The authors have no acknowledgements.

1. Kennzeichnung Reaktion <ol><li> Vor, Pre-Aliquot Cyanin 3 und 5-markierten dUTPs, unmarkierten Nukleotiden und Zufallsprimer an den Hersteller empfohlenen Konzentrationen verwenden in 96-Well-Platten und bei -20 C einsatzbereit. Für die Zwecke dieses Protokolls Aliquot von 10,5 &amp; mgr; l des geeigneten markiertem dUTP und 10,5 ul unmarkierter Nukleotide und Zufallsprimer in jede Vertiefung. </li><li> Auftauen ready-to-use Platte mit 96 Vertiefungen von Nukleotiden und Primern bei 4 ° C für etwa 1 Stunde, vor Licht geschützt. </li><li> Nach dem Auftauen Gleichgewicht dieser Platte bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten, vor Licht geschützt. </li><li> Äquilibrieren DNA-Proben bei 60 ° C für mindestens 15 min. </li><li> Verwendung einer Flüssigkeit handhabenden Roboters, verzichtet Nuklease-freies Wasser zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte. HINWEIS: Die Wassermenge hängt von der Konzentration jedes Eingangs DNA-Probe ab und sollte ausreichen, um in einer Endkonzentration von 50 ng / ul führt. </li><li> Verwendung eines flüssigen hanling Roboter-Pipette 1 ug DNA in eine Vertiefung der 96-Well-Platte (siehe 1.5), um das Gesamtvolumen auf 20 ul zu bringen. HINWEIS: Kleinere Mengen von DNA kann verwendet werden, obwohl die Qualität der resultierenden Daten beeinträchtigt sein kann (zum wertvollen Proben können Eingabe DNA Mengen bis 400 ng) verwendet werden. </li><li> Verwendung einer Flüssigkeit handhabenden Roboter, übertragen 20 ul äquilibrierten Nukleotide und Primer in jede Vertiefung der Platte verdünnt DNA. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen mit Verschlussstreifen (a dicht ist entscheidend). </li><li> Die DNA zu denaturieren bei 99 ° C für 10 min in einer PCR-Maschine mit einem beheizten Deckel und rasten kühl auf Eis für 5 min auf Glühen Primer. </li><li> Mit einem Liquid-Handling-Roboter, fügen Sie 10 ul Klenow-Exo-DNA-Polymerase-Enzym zu jedem DNAs und Pipetten Mischung gründlich. HINWEIS: Das Gesamtvolumen sollte 50 ul sein. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen und bei 37 ° C für 16 Stunden. ANMERKUNG: Eine kürzere Inkubationszeit von 4 h reicht jedoch ein O / Ncubation kann bequemer sein. </li><li> Verwendung eines Flüssigkeitshandhabungsroboter, mit 5 ul Stoppuffer zu jedem Well. ANMERKUNG: Eine Zusammenfassung der für die Markierungsreaktion verwendeten Reagenzien ist in Tabelle 1 gezeigt. </li></ol> 2. Entfernung von Nicht eingebaute Nukleotide <ol><li> Entfernen eingebauten Nukleotiden unter Verwendung von Silica-Membran von Spin-Säulen und eine dedizierte Spin-Säule Bearbeitungsroboter (die Spin-Säulen können auch manuell bearbeitet werden). Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Den Inhalt jeder Vertiefung in ein 2-ml-Tube; Pre-Label diese mit gut-IDs. Anmerkung: Dieser Schritt kann manuell oder vorzugsweise mit Hilfe einer Flüssigkeitshandhabungsroboter durchgeführt werden. </li><li> Bei Verwendung einer Spin-Säule Bearbeitungsroboter, dann laden Sie den Roboter mit 2-ml-Röhrchen, die DNA-Reinigung Spin-Säulen und die damit verbundenen Puffer. </li><li> Nach Eintragen von 250 ul Hochsalz, DNA-Bindungspuffer (Puffer PB) an die Markierungsreaktion, um die markierten DNA an die Kieselsäure bindenMembran. </li><li> Verunreinigungen durch zweimaliges Waschen der Membran mit 500 ul Waschpuffer (Puffer PE). </li><li> Werden 15 ul niedrigen Salz Elutionspuffer (Puffer EB) auf die Membran, um die gereinigte markierte DNA in einem Volumen von ~ 12 &amp; mgr; l zu gewinnen. </li></ol></li></ol> 3. Kombinieren Hyb Paare <ol><li> Kombinieren Sie die entsprechenden Paare von Cyanin 3 und 5-markierte DNA, COT-1-DNA, ein Hersteller gelieferten blockieren-Mix und ein Hersteller gelieferten Hybridisierungspuffer unter Verwendung eines flüssigen Handhabungsroboter. Hinweis: Diese hyb Paare können eine Probe und eine Referenz oder Probe vs Probe, wenn gemeinsamen CNVs sind kein Thema (zB wir routinemäßig zu koppeln Phänotyp-übereinstimmende Muster, wie ein Nierendysplasie Patienten vs einer Kraniosynostose Patienten, da sie sehr sind unwahrscheinlich, dass die gleichen klinisch signifikanten CNV