Chiara Molinari und Filippo Martignano danken wir für die Unterstützung bei der Datenanalyse.

Das Protokoll besteht aus der Isolierung der DNA aus Serum oder Plasma-Proben, Real-Time PCR für Kopie Zahlenanalyse durchzuführen. DNA-Extraktion, DNA-Menge Kontrolle (Spektralphotometer) und Real-Time PCR für spezifische Ziele wurden durchgeführt. In Abbildung 1eine Zusammenfassung der Verfahren und der Zeitleiste werden gemeldet.
Das Protokoll folgt den Richtlinien des menschlichen Forschungsethikkommission IRST.
(1) Serum Erhebung und Verarbeitung
<ol>
	<li>Sammeln Sie etwa 5 mL Vollblut in einem Serum Röhrchen ohne Antikoagulans, Serum zu erhalten. Pflegen Sie Blut Rohre bei 4 ° C bis zur Verarbeitung.</li>
	<li>Zentrifuge Rohre bei 1.000 x g für 15 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Übertragen Sie in 2 mL Röhrchen Serum sorgfältig.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Sammelrohr und sofort einfrieren des Überstands bei-80 ° C bis zur Verwendung.</li>
</ol>
(2) Plasma Erhebung und Verarbeitung
<ol>
	<li>Sammeln Sie etwa 10 mL Vollblut in einer Plasma-Röhre mit EDTA Plasma zu erhalten. Die Röhrchen vollständig füllen und es dann 8 Mal zu invertieren. Pflegen Sie Blut Rohre bei 4 ° C bis zur Verarbeitung.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1.800 x g für 15 min bei Raumtemperatur mit keine Einstellung "Bremse" auf der Zentrifuge.</li>
	<li>Übertragen Sie den oberen Teil des Plasmas in 2 mL Röhrchen vorsichtig. Wiederholen Sie die Übertragung, mindestens 1 mL des Überstands oberhalb der weißen Blutkörperchen-Ebene zu verlassen. Hinweis: Übertragung den oberen Teil des Überstands reduziert das Risiko einer Kontamination durch Zellen oder Zellenrückstand.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Sammelrohr und sofort einfrieren des Überstands bei-80 ° C bis zur Verwendung.</li>
</ol>
3. DNA-Isolierung aus Serum oder Plasma
Hinweis: Isolierung der DNA aus Serum oder Plasma sollte mit dem kommerziellen Protokoll geändert in den folgenden Schritten durchgeführt werden.
<ol>
	<li>Tauen Sie eine aliquote (mit 0,5 bis 2 mL) von Serum oder Plasma bei Raumtemperatur auf.</li>
	<li>Wirbel und mischen die Probe und 0,5 mL Serum oder Plasma in ein klares 1,5 mL Röhrchen zu übertragen. Den Rest des Materials bei-80 ° c eingefroren</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL Proteinase k (20 mg/mL) direkt auf die Probe.</li>
	<li>Das Beispiel 0,5 mL Lyse Puffer hinzu und mischen Sie gut durch pipettieren.</li>
	<li>Schließen Sie die Rohre und inkubieren Sie Proben bei 56 ° C für 15 min in den Heizblock.</li>
	<li>Fügen Sie den angegebenen Betrag von 100 % Ethanol in Waschpuffer 1 und 2, gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Bringen Sie die Proben wieder auf Raumtemperatur und geben Sie 0,5 mL absolutes Ethanol zu und mischen Sie gut durch pipettieren.</li>
	<li>Fügen Sie 650 µL der in Schritt 3.7 der Trennsäule und Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min erhaltenen Mischung hinzu.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Röhrchen mit der Durchströmung und legen Sie die Spalte auf eine neue saubere Sammelröhrchen. Wiederholen Sie die Schritte 3.8 und 3.9 noch einmal.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL Waschpuffer 1, ohne den Rand der Spalte und Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min Benetzung.