The authors have no acknowledgements.

1.標識反応<ol><li> 96ウェルプレートおよび使用の準備-20℃で保存し、製造業者が推奨する濃度において、プレアリコートシアニン3及び5標識dUTPs、非標識ヌクレオチドおよびランダムプライマーを使用する前に。このプロトコルは、各ウェルにdUTPを10.5μlの未標識ヌクレオチドおよびランダムプライマーを標識し、適切のアリコート10.5μlのの目的のために。 </li><li>光から保護し、約1時間、4℃でヌクレオチドおよびプライマーのすぐに使用できる96ウェルプレートを解凍する。 </li><li>解凍後は、光から保護し、少なくとも30分間室温でこのプレートを平衡化する。 </li><li>少なくとも15分間、60℃でDNAサンプルを平衡化する。 </li><li>液体ハンドリングロボットを用いて、96ウェルプレートの各ウェルにヌクレアーゼフリー水を分配する。 注記：水の体積は、各入力DNA試料の濃度に依存し、そして/μlの最終濃度50ngをもたらすのに十分であるべきである。 </li><li>液体漢の使い方dlingロボット、96ウェルプレートのウェルにピペット1μgのDNAは、（1.5を参照）20μlに全量を。 注記：結果データの品質が損なわれる可能性があるが、DNAの小さい量を使用することができる（貴重なサンプルのために、400ngのまでインプットDNA量を使用することができる）。 </li><li>液体ハンドリングロボットを用いて、希釈したDNAのプレートの各ウェルに平衡化ヌクレオチドおよびプライマーの20μlのを転送する。 </li><li> （気密シールは非常に重要です）ストリップキャップで96ウェルプレートをシール。 </li><li>加熱された蓋をPCR機で10分間、99℃でDNAを変性させ、その後アニールするプライマーを氷上で5分間クールスナップ。 </li><li>液体処理ロボットを用いて、徹底的にそれぞれのDNAとピペットミックスにクレノウエキソDNAポリメラーゼ酵素の10μlを添加する。 注：総容積は50μlである必要があります。 </li><li> 96ウェルプレートを密封し、16時間37℃でインキュベートする。 注：4時間の短いインキュベーションしかし十分ですO / Nでcubationはより便利にすることができます。 </li><li>液体ハンドリングロボットを用いて、各ウェルに停止緩衝液の5μlを添加する。 NOTE：ラベリング反応に使用される試薬の概要を表1に示す。 </li></ol>取り込まれなかったヌクレオチドの2の除去<ol><li>シリカメンブレンベースのスピンカラムと専用のスピンカラム処理ロボットを使用して、取り込まれていないヌクレオチドを​​除去（スピンカラムは、手動で処理されてもよい）。製造元の指示に従ってください。 <ol><li> 2ミリリットルチューブに、各ウェルの内容を転送。よくIDをこれらを事前にラベルを付けます。 注：このステップでは、液体ハンドリングロボットを用いて手動で、または好適に行うことができる。 </li><li>スピンカラム処理ロボットを使用している場合は、2ミリリットルチューブ、DNA精製スピンカラムおよび関連するバッファを備えたロボットをロードします。 </li><li>シリカに標識されたDNAを結合するために標識反応を250μlの高塩、DNA結合緩衝液（バッファPB）を追加膜。 </li><li> 500μlの洗浄バッファー（PEをバッファリング）で2回膜を洗浄することにより不純物を除去する。 </li><li> 〜12μLの容量において、精製、標識DNAを回収するために、膜に15μlの低塩の溶出緩衝液を（EBをバッファリング）を追加します。 </li></ol></li></ol> 3. Hybをペアの組み合わせ<ol><li>シアニン3と5標識DNAの適切なペアを組み合わせて、COT-1 DNA、メーカー提供の阻止ミックスと液体処理ロボットを使用して、製造業者が提供するハイブリダイゼーション緩衝液。 注：共有のCNVが問題でない場合、彼らは非常にあるように、これらのHYBペアは、 例えば、私たちは日常的にそのような頭蓋骨癒合症の患者VS腎形成不全患者などの表現型不一致のサンプルを、ペア（サンプルおよび参照、またはサンプル対サンプルであってもよい）同じ臨床的に有意なCNVを運ぶ可能性は低い。参照DNAを使用している場合は、市販のDNA供給が推奨され、それがサンプルと一緒に処理されるべきである。 <ol><li>液体処理ROを使用して、ボット、COT-1 DNA（3333 ngの/μl）を追加し、製造業者が提供する各ウェルに1.1μlのCOT-1 DNA、4.95μlの遮断ミックス24.75を含むように96ウェルプレートの各ウェルに混合し、ハイブリダイゼーションをブロッキング緩衝液μlのハイブリダイゼーション緩衝液。 </li><li>各ウェルに適切なシアニン3標識DNAの9.35を添加する。分注精度を向上させるプリウェット各チップ。 </li><li>各ウェルに適切なシアニン5標識DNAの9.35を添加する。分注精度を向上させるプリウェット各チップ。 </li><li> 1分間、96ウェルプレートボルテックスをシール。各ウェルの底に内容物を収集するために96ウェルプレートをスピン。 </li></ol></li></ol> 4.ハイブリダイゼーション<ol><li> 65℃のハイブリダイゼーションオーブンを予熱し、1バッキングスライドと各アレイスライドの1つのハイブリダイゼーションチャンバーをprewarm。 <ol><li>アレイに適用される前に、プレハイブリダイゼーションインキュベーションで標識されたDNAを変性さ。 24時間、回転オーブンでハイブリダイゼーションを実行します。 </li><li> 30分間、70℃で96ウェルプレートをインキュベートした後、少なくとも5分間37℃で残す。 </li><li> 42℃で加熱されたプラットフォーム上での作業、使用する前に、ハイブリダイゼーションチャンバ内に各バックアップのスライドをロードします。ガスケットスライドの透明部分は、ハイブリダイゼーションチャンバーの「窓」の部分と整列していることを確認してください。 </li><li>ピペットで先に調製したハイブリダイゼーション混合物の42μlをスライドバッキングアレイ上の適切な位置に（セクション3を参照）。分注精度を向上させるプリウェット各チップ。ピペットでゆっくり確認しながら各位置の中心、上に液体がゴムリングの境界に触れていません。 </li><li>バッキングスライド上のすべての位置が満たされると、慎重に上のアレイスライドを下げ、ハイブリダイゼーションチャンバーを組み立てる。それへの書き込みを持つ配列の側はバッキングスライドに直面していることを確認してください。完全にハイブリダイゼーションチャンバーのネジを締めてください。 </li><li>組み立てられたハイブリダイゼーションチャンバーを点検。 Eハイブリダイゼーションチャンバーが垂直方向の端部に載置されたときにゴムリングの境界外のハイブリダイゼーション混合物の漏れ、各気泡がないことをnsureは、高さが約4 mmである。ハイブリダイゼーションチャンバーを回転させた位置で立ち往生し、動いていないに気泡がないことを確認してください。これらのいずれかがある場合は、室のベンチに鋭いタップを与える。すべての気泡が移動していることを確認してください。 </li><li> 24時間、65℃で回転オーブンにハイブリダイゼーションチャンバーを配置します。オーブンロータがバランスしていることを確認します。必要に応じて他の空室を使用しています。 </li></ol></li></ol> 5.洗浄およびスキャンスライド<ol><li>過剰標識DNAを除去した後、各プローブの蛍光を測定するためにスキャンするために、配列を洗ってください。 <ol><li>オーブン逆アセンブルの外にハイブリダイゼーションチャンバーを取る。アレイおよびガスケットスライドが一緒に立ち往生するでしょう。