-Methylierung: Bisulfit Modifikation und Analyse

Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung für die Bewertung der DNA-Methylierung bei Basenpaar Auflösung

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen im mitochondrialen Genom durch Pyrosequenzierung