tragen). Bei Verwendung einer Referenz-DNA ist eine kommerzielle DNA Versorgung empfohlen und sollte zusammen mit der Probe verarbeitet werden. <ol><li> Mit ein Liquid-Handling-roBot Fügen COT-1 DNA (3333 ng / ul), die vom Hersteller gelieferten Sperrmischung und Hybridisierungspuffer in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte, so dass jede Mulde 1,1 ul Cot-1-DNA, 4,95 &amp; mgr; l Blockierungs Mischung und 24.75 ul Hybridisierungspuffer. </li><li> Hinzufügen 9,35 ul des geeigneten Cyanin 3-markierter DNA in jede Kammer. Vornässen jede Spitze zu verbessern Pipettiergenauigkeit. </li><li> Hinzufügen 9,35 ul des geeigneten Cyanin5 markierten DNA in jede Kammer. Vornässen jede Spitze zu verbessern Pipettiergenauigkeit. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen und Vortex für 1 min. Drehen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen, um Inhalte auf den Boden jeder Vertiefung zu sammeln. </li></ol></li></ol> 4. Hybridisierung <ol><li> Heizen Sie eine Hybridisierungsofen auf 65 ° C vorwärmen und eine Trägerschlitten und einer Hybridisierungskammer für jedes Array Objektträger. <ol><li> Denaturieren der markierten DNA in einem vorge Hybridisierungsinkubation bevor Aufbringen auf den Arrays. Führen Sie die Hybridisierung in einem rotierenden Ofen für 24 Stunden. </li><li> Inkubiere die Platte mit 96 Vertiefungen bei 70 ° C für 30 min und dann lassen bei 37 ° C für mindestens 5 min. </li><li> Die Arbeit an einem beheizten Plattform bei 42 ° C, laden jede Sicherung Rutsche in eine Hybridisierungskammer vor der Verwendung. Sicherzustellen, dass der transparente Teil der Dichtung Schieber fluchtet mit dem &quot;gefensterten&quot; Teil des Hybridisierungskammer. </li><li> Pipettieren Sie 42 ul des Hybridisierungsmischung vorbereitete (siehe Abschnitt 3) auf die entsprechende Position auf dem Array sichern Rutsche. Vornässen jede Spitze zu verbessern Pipettiergenauigkeit. Pipette langsam auf die Mitte jeder Position, so dass die Flüssigkeit nicht den Gummiring Grenze berühren. </li><li> Wenn alle Positionen auf dem Trägerschlitten gefüllt sind, lassen Sie das Array Rutsche auf sie und die Hybridisierungskammer zu montieren. Stellen Sie sicher, dass die Seite der Anordnung mit Schreiben auf es mit Blick auf die Unterlage Rutschbahn. Achten Sie darauf, die Hybridisierungskammer Schraube festdrehen. </li><li> Überprüfen Sie die zusammengebauten Hybridisierungskammer. ENSure daß es keine Leckage von Hybridisierungsmischung außerhalb der Gummiring Grenzen und jede Luftblase ~ 4 mm in der Höhe, wenn die Hybridisierungskammer ist an seinem Ende senkrecht ruhte. Drehen Sie die Hybridisierungskammer und überprüfen, dass sich keine Luftblasen, die in Position und bewegt sich nicht stecken. Wenn es irgendwelche von ihnen, geben dem Raum einen starken Schlag auf die Bank. Überprüfen Sie, ob alle Luftblasen in Bewegung sind. </li><li> Platzieren Sie die Hybridisierungskammer in den rotierenden Ofen bei 65 ° C für 24 Stunden. Sicherstellen, dass der Ofen Rotor ist ausgewogen; verwenden andere leere Kammern, falls erforderlich. </li></ol></li></ol> 5. Waschen und Scannen von Dias <ol><li> Waschen Sie Arrays, um überschüssige markierte DNA zu entfernen und dann scannen, um Fluoreszenz jeder Probe zu messen. <ol><li> Nehmen Hybridisierungskammern aus dem Ofen und zu demontieren. Die Array-und Dichtungsfolien werden miteinander verklebt werden; tauchen diese in Waschpuffer 1 und mit einem Paar aus Kunststoff, Flachzange eingefasst, sie auseinander zu hebeln. </li><li> Discard die Dichtung Rutsche und legen Sie das Array Rutsche in ein Rack in Puffer 1 getaucht. </li><li> Waschen Sie die Array-Folie in ~ 700 ml frischem Waschpuffer 1 für 5 Minuten, unter starkem Rühren (mit einem Floh und Magnetrührer). </li><li> Übertragen Sie die Array-Folie, um ~ 700 ml Waschpuffer 2 und waschen für 90 sec, unter kräftigem Rühren. Gently heben Sie die Array gleitet aus Waschpuffer 2, sollten sie trocken entstehen. </li><li> Laden Sie das Array Abgleiten in einen Objektträgerhalter aus dem Scanner, über einen Schiebeschutz. Legen Sie die Folie in das Array-Scanner und scannen folgenden des Arrays Herstellers. </li></ol></li></ol>