洗浄バッファー1でこれらを沈めると離れて、それらをてこのようにプラスチック、フラットエッジのピンセットを使用しています。 </li><li>ディガスケットスライドをSCARD、バッファ1に沈めラックに配列スライドを配置します。 </li><li>激しく撹拌し、5分間、新鮮な洗浄バッファー1の〜700ミリリットルの配列のスライドを洗う（ノミと磁気攪拌機を使用します）。 </li><li> 〜700ミリリットルの洗浄バッファー2への配列のスライドを移し、激しく撹拌し、90秒間洗浄します。静かに洗浄バッファー2から配列スライドを持ち上げ、彼らはドライ出現する必要があります。 </li><li>スライドプロテクタを使用して、スキャナのスライドホルダーに配列スライドをロードします。アレイスキャナーにスライドをロードし、アレイの製造元の指示に従ってスキャンします。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Miller, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+statement:+chromosomal+microarray+is+a+first-tier+clinical+diagnostic+test+for+individuals+with+developmental+disabilities+or+congenital+anomalies.">Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies.</a> Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).</li><li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+CGH+as+a+first+line+diagnostic+test+in+place+of+karyotyping+for+postnatal+referrals+-+results+from+four+years'+clinical+application+for+over+8,700+patients.">Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients.</a> Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).</li><li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+implementation+of+array+comparative+genomic+hybridisation+as+a+first+line+test+in+place+of+postnatal+karyotyping+for+genome+imbalance.">Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance.</a> Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).</li><li>Beaudet, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+chromosomal+microarray+analysis+in+developmental+and+behavioral+pediatrics.">The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics.</a> Child Dev. 84, 121-132 (2013).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implementation+of+whole-genome+array+CGH+as+a+first-tier+test+in+5080+pre+and+postnatal+cases.">Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases.</a> Mol. Cytogenet. 4, 12 (2011).</li><li>Iafrate, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+large-scale+variation+in+the+human+genome.">Detection of large-scale variation in the human genome.</a> Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).</li><li>Redon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+variation+in+copy+number+in+the+human+genome.">Global variation in copy number in the human genome.</a> Nature. 444, 444-454 (2006).</li><li>Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+features+in+patients+with+15q11.2(BP1-BP2)+deletion:+Further+delineation+of+an+emerging+syndrome.">Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome.</a> Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).</li><li>Molin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microdeletion+syndrome+at+3q13.31+characterised+by+developmental+delay,+postnatal+overgrowth,+hypoplastic+male+genitals,+and+characteristic+facial+features.">A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features.</a> J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).</li><li>Tropeano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-biased+autosomal+effect+of+16p13.11+copy+number+variation+in+neurodevelopmental+disorders.">Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders.</a> PLoS One. 8, e61365 (2013).</li><li>Bon, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+delineation+of+the+15q13+microdeletion+and+duplication+syndromes:+a+clinical+spectrum+varying+from+non-pathogenic+to+a+severe+outcome.">Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome.</a> J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