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Röhrchen mit der Durchströmung und ersetzen Sie ihn durch einen neuen sauberen Sammelröhrchen.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL Waschpuffer 2, ohne den Rand der Spalte und Zentrifuge mit voller Geschwindigkeit (20.000 x g) für 3 min Benetzung.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Röhrchen mit der Durchströmung und ersetzen Sie ihn durch einen neuen sauberen Sammelröhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie auf Hochtouren (20.000 x g) für 3 min um jede verbleibende waschen-Puffer zu entfernen.</li>
	<li>Legen Sie die Spalte in eine saubere 1,5 mL-Tube. Fügen Sie 150 µL Elution Buffer und warten Sie 7 min um sicherzustellen, dass die Puffer die Spalte benetzt.</li>
	<li>8.000 x g für 1 min zentrifugieren.</li>
	<li>Pipette Elute von 3.16 Schritt wieder in der gleichen Spalte und Zentrifuge mit voller Geschwindigkeit (20.000 x g) für 1 min um maximale Erholung von DNA zu gewährleisten.</li>
</ol>
4. DNA-Quantifizierung und Verdünnung
<ol>
	<li>Durchführen Sie Quantifizierung der DNA mit einem Spektralphotometer. Verwenden Sie 2 µL Probe auf einem Benchtop-Spektralphotometer gemäß den Herstellerangaben. Hinweis: Wenn die DNA-Menge mit Real-Time PCR Verfahren nicht ausreicht (mindestens 120 ng), führen Sie einen neuen DNA-Isolierung Prozess.</li>
	<li>Verdünnen Sie DNA aus Serum oder Plasma zu 2,5 ng/µL in einem Endvolumen ausreichend für alle Echtzeit-PCR (ca. 50 µL).</li>
</ol>
(5) Real-Time PCR
<ol>
	<li>Tauen Sie Exemplar Nummer Assays, Referenz-gen-Test, DNA verdünnt Proben und Kalibratoren gebündelt im Eis auf. Equilibrate bei Raumtemperatur den master-Mix, der bei 4 ° c gelagert ist</li>
	<li>Bereiten Sie eine Mischung von 1 µL des Ziel-Assay, 1 µL des Referenz-Gen-Tests und 10 µL des master-Mix für 3 Wiederholungen für jede Probe und Kalibratoren gebündelt. Bereiten Sie die Mischung unter anderem eine Negativkontrolle (Wasser) und 2 zusätzliche Proben.</li>
	<li>In einem 96 well-Platte, aliquoten 12 µL des Mixes in jede Vertiefung. Tun Sie nicht Pipette oder Spin Röhren.</li>
	<li>Fügen Sie 8 µL (Konzentration von 2,5 ng/µL) der einzelnen DNA-Probe und Kalibratoren gebündelt in jede Vertiefung. Tun Sie nicht Pipette oder Spin Röhren. Die Tipp für jede Vertiefung zu ändern. Hinweis: 30 DNA-Proben können verarbeitet werden, für jede Echtzeit-Experiment mit der 96-Well-Platte: 30 x 3 Proben + 1 x 3-Kalibratoren gepoolten + negative Kontrolle = 94.</li>
	<li>Kurz spin-down der Platte bei 1.000 x g.</li>
	<li>Führen Sie die Platte über das folgende Protokoll: halten Bühne bei 95 ° C für 10 min, 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 1 min.</li>
</ol>
6. Daten-Analyse und Interpretation
<ol>
	<li>Setzen Sie im Abschnitt "Option", unterhalb der Verstärkung Plot Ergebnisse den Ct-Schwellenwert bei 0,2 für das erste Zielgen analysiert. Wiederholen Sie den Satz für jedes Ziel oder Referenz-Gene. Wenn die Echtzeit-PCR-Datei in Erweiterung .txt exportieren möchten, drücken Sie "Export" in Symbolleiste. Markieren Sie nur "Ergebnisse" in der SELECT-Anweisung Daten → exportieren wählen Sie als Dateityp der Erweiterung .txt → Presse "Export starten" → schließen das Export-Tool.</li>
	<li>Öffnen Sie die Analysesoftware und importieren Sie die Datei .txt (Symbolleiste → Import).</li>