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	<li>Miller, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+statement:+chromosomal+microarray+is+a+first-tier+clinical+diagnostic+test+for+individuals+with+developmental+disabilities+or+congenital+anomalies.">Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies.</a> Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).</li><li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+CGH+as+a+first+line+diagnostic+test+in+place+of+karyotyping+for+postnatal+referrals+-+results+from+four+years'+clinical+application+for+over+8,700+patients.">Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients.</a> Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).</li><li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+implementation+of+array+comparative+genomic+hybridisation+as+a+first+line+test+in+place+of+postnatal+karyotyping+for+genome+imbalance.">Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance.</a> Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).</li><li>Beaudet, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+chromosomal+microarray+analysis+in+developmental+and+behavioral+pediatrics.">The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics.</a> Child Dev. 84, 121-132 (2013).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implementation+of+whole-genome+array+CGH+as+a+first-tier+test+in+5080+pre+and+postnatal+cases.">Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases.</a> Mol. Cytogenet. 4, 12 (2011).</li><li>Iafrate, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+large-scale+variation+in+the+human+genome.">Detection of large-scale variation in the human genome.</a> Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).</li><li>Redon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+variation+in+copy+number+in+the+human+genome.">Global variation in copy number in the human genome.</a> Nature. 444, 444-454 (2006).</li><li>Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+features+in+patients+with+15q11.2(BP1-BP2)+deletion:+Further+delineation+of+an+emerging+syndrome.">Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome.</a> Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).</li><li>Molin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microdeletion+syndrome+at+3q13.31+characterised+by+developmental+delay,+postnatal+overgrowth,+hypoplastic+male+genitals,+and+characteristic+facial+features.">A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features.</a> J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).</li><li>Tropeano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-biased+autosomal+effect+of+16p13.11+copy+number+variation+in+neurodevelopmental+disorders.">Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders.</a> PLoS One. 8, e61365 (2013).</li><li>Bon, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+delineation+of+the+15q13+microdeletion+and+duplication+syndromes:+a+clinical+spectrum+varying+from+non-pathogenic+to+a+severe+outcome.">Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome.</a> J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Array-CGH wird ausgewogenen Umlagerungen oder Ploidie Anomalien wie Triploidie nicht erkennen. Ferner können geringe mosaic Ungleichgewichte nicht erkannt werden. Hat Array-CGH jedoch eine höhere Auflösung für CNV Erkennung als G-gebändert Chromosomenanalyse, die es in vielen Labors Zytogenetik ersetzt hat. Es ist daher der derzeitige Goldstandard für die genomweite CNV-Erkennung. Sie kann von der nächsten Generation Sequenziertechnologien in der Zukunft ersetzt werden, aber derzeit, ihre Kosten und die technischen Schwierigkeiten, die mit Hilfe kurzer verbunden liest für CNV Nachweis, dass dies noch nicht eine gute Passform für die klinische Anwendung. Das hier beschriebene Protokoll ist in den Routineeinsatz in unserer klinischen Servicelabor. Zwei Läufe von jeweils 96 Proben werden jede Woche verarbeitet unter Verwendung eines flüssigen Handling-Roboter und eine spezielle Silica-Membran-Spin-Säule Bearbeitungsroboter. Automation wird dringend empfohlen, um die Konsistenz zu verbessern und die Qualität zu erhalten. DNA aus Blut extrahiertSpeichel, pränatale Proben (zB Chorionzotten oder amniotischen Fluid) oder Gewebeproben kann und routinemßig heißt, mit diesem Protokoll verwendet. Ozon ist bekannt, Cyaninfarbstoffe abbauen und damit Ozon Überwachung und den Schutz empfohlen. Jahreszeitlichen Schwankungen der Ozonwerte ist ebenfalls üblich. Unser Labor überwacht und zeichnet die Ozonwerte kontinuierlich. Ein Wandozonentfernungseinheit wird verwendet, um die Ozonwerte und besonders empfindliche Teile des Protokolls zu reduzieren (dh das Waschen und Scanning-Arrays) in ozonfreien Hauben durchgeführt. Wenn möglich, werden die Ozonwerte unter 5 ppb gehalten. Die meisten Reagenzien als Kits von Herstellern, um effektiv auslagern Qualitätskontrolle gekauft werden; Dies hat sich als eine wirksame Strategie sein. Allerdings bedeutet dies nicht, dass die Qualitätskontrolle ist nicht erforderlich. Tatsächlich sind Qualitätsmetriken sorgfältig auf etwaige Anomalien überwacht: Derivat Standardabweichung der log2-Verhältnisse (DLRs) sollten eingebaute Lelow 0,2 sollte Cyanin 3 und 5-Signal-Intensitäten von mehr als 500 und Cyanin-3 und 5-Signal-Rausch-Verhältnissen sollte&gt; 30 sein. Diese Kennzahlen sind als Teil des Scan-Protokoll, das von der Scan-Software erzeugt und für die Langzeitüberwachung aufgezeichnet.