アレイCGHは、三倍体としてバランスのとれた再構成または倍数性異常を検出しません。さらに、低レベルのモザイク不均衡が検出されないことがある。しかし、アレイCGHは、多くの細胞遺伝学研究室で置き換えたG-バンド染色体分析よりCNVを検出するためのより高い解像度を有する。したがって、ゲノムワイドなCNV検出のための現在のゴールドスタンダードです。これは、将来的には、次世代配列決定技術に置き換えることができるが、現在、それらのコストおよび技術的な複雑さは、これはまだ臨床使用に適していないことを意味するCNVの検出のために読み取る短い使用に関連する。 ここに記載されているプロトコルは、当社の臨床サービス実験室での日常的な使用である。 96サンプルずつの2ランは、液体処理ロボットや専用のシリカ膜スピンカラム処理ロボットを用いて毎週処理されます。自動化が非常に一貫性を改善し、品質を維持することをお勧めします。血液から抽出したDNA、唾液、出生前のサンプル（ 例えば、絨毛膜絨毛または羊水）または組織サンプルは、日常場合、このプロトコルで使用することができる。 オゾンは、シアニン色素を分解することが知られているので、オゾン監視および保護が推奨される。オゾン濃度の季節変動も一般的である。継続的に私たちの研究室を監視し、記録オゾンレベル。壁掛け式のオゾン除去ユニットはオゾンレベルを低減するために使用されるプロトコルの特に敏感な部分（ すなわち、洗浄及び走査アレイ）はオゾンフリーフードで実施される。可能であれば、オゾンレベルは5 PPB以下に維持されている。 ほとんどの試薬は、効果的な品質管理を外部委託するためにメーカーからキットとして購入されている。これは効果的な戦略であることが証明された。しかし、これは品質管理が必要とされていないことを意味するものではありません。実際、品質メトリクスを十分に行い、異常を監視されます。LOG2比（DLRS）の誘導体標準偏差をBする必要があります&gt; 30であるべきである0.2 ELOW、シアニン3および5の信号強度がノイズ比が500より大きく、シアニン3および5の信号であるべきである。これらのメトリックは、スキャンソフトウェアによる走査プロトコルの一部として生成され、長期モニタリングのために記録されている。