	<li>Wählen Sie den Namen der Datei zu analysieren und wählen die Analyse-Einstellung durch die Toolbar (Play-Symbol).</li>
	<li>Geben Sie der Kalibrator Probe und die bekannte Anzahl der Kopien des Ziels (z. B. 1 Kopie für AR -gen). Klicken Sie auf "anwenden".</li>
	<li>Lassen Sie für jede Probe einen Brunnen mit verschiedenen Delta Ct (ΔCt) im Vergleich zu anderen Brunnen.</li>
	<li>Das Experiment (Press Play-Symbol) zu diagnostizieren.</li>
	<li>Werten Sie die Ergebnisse durch die Kopienzahl bar Plot oder die Tabelle. Hinweis: Die Ergebnistabelle enthält zahlreiche Parameter wie Vertrauen, Z-Score und Wiederholungen analysiert, die für die Interpretation der Ergebnisse nützlich sein könnte.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+as+a+diagnostic+marker+for+cancer:+current+insights.">Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights.</a> Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).</li><li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+as+a+liquid+biopsy+for+cancer.">Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer.</a> Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).</li><li>Murtaza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+analysis+of+acquired+resistance+to+cancer+therapy+by+sequencing+of+plasma+DNA.">Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA.</a> Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).</li><li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+detection+of+genome-wide+somatic+copy+number+alterations+by+liquid+biopsies.">Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies.</a> Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).</li><li>Diaz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+evolution+of+acquired+resistance+to+targeted+EGFR+blockade+in+colorectal+cancers.">The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers.</a> Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone.">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li><li>Romanel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+AR+and+abiraterone-resistant+prostate+cancer.">Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer.</a> Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).</li><li>Conteduca, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptor+gene+status+in+plasma+DNA+associates+with+worse+outcome+on+enzalutamide+or+abiraterone+for+castration-resistant+prostate+cancer:+a+multi-institution+correlative+biomarker+study.">Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study.</a> Ann Oncol. , (2017).</li><li>Attard, G., Antonarakis, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer:+AR+aberrations+and+resistance+to+abiraterone+or+enzalutamide.">Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide.</a> Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).</li><li>Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+genomic+DNA+in+plasma+and+serum+samples:+higher+concentrations+of+genomic+DNA+found+in+serum+than+in+plasma.">Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma.</a> Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).</li><li>Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+preanalytical+factors+on+the+molecular+size+of+cell-free+DNA+in+blood.">Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood.</a> Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).</li></ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