Es ist seit vielen Jahren, dass Deletionen oder zusätzliche Kopien von Chromosomensegmente verursachen geistiger Behinderung, Dysmorphien und congentical Fehlbildungen bekannt, und in einigen Fällen dazu führen, genetische Syndrome 1. Doch die einzige Technologie zur Verfügung, bis Mitte der 2000er Jahre für die genomweite Erfassung dieser Veränderungen war, G-gebändert Chromosomenanalyse, die eine Auflösung von rund 5-10MB hat, je nach Region und Art des Ungleichgewichts und welche nicht abnorme Chromosomen, wo Material wurde von einer Region aus einem anderen Chromosom mit der gleichen Bandenmuster ersetzt. Neben zytogenetischen Techniken wie Fluoreszenz in situ Hybridisierung und Multiplex Ligation-spezifischen Sonde Verstärkung wurden für die Abfrage bestimmter Loci vorhanden, bei Verdacht auf bestimmte syndromale Ungleichgewicht, aber es war nicht bis zur Einführung der Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) in der klinischen Routinediagnose service 2-5, die genomweite Erfassung der Kopienzahl-Varianten (CNVs) wurde zu einem stark erhöhten Auflösung (typischerweise um 120kb) möglich. Klinische Servicearbeiten neben Studien haben gezeigt, dass CNVs für einige Regionen in der Normalbevölkerung 6-7 weit verbreitet, während andere CNVs, die zuvor nicht nachweisbar, werden mit neurodisabilities wie Autismus und Epilepsie 8-11 verbunden. Die in diesem Dokument beschriebenen Protokoll wird in unserem UK National Health Service (NHS) klinisch-diagnostischen Labor; wir neuartige Hybridisierung Strategien, Chargenprüfung und Robotik zu Kosten in diesem staatlich finanzierten Dienst minimieren. Vor dem unten beschriebenen Protokoll sollte hochwertige DNA aus dem entsprechenden Ausgangsmaterial, meist Blut, kultivierten Zellen oder Gewebeproben entnommen werden. Spektrophotometrie verwendet werden, um Konzentration zu messen (sollte&gt; 50 ng / ul) und prüfen 260: 280 Absorptionsverhältnisse (zu be von 1,8 bis 2,0). Die Gelelektrophorese kann kontrolliert werden, dass die DNA mit hohem Molekulargewicht ohne signifikanten Abbau werden. Dieses Protokoll wird für einen höheren Durchsatz Laboratorien, Kennzeichnung 96 Proben pro Lauf mit automatisierten Liquid-Handling-Robotik sollen. Es kann jedoch für niedrigere Durch Labors ohne Automatisierung angepaßt werden.