これは、欠失または染色体セグメントの余分なコピーが知的障害、異形症とcongentical奇形を引き起こすことを長年にわたって知られており、いくつかのケースでは、遺伝的症候群1を引き起こしてきた。しかし、これらの変化のゲノムワイド検出のため2000年代半ばまで、利用可能な唯一の技術は、不均衡の地域や性質に応じて、5-10Mb周りの解像度を持つG-バンド染色体分析、で、そのことはできません材料が同じバンドパターンと異なる染色体から地域によって置き換えられている異常な染色体を検出する。そのようなin situハイブリダイゼーションと多重ライゲーション特異的プローブ増幅における蛍光として補助的な細胞遺伝学的技術が疑われる特定の症候不均衡例では、特定の遺伝子座の尋問のために利用されてきたが、それは、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）の導入までではなかった日常の臨床診断の中にコピー数変異体（のCNV）のゲノムワイド検出が（通常は120キロバイト程度）を大幅に増加した解像度で可能になったervice 2-5。一部の地域では正常な集団6-7で普及しているための調査研究と並んで臨床サービス作業は、他のCNVながら、以前に検出できない、そのような自閉症やてんかん8-11などneurodisabilitiesと関連している、のCNVことが示されている。 この論文に記載されているプロトコルは、当社の英国国民保健サービス（NHS）の臨床診断検査室で使用されている。我々はこの状態が資金提供サービスでコストを最小限に抑える新たなハイブリダイゼーション戦略、バッチテストやロボットを使用しています。 以下に詳述するプロトコールに先立って、高品質のDNAを、適当な出発物質、一般的に、血液、培養細胞又は組織サンプルから抽出されるべきである。 280吸光度比（bにすべき：分光光度計は濃度を測定するために使用することができ、260をチェックし（&gt; 50 ngの/μlのあるべき）E 1.8から2.0）。ゲル電気泳動は、DNAが有意な劣化なしに高分子量であることを確認するために使用することができる。 このプロトコルは、自動液体処理ロボットを使用して実行ごとに96個のサンプルを標識しているより高いスループット実験室用に設計されています。しかし、自動化することなく、低いスループット·ラボに適合させることができる。

<table><tbody><tr><td>CGH microarray 8 x 60K</td><td>Agilent</td><td>G4126</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH wash buffers</td><td>Agilent</td><td>5188-5226</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH hybridisation buffer</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Minelute purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH labelling kit</td><td>Enzo</td><td>ENZ-42672-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

array comparative genomic hybridization (array cgh) for detection of genomic copy number variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

ハイブリダイズしたアレイ上の各プローブは、赤と緑の蛍光色素の混合物として可視化される（ 図1参照）。各プローブのための緑色蛍光信号に赤の比率は、スキャナによっ​​て定量化され、関連するソフトウェアは、それらのゲノム位置に応じてLOG2比としてこれらをプロットし、プリセットの境界の外に落下する領域を特定します。結果の配列トレースは、ゲノムのアンバランスとして同定された領域の解釈を可能にする。例えば、ウィリアムズ症候群、染色体7の近位領域内の低コピー反復配列によって媒介される定期的な微小欠失症候群の子供からのトレースは、 図2に示されている。この不均衡は、ソフトウェアによって識別され、赤線で示した。 ゲノムの正常な領域に対して1：1の緑/赤の割合を示す、 図2に示すように、蛍光対数比は、0の周りに密接にクラスタ化する必要があり、プローブ。散在配列トレースはresulあり<html>不正確な異常部位の通話、またはゲノム不均衡を同定するための失敗トン（ 図3参照）。このような散乱が悪いDNAの品質、または大気中のオゾンレベルの上昇の存在を含む、多くの要因によって引き起こされ得る。オゾンレベルの監視が推奨され、どこに上昇オゾンレベルが問題となる、専用のオゾン除外キャビネットが利用可能です。これらのキャビネットを使用することは一般的に著しく改善されたアレイの品質をもたらす。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51718/51718fig1highres.jpg" width="600" /> 配列以下のハイブリダイゼーションの図1.画像。白いボックスはバランスのとれたゲノム領域を示す赤のプローブと緑のプローブは、黄色プローブ（を背景に、（これらのプローブによって表される地域の不均衡を示す）を可視化することができる拡大された領域を、示しています）。 常に &quot;&gt;：&quot; =キープtogether.withinページFO」ontent <img alt="図2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51718/51718fig2highres.jpg" width="600" /> 図2（A）の例は、43の連続したプローブのための-0.8の平均比で示し、1.7MB欠失を有するサンプルでは染色体7のためのトレース。この場合の欠失領域は異形の機能、心臓の欠陥と知的障害の紹介指標と整合ウィリアムズ症候群と関連している。（B）USCSゲノムブラウザに表示された上記の欠失領域、削除された内の遺伝子を示す地域。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51718/51718fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51718/51718fig3highres.jpg" width="600" /> 図3。貧しいハイブリダイゼーションと、サンプル中の7番染色体のための散乱アレイ·トレースの例。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51718/51718fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 容量（μL） </td></tr><tr><td>小冊子＆反応バッファー</td><td align="right"> 20 </td></tr><tr><td> DNA（1μgの）+水</td><td align="right"> 20 </td></tr><tr><td>クレノウエキソヌクレアーゼDNAポリメラーゼ</td><td align="right"> 10 </td></tr></tbody></table> ラベリング反応に使用される試薬表1.。