AR CN-Analyse in Serum und Plasma Probe stellt eine neue, nicht-invasive Ansatz für die Stratifizierung von Patienten mit Kastration resistenten Prostatakrebs (CRPC). Es wurde kürzlich nachgewiesen, dass AR CN Ergebnisse in CRPC Patienten mit Abiraterone und Enzalutamid, vor und nach der Chemotherapie7,8,9,10vorhersagen kann.
Der Hauptvorteil unse...

Zirkulierenden Zelle freie DNA (Blut) im Blut nachgewiesen wurde eine optimale Quelle für Biomarker für Krebs-Diagnose, Prognose, Überwachung und Prognose der Behandlung Widerstand1,2. Viele Studien zeigen eine gute Übereinstimmung zwischen DNA-Veränderungen (Mutationen, Kopie Nummer Variationen, epigenetische Veränderungen im Gewebe) und denen in entsprechenden Plasma Proben1, bestätigt, dass im Umlauf Tumor-DNA (CtDNA) informativ für Primär- und metastasiertem Tumor Gewebe Veränderungen3. Die Möglichkeit des Studiums CtDNA ermöglicht somit für den Wiederaufbau der genomic Rearrangements und Kopie Nummer Variationen (CNV) bei bestimmten Onkogene4Identifizierung potentiell metastasierendem klonale und subclonal Zellen. CtDNA hat sich gezeigt, zu klinisch nützlich vor allem für Krebs Behandlung überwachen, wie es bestimmte Mutationen und CNV, bezogen auf spezifische gezielte Therapien5,6birgt. Es überwindet die Notwendigkeit Gewebebiopsien und kann zu unterschiedlichen Zeitpunkten während einer bestimmten Krebs-Behandlung in einer nicht-invasive Weise erzielten Ergebnisse.
In Bezug auf Prostata-Krebs, eine signifikante Korrelation zwischen zirkulierenden zellfreie Androgen Rezeptor (AR) CNV und Behandlung Antwort auf Abiraterone und Enzalutamid ist gezeigt worden, Anzeige AR gen Kopienzahl (CN) im Blut kann ein vielversprechender Biomarker zur Vorhersage Behandlung Widerstand7,8,9,10,11. CNV bestimmter Gene in CtDNA mit verschiedenen Vorgehensweisen mit unterschiedlicher Empfindlichkeit, Kosten und Geschwindigkeit ausgewertet werden können (zB. in Echtzeit, digitale PCR und Next Generation Sequencing).
Hier beschreiben wir einen einfachen und schnellen Ansatz, basierend auf duplex-Assays in Echtzeit-PCR-Technologie für die Bewertung der AR CN in Blut, Serum und Plasma Proben7,8. Wir hielten zwei verschiedenen PCR-Assays entwickelt, auf zwei verschiedenen genomischen Regionen in Intron 5 AR (Xq12) und zwei andere Gene als interner standard Referenz Gene bekannt, um eine normale Nummer Kopierstatus bei Prostatakrebs (RNaseP, haben Das Hotel liegt auf 14q11; Vor1, befindet sich auf 1 s. 34). Wir haben zwei Referenz-Gene, anstatt ein, um die Präzision und Sensitivität der Ergebnisse zu erhöhen. Ein DNA-Menge von 60 ng wurde für jedes Assay-Kombination (kombinierte Assay für AR-assay_1 + RNaseP und AR-assay_2 + AGO1) verstärkt. Drei Serum oder Plasma DNA-Proben von gesunden Männern wurden gebündelt und als ein Kalibrator verwendet. Wir hielten Abschaltungen von &#62; 1,5 für AR Gewinn und &#60; 0,5 für die Löschung. Einer der wichtigsten Vorteile dieser Methode ist, dass es flexibel ist und dass auch andere Gene ausgewertet werden können, die internen Standardwerk Gene auf der Grundlage der Tumorart und Eigenschaften ändern.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer Serum Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>367814</td><td>whole blood tube for serum</td></tr><tr><td>BD Vacutainer EDTA Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>whole blood tube for plasma</td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>VWR</td><td></td><td>the user could use also other companies</td></tr><tr><td>TaqMan Copy Number assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4400291</td><td>Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283</td></tr><tr><td>TaqMan Copy Number assay (modified)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4467084</td><td>Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn</td></tr><tr><td>TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4403326</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4326708</td><td>Master mix for Real Time PCR</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>DNA extraction kit</td></tr><tr><td>MicroAmp 96-Well Plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N8010560</td><td>plates for realt time PCR</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>-</td><td>the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA</td></tr><tr><td>7500 Fast Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystem</td><td>-</td><td>the user could use also other real time instrument</td></tr><tr><td>CopyCaller Software</td><td>Applied Biosystem</td><td>-</td><td>Software for copy number analysis</td></tr></tbody></table>