<table><tbody><tr><td>CGH microarray 8 x 60K</td><td>Agilent</td><td>G4126</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH wash buffers</td><td>Agilent</td><td>5188-5226</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH hybridisation buffer</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Minelute purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH labelling kit</td><td>Enzo</td><td>ENZ-42672-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

array comparative genomic hybridization (array cgh) for detection of genomic copy number variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Jede Sonde auf einem Array hybridisiert wird als eine Mischung aus roten und grünen Fluorochrome visualisiert (siehe Abbildung 1). Das Verhältnis von rot nach grün fluoreszierenden Signals für jede Sonde wird vom Scanner quantifiziert und die zugehörige Software zeichnet diese als log2 Verhältnisse entsprechend ihrer genomischen Position und identifiziert Bereiche, die außerhalb voreingestellten Grenzen. Die resultierende Array Spuren ermöglichen Interpretation der Regionen als genomisch unsymmetrische identifiziert. Zum Beispiel kann die Spur von einem Kind mit Williams-Syndrom, einer wiederkehrenden Mikrodeletionssyndrom von low copy Wiederholungen in der proximalen Region des Chromosoms 7 vermittelt, ist in Abbildung 2 dargestellt. Dieses Ungleichgewicht durch die Software identifiziert und mit einer roten Linie angezeigt. Sondenfluoreszenzprotokoll Verhältnisse sollte eng um 0 Cluster, wie in Abbildung 2 dargestellt, die einen grün / rot-Verhältnis von 1: 1 für den normalen Regionen des Genoms. Verstreut Array Spuren können Resul<html> t ungenauen Berufung abnorme Regionen oder Nicht genomische Ungleichgewicht zu identifizieren (siehe Abbildung 3). Solche Streuung kann durch eine Anzahl von Faktoren, einschließlich schlechte DNA-Qualität, oder die Anwesenheit von erhöhten Niveaus von Ozon in der Atmosphäre verursacht werden. Die Überwachung der Ozonwerte wird empfohlen, und wo erhöhte Ozonwerte problematisch sind, gewidmet Ozon Ausschluss Schränke vorhanden; Verwendung dieser Schränke führt im Allgemeinen zu einer deutlich verbesserten Qualität Array. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51718/51718fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1. Bild eines Feldes nach der Hybridisierung. Die weiße Box zeigt einen vergrößerten Bereich, in rot und grün Sonden Sonden können sichtbar gemacht werden (mit Angabe Ungleichgewicht für die Regionen, die von diesen Sonden dargestellt), vor dem Hintergrund einer gelben Sonden (Angabe ausgewogene genomischen Regionen ). NHALT &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51718/51718fig2highres.jpg" width="600" /> Figur 2 (A) Beispiel Spur für das Chromosom 7 in einer Probe mit einer 1,7 MB Deletion von einem mittleren Verhältnis von -0,8 für 43 aufeinander folgende Sonden gezeigt. Die deletierten Region in diesem Fall mit Williams-Beuren-Syndrom, die mit der Überweisung Angabe Dysmorphien, Herzfehler und geistiger Behinderung verbunden. (B) Die gelöschten Bereich oberhalb der USCS Genom-Browser angezeigt, aus der die Gene innerhalb des gelöscht Region. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51718/51718fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51718/51718fig3highres.jpg" width="600" /> Abbildung 3.Beispiel einer Streu Array-Trace für Chromosom 7 in einer Probe mit geringer Hybridisierung. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51718/51718fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volumen (ul) </td></tr><tr><td> Grundierungen und Reaktionspuffer </td><td align="right"> 20 </td></tr><tr><td> DNA (1 ug) + Wasser </td><td align="right"> 20 </td></tr><tr><td> Klenow-DNA-Polymerase, Exonuklease </td><td align="right"> 10 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Zusammenfassung der für die Markierungsreaktion eingesetzten Reagenzien.