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Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

ゲノムコピー数変異の検出のためのアレイCGHは、Gバンド核型分析に取って代わった。本論文では、技術や診断サービスの研究室への応用について説明します。

ゲノムコピー数変異体の検出のためのアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

19.5K ビュー.  Guy's & St Thomas' NHS Foundation Trust. ゲノムコピー数変異の検出のためのアレイCGHは、Gバンド核型分析に取って代わった。本論文では、技術や診断サービスの研究室への応用について説明します。 

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Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

遺伝学

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマ コピー数検出

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

がん研究

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including biological such as T-DNA or transposon, chemical such as ethyl methanesulfonate (EMS), or physical such as ionization radiation. The type of mutation observed varies depending on the mutagen used. For ionization radiation induced mutants, mutations include deletion, duplication, or rearrangement. While T-DNA or transposon-based mutagenesis is limited to species that are susceptible to transformation, chemical or physical mutagenesis can be applied to a broad range of species. However, the characterization of mutations derived from chemical or physical mutagenesis traditionally relies on a map-based cloning approach, which is labor intensive and time consuming. Here, we show that a high-density genome array-based comparative genomic hybridization (aCGH) platform can be applied to efficiently detect and characterize copy number variations (CNVs) in mutants derived from fast neutron bombardment (FNB) mutagenesis in Medicago truncatula, a legume species. Whole genome sequence analysis shows that there are more than 50,000 genes or gene models in M. truncatula. At present, FNB-induced mutants in M. truncatula are derived from more than 150,000 M1 lines, representing invaluable genetic resources for functional studies of genes in the genome. The aCGH platform described here is an efficient tool for characterizing FNB-induced mutants in M. truncatula.

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

This protocol provides experimental steps and information about reagents, equipment, and analysis tools for researchers who are interested in carrying out whole genome array-based comparative genomic hybridization (CGH) analysis of copy number variations in plants.

アレイ ・ ベース比較 Genomic 交配用高速中性子誘起ウマゴヤシ分子変異体のコピー数変化の効率的な検出

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

全ゲノムアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションの技術デモンストレーション

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

生物学

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation genetic test, this technique has its unique advantages in scalability, throughput, and cost. For the pre-implantation genetic test for aneuploidy analysis, the semiconductor-based next-generation sequencing (NGS) system presented here provides a comprehensive approach to determine structural genetic variants at a minimum resolution of 8 Mb. From sample acquisition to the final report, the working process requires multiple steps with close adherence to protocols. Since various critical steps could determine the outcome of amplification, quality of the library, coverage of reads, and output of data, descriptive information with visual demonstration other than words could offer more detail to the operation and manipulation, which may have a great impact on the results of all critical steps. The methods presented herein will display the procedures involved in whole genome amplification (WGA) of biopsied Trophectoderm (TE) cells, genomic library construction, sequencer management, and finally, generating copy number variants' reports.

The protocol presents the overall in-lab procedures required in pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor-based next-generation sequencing platform. Here we present the detailed steps of whole genome amplification, DNA fragment selection, library construction, template preparation, and sequencing working flow with representative results.