serum and plasma copy number detection using real-time pcr

Serum und Plasma Zelle freie DNA (Blut) wurde als informativen, nicht-invasive Quelle Biomarker für Krebs-Diagnose, Prognose, Überwachung und Vorhersage von Therapieresistenz gezeigt. Ausgehend von der Hypothese, dass die Androgen-Rezeptor (AR) gen Kopienzahl (CN) zu gewinnen ist ein häufiges Ereignis bei metastasiertem Kastration Widerstand Prostatakrebs (mCRPC), schlagen wir vor, dieses Ereignis im Blut als potenzielle prädiktive Biomarker zu analysieren.
Wir evaluierten AR CN im Blut mit 2 verschiedenen Echtzeit-PCR-Assays und 2 Referenz-Gene (RNaseP und AGO1). DNA-Menge von 60 ng wurde für jedes Assay-Kombination verwendet. AR CN Gewinn wurde mit digitalen PCR als eine genauere Methode bestätigt. CN Variation Analyse bereits nachgewiesen, dass für die Vorhersage von Therapieresistenz in der Umgebung des mCRPC informativ sein, aber es könnte nützlich sein, auch für andere Zwecke in verschiedenen Patienten. CN-Analyse auf Blut hat mehrere Vorteile: Es ist nicht-invasiv, schnell und einfach durchzuführen, und es beginnt mit einem kleinen Volumen von Serum oder Plasma Material.

Insgesamt Blut Konzentration wurde durch Spektralphotometrie für alle Proben analysiert, mit einem Median von 6,12 ng/µL quantifizierbare (Bereich: 2,00-23,71 ng/µL) für Serumproben und einem Median von 3,21 ng/µL (Bereich: 2,31-8,49 ng/µL) für Plasma-Proben. Wir haben insgesamt 115 Proben von Real-Time PCR Experimente analysiert.
Testsensitivität wurde bewertet mit gemischten Serum DNA von Patienten mit hohen oder niedr...

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Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Dieses Manuskript beschreibt die Kopie Variation Zahlenanalyse in Serum oder Plasma DNA mit Echtzeit-PCR-Ansatz durchgeführt. Diese Methode eignet sich für die Vorhersage von Resistenzen in Kastration resistenten Prostatakrebs-Patienten, aber es könnte auch für andere Krankheiten informativ sein.

Serum und Plasma Kopie Nummer Erkennung mittels Real-Time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

serum-and-plasma-copy-number-detection-using-real-time-pcr

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.3K Aufrufe.  Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS. Dieses Manuskript beschreibt die Kopie Variation Zahlenanalyse in Serum oder Plasma DNA mit Echtzeit-PCR-Ansatz durchgeführt. Diese Methode eignet sich für die Vorhersage von Resistenzen in Kastration resistenten Prostatakrebs-Patienten, aber es könnte auch für andere Krankheiten informativ sein.

Serie: Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Verstärkung und Quantifizierung von HIV-1 RNA in HIV-infizierten Personen mit Viruslast unter der Nachweisgrenze von Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Forschung

Immunologie und Infektion

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a polymorphic cluster of genes on chromosome 19. Their best-characterized ligands are the human leukocyte antigen (HLA) molecules that are encoded within the major histocompatibility complex (MHC) locus on chromosome 6. There is substantial evidence that they play a significant role in immunity, reproduction, and transplantation, making it crucial to have techniques that can accurately genotype them. However, high-sequence homology, as well as allelic and copy number variation, make it difficult to design methods that can accurately and efficiently genotype all KIR genes. Traditional methods are usually limited in the resolution of data obtained, throughput, cost-effectiveness, and the time taken for setting up and running the experiments. We describe a method called quantitative KIR semi-automated typing (qKAT), which is a high-throughput multiplex real-time polymerase chain reaction method that can determine the gene copy numbers for all genes in the KIR locus. qKAT is a simple high-throughput method that can provide high-resolution KIR copy number data, which can be further used to infer the variations in the structurally polymorphic haplotypes that encompass them. This copy number and haplotype data can be beneficial for studies on large-scale disease associations, population genetics, as well as investigations on expression and functional interactions between KIR and HLA.