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Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array-CGH für den Nachweis von genomischer Kopienzahl-Varianten hat G-gebändert Karyotypanalyse ersetzt. Dieses Papier beschreibt die Technologie und ihre Anwendung in einem Diagnose-Service-Labor.

Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) zum Nachweis von Genomic Copy Number Varianten

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

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Research

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Biology

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

19.5K Aufrufe.  Guy's & St Thomas' NHS Foundation Trust.  Array-CGH für den Nachweis von genomischer Kopienzahl-Varianten hat G-gebändert Karyotypanalyse ersetzt. Dieses Papier beschreibt die Technologie und ihre Anwendung in einem Diagnose-Service-Labor. 

Serie: Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Forschung

Genetik

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

Serum und Plasma Kopie Nummer Erkennung mittels Real-Time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Krebsforschung

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including biological such as T-DNA or transposon, chemical such as ethyl methanesulfonate (EMS), or physical such as ionization radiation. The type of mutation observed varies depending on the mutagen used. For ionization radiation induced mutants, mutations include deletion, duplication, or rearrangement. While T-DNA or transposon-based mutagenesis is limited to species that are susceptible to transformation, chemical or physical mutagenesis can be applied to a broad range of species. However, the characterization of mutations derived from chemical or physical mutagenesis traditionally relies on a map-based cloning approach, which is labor intensive and time consuming. Here, we show that a high-density genome array-based comparative genomic hybridization (aCGH) platform can be applied to efficiently detect and characterize copy number variations (CNVs) in mutants derived from fast neutron bombardment (FNB) mutagenesis in Medicago truncatula, a legume species. Whole genome sequence analysis shows that there are more than 50,000 genes or gene models in M. truncatula. At present, FNB-induced mutants in M. truncatula are derived from more than 150,000 M1 lines, representing invaluable genetic resources for functional studies of genes in the genome. The aCGH platform described here is an efficient tool for characterizing FNB-induced mutants in M. truncatula.

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

This protocol provides experimental steps and information about reagents, equipment, and analysis tools for researchers who are interested in carrying out whole genome array-based comparative genomic hybridization (CGH) analysis of copy number variations in plants.

Eine Array-basierte Comparative genomische Hybridisierung Plattform für effiziente Erkennung der Kopie Zahl Variationen in schnellen Neutronen induziert Medicago Truncatula Mutanten

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

Technische Demonstration von Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Biologie

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation genetic test, this technique has its unique advantages in scalability, throughput, and cost. For the pre-implantation genetic test for aneuploidy analysis, the semiconductor-based next-generation sequencing (NGS) system presented here provides a comprehensive approach to determine structural genetic variants at a minimum resolution of 8 Mb. From sample acquisition to the final report, the working process requires multiple steps with close adherence to protocols. Since various critical steps could determine the outcome of amplification, quality of the library, coverage of reads, and output of data, descriptive information with visual demonstration other than words could offer more detail to the operation and manipulation, which may have a great impact on the results of all critical steps. The methods presented herein will display the procedures involved in whole genome amplification (WGA) of biopsied Trophectoderm (TE) cells, genomic library construction, sequencer management, and finally, generating copy number variants' reports.