半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォームにおける異数性のための移植前遺伝子検査

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective anti-tumor strategies. Although concerns are frequently raised due to differences in sample processing and depth of coverage, next-generation sequencing of solid tumors have unraveled a highly variable degree of ITH across tumor types. Capturing the genetic relatedness between primary and metastatic lesions through the identification of clonal and subclonal populations is critical to the design of therapies for advance-stage diseases. Here, we report a method for comparative lesions analysis that allows for the identification of clonal and subclonal populations among different specimens from the same patient. The experimental approach described here integrates three well-established approaches: histological analysis, high-coverage multi-lesion sequencing, and immunophenotypic analyses. In order to minimize the effects on the detection of subclonal events by inappropriate sample processing, we subjected tissues to careful pathological examination and neoplastic cell enrichment. Quality controlled DNA from neoplastic lesions and normal tissues was then subjected to high coverage sequencing, targeting the coding regions of 409 relevant cancer genes. While only looking at a limited genomic space, our approach enables evaluating the extent of heterogeneity among somatic alterations (single-nucleotide mutations and copy-number variations) in distinct lesions from a given patient. Through comparative analysis of sequencing data, we were able to distinguish clonal vs. subclonal alterations. The majority of ITH is often ascribed to passenger mutations; therefore, we also used immunohistochemistry to predict functional consequences of mutations. While this protocol has been applied to a specific tumor type, we anticipate that the methodology described here is broadly applicable to other solid tumor types.

This article describes a method to identify clonal and subclonal alterations among different specimens from a given patient. Although the experiments described here focus on a specific tumor type, the approach is broadly applicable to other solid tumors.

目標シーケンシングアプローチによる比較病変分析

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

行動学

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

DNAマイクロアレイ：サンプルの品質管理、アレイハイブリダイゼーションとスキャニング

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

エクソンキャプチャと超並列配列決定することにより腫瘍標本における体細胞遺伝子変異を検出する

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

DNA Microarrays

Microarrays are high-throughput and relatively inexpensive assays that can be automated to analyze large quantities of data at a time. They are used in genome-wide studies to compare gene or protein expression under two varied conditions, such as healthy and diseased states. Microarrays consist of glass or silica slides on which probe molecules are covalently attached through surface functionalization. Most commonly, the slides are prepared through the chemisorption of silanes to silica surfaces.
While DNA microarrays are used to monitor gene expression, protein microarrays detect biologically relevant interactions of a fluorescently labeled protein with other proteins, DNA, or small molecules.
DNA microarray slides are often called gene chips or DNA chips. DNA chips are widely used to profile thousands of genes parallelly. Other than gene expression, they are also used in studying microRNA expression, DNA copy numbers, and single-nucleotide polymorphism detection. Commercially, these chips are used in biotechnology, forensics, toxicology, drug discovery, and targeted therapy for infectious and genetic diseases.
The chemically stable nature of DNA probes makes DNA chips the most popular of the microarray technologies. The covalently bound single-stranded DNA probe retains its native interactions despite harsh chemicals and temperatures that are used during probe loading and chip preparation.
The most obvious shortcoming of DNA microarrays is the prerequisite of a known target sequence. Because DNA microarray probes are designed to complement the target cDNA sequence, the sequence of the mRNA from which the cDNA is copied must be known. This makes the technology unusable while looking for novel mRNA sequences. For such purposes, RNASeq is the preferred albeit expensive option.

DNA Microarrays: High-throughput Gene Expression Profiling

DNAマイクロアレイ

Microarrays are high-throughput and relatively inexpensive assays that can be automated to analyze large quantities of data at a time. They are used in ...

ゲノムコピー数変異体の検出のためのアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）

要約

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単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマコピー数検出

アレイ・ベース比較 Genomic 交配用高速中性子誘起ウマゴヤシ分子変異体のコピー数変化の効率的な検出

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトランスクリプト変種の検出

全ゲノムアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションの技術デモンストレーション

半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォームにおける異数性のための移植前遺伝子検査

目標シーケンシングアプローチによる比較病変分析

DNAマイクロアレイ：サンプルの品質管理、アレイハイブリダイゼーションとスキャニング

エクソンキャプチャと超並列配列決定することにより腫瘍標本における体細胞遺伝子変異を検出する

DNAマイクロアレイ

ゲノムコピー数変異体の検出のためのアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）

要約

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単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマ コピー数検出

アレイ ・ ベース比較 Genomic 交配用高速中性子誘起ウマゴヤシ分子変異体のコピー数変化の効率的な検出

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

全ゲノムアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションの技術デモンストレーション

半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォームにおける異数性のための移植前遺伝子検査

目標シーケンシングアプローチによる比較病変分析

DNAマイクロアレイ：サンプルの品質管理、アレイハイブリダイゼーションとスキャニング

エクソンキャプチャと超並列配列決定することにより腫瘍標本における体細胞遺伝子変異を検出する

DNAマイクロアレイ

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマコピー数検出

アレイ・ベース比較 Genomic 交配用高速中性子誘起ウマゴヤシ分子変異体のコピー数変化の効率的な検出

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトランスクリプト変種の検出