Quantitative killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) semi-automated typing (qKAT) is a simple, high-throughput, and cost-effective method to copy number type KIR genes for their application in population and disease association studies.

qKAT: Quantitative Flugbuchungssystem Typisierung von Killer-Zelle Immunoglobulin-Like-Rezeptor-Gene

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Genetik

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Krebsforschung

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

Simultane Quantifizierung von T-Zell-Rezeptor-Excision Kreis (TRECs) und K-Löschen Rekombination Excision Kreis (KRECs) durch Echtzeit-PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Biotechnik

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Biologie

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron transport chain. Unlike the diploid nuclear genome, most cells contain many more copies of mtDNA, ranging from less than 100 to over 200,000 copies depending on cell type. MtDNA copy number is increasingly used as a biomarker for a number of age-related degenerative conditions and diseases, and thus, accurate measurement of the mtDNA copy number is becoming a key tool in both research and diagnostic settings. Mutations in the mtDNA, often occurring as single nucleotide polymorphisms (SNPs) or deletions, can either exist in all copies of the mtDNA within the cell (termed homoplasmy) or as a mixture of mutated and WT mtDNA copies (termed heteroplasmy). Heteroplasmic mtDNA mutations are a major cause of clinical mitochondrial pathology, either in rare diseases or in a growing number of common late-onset diseases such as Parkinson's disease. Determining the level of heteroplasmy present in cells is a critical step in the diagnosis of rare mitochondrial diseases and in research aimed at understanding common late-onset disorders where mitochondria may play a role. MtDNA copy number and heteroplasmy have traditionally been measured by quantitative (q)PCR-based assays or deep sequencing. However, the recent introduction of ddPCR technology has provided an alternative method for measuring both parameters. It offers several advantages over existing methods, including the ability to measure absolute mtDNA copy number and sufficient sensitivity to make accurate measurements from single cells even at low copy numbers. Presented here is a detailed protocol describing the measurement of mtDNA copy number in single cells using ddPCR, referred to as droplet generation PCR henceforth, with the option for simultaneous measurement of heteroplasmy in cells with mtDNA deletions. The possibility of expanding this method to measure heteroplasmy in cells with mtDNA SNPs is also discussed.

Here we present a protocol for measuring absolute mitochondrial (mt)DNA copy number and mtDNA deletion heteroplasmy levels in single cells.

Messung der einzelligen mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Heteroplasmie mittels digitaler Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Medizin

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Absolute Quantifizierung von MicroRNA-Plasmaspiegel bei Cynomolgus Affen, über Quantitative Real-Time Reverse Transkription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Real Time RT-PCR

Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction, or Real-time RT-PCR, is an analytical tool used to determine the expression level of target genes. The method involves converting mRNA to complementary DNA with the help of an enzyme known as reverse transcriptase, followed by the PCR amplification of the cDNA. These two processes can be performed simultaneously in a single tube or separately as a two-step reaction.
The real-time quantification of the number of amplified products is carried out either using fluorescent dyes or sequence-specific probes linked to a fluorophore. The fluorescent dyes used in this case can specifically bind to double-stranded DNA and exhibit fluorescence only when bound to DNA. Fluorescence is measured at the end of each PCR cycle after the synthesis of the complementary strand. In the case of fluorophore-labeled probes, fluorescence is exhibited when the fluorophore is cleaved from the probe during the synthesis of the complementary strand. Fluorescence exhibited by these molecules is then detected by photodetectors that convert the fluorescence signals to a readable format. Real-time RT-PCR requires a specialized PCR machine equipped with a detector to enable real-time quantification, as a traditional PCR machine is not equipped for such analysis.
The output can be analyzed in a number of ways. One way is to count the number of cycles required for the fluorescence to reach detectable levels. The threshold cycle, denoted by Ct, is when the fluorescence is detected over and above the background noise. The greater the quantity of the target in the starting material, the faster the significant increase in fluorescence will appear, resulting in a lower Ct. The Ct value finds application in the downstream quantification or detection of the presence or absence of the target sequence. Additionally, comparing the Ct values of samples of unknown concentration with a series of Ct values obtained from standard concentration can determine the amount of template in an unknown reaction. This is known as absolute quantification and can also be carried out by comparing the fluorescence to a standard curve prepared using known DNA concentrations.

Real-time RT-PCR: Principle; Quantifying Gene Expression

Echtzeit-RT-PCR

Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction, or Real-time RT-PCR, is an analytical tool used to determine the expression level of target ...