The protocol presents the overall in-lab procedures required in pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor-based next-generation sequencing platform. Here we present the detailed steps of whole genome amplification, DNA fragment selection, library construction, template preparation, and sequencing working flow with representative results.

Präimplantations-Gentests für Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Next-Generation-Sequenzierungsplattform

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective anti-tumor strategies. Although concerns are frequently raised due to differences in sample processing and depth of coverage, next-generation sequencing of solid tumors have unraveled a highly variable degree of ITH across tumor types. Capturing the genetic relatedness between primary and metastatic lesions through the identification of clonal and subclonal populations is critical to the design of therapies for advance-stage diseases. Here, we report a method for comparative lesions analysis that allows for the identification of clonal and subclonal populations among different specimens from the same patient. The experimental approach described here integrates three well-established approaches: histological analysis, high-coverage multi-lesion sequencing, and immunophenotypic analyses. In order to minimize the effects on the detection of subclonal events by inappropriate sample processing, we subjected tissues to careful pathological examination and neoplastic cell enrichment. Quality controlled DNA from neoplastic lesions and normal tissues was then subjected to high coverage sequencing, targeting the coding regions of 409 relevant cancer genes. While only looking at a limited genomic space, our approach enables evaluating the extent of heterogeneity among somatic alterations (single-nucleotide mutations and copy-number variations) in distinct lesions from a given patient. Through comparative analysis of sequencing data, we were able to distinguish clonal vs. subclonal alterations. The majority of ITH is often ascribed to passenger mutations; therefore, we also used immunohistochemistry to predict functional consequences of mutations. While this protocol has been applied to a specific tumor type, we anticipate that the methodology described here is broadly applicable to other solid tumor types.

This article describes a method to identify clonal and subclonal alterations among different specimens from a given patient. Although the experiments described here focus on a specific tumor type, the approach is broadly applicable to other solid tumors.

Vergleichende Lesionsanalyse durch einen gezielten Sequenzierungsansatz

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Verhalten

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridisierung und Scannen

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

Erkennen Somatische Genetische Veränderungen in Tumorproben von Exon-Abscheidung und-Massively Parallel Sequencing

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

DNA Microarrays

Microarrays are high-throughput and relatively inexpensive assays that can be automated to analyze large quantities of data at a time. They are used in genome-wide studies to compare gene or protein expression under two varied conditions, such as healthy and diseased states. Microarrays consist of glass or silica slides on which probe molecules are covalently attached through surface functionalization. Most commonly, the slides are prepared through the chemisorption of silanes to silica surfaces.
While DNA microarrays are used to monitor gene expression, protein microarrays detect biologically relevant interactions of a fluorescently labeled protein with other proteins, DNA, or small molecules.
DNA microarray slides are often called gene chips or DNA chips. DNA chips are widely used to profile thousands of genes parallelly. Other than gene expression, they are also used in studying microRNA expression, DNA copy numbers, and single-nucleotide polymorphism detection. Commercially, these chips are used in biotechnology, forensics, toxicology, drug discovery, and targeted therapy for infectious and genetic diseases.
The chemically stable nature of DNA probes makes DNA chips the most popular of the microarray technologies. The covalently bound single-stranded DNA probe retains its native interactions despite harsh chemicals and temperatures that are used during probe loading and chip preparation.
The most obvious shortcoming of DNA microarrays is the prerequisite of a known target sequence. Because DNA microarray probes are designed to complement the target cDNA sequence, the sequence of the mRNA from which the cDNA is copied must be known. This makes the technology unusable while looking for novel mRNA sequences. For such purposes, RNASeq is the preferred albeit expensive option.

DNA Microarrays: High-throughput Gene Expression Profiling

DNA-Microarrays

Microarrays are high-throughput and relatively inexpensive assays that can be automated to analyze large quantities of data at a time. They are used in ...