Name: array comparative genomic hybridization (array cgh) for detection of genomic copy number variants
Uploaded: 2015-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants at JoVE.com

The authors have no acknowledgements.

1. وضع البطاقات التعريفية رد الفعل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل استخدامها، dUTPs قبل قسامة cyanine 3 و 5 المسمى، النيوكليوتيدات غير المسماة والاشعال عشوائية في تركيزات الموصى بها الشركة المصنعة في لوحات وتخزين 96-جيدا في -20 C جاهزة للاستخدام. لأغراض هذا البروتوكول، وقسامة 10.5 ميكرولتر من dUTP المسمى الاقتضاء و 10.5 ميكرولتر النيوكليوتيدات غير المسماة والاشعال عشوائية لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد لوحة الجاهزة للاستخدام 96-جيدا من النيوكليوتيدات والاشعال في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذابة مرة واحدة، تتوازن هذه اللوحة في RT لمدة 30 دقيقة على الأقل، محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن عينات من الحمض النووي في 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الروبوت التعامل مع السائل، والاستغناء nuclease خالية من المياه إلى كل بئر من لوحة 96-جيدا. ملاحظة: إن حجم المياه تعتمد على تركيز كل عينة DNA المدخلات وينبغي أن تكون كافية لتؤدي إلى تركيز النهائي من 50 نانوغرام / UL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام هان السائلdling الروبوت، ماصة 1 ميكروغرام من الحمض النووي في بئر من لوحة 96-جيدا (انظر 1.5)، ليصبح إجمالي حجم إلى 20 ميكرولتر. ملاحظة: يمكن استخدام أصغر كميات من الحمض النووي على الرغم من أن نوعية البيانات الناتجة يجوز المساس (للعينات الثمينة، وكميات DNA إدخال تصل إلى 400 نانوغرام يمكن استخدامها). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الروبوت التعامل مع السائل، ونقل 20 ميكرولتر من النيوكليوتيدات معايرتها والاشعال في كل بئر من لوحة من الحمض النووي المخفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة 96-جيدا مع قبعات الشريط (ختم ضيق أمر بالغ الأهمية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفسد الحمض النووي في 99 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في جهاز PCR مع غطاء ساخنة وباردة ثم المفاجئة على الجليد لمدة 5 دقائق لالاشعال يصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الروبوت معالجة السائل، وإضافة 10 ميكرولتر من Klenow إكسو DNA إنزيم البلمرة على كل السلطات الوطنية المعينة ومزيج ماصة بدقة. ملاحظة: يجب أن يكون الحجم الكلي 50 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة 96-جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. ملاحظة: الحضانة أقصر من 4 ساعات كافية ولكن لO / N فيcubation يمكن أن يكون أكثر ملاءمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الروبوت التعامل مع السائل، وإضافة 5 ميكرولتر من العازلة توقف إلى كل بئر. ملاحظة: يتم عرض موجز للالكواشف المستخدمة للتفاعل وضع العلامات في الجدول 1. </li></ol> 2. إزالة الفردية النيوكليوتيدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة النيوكليوتيدات الفردية باستخدام السيليكا غشاء أساس الأعمدة تدور والروبوت معالجة عمود الدوران المخصص (يمكن أيضا معالجة الأعمدة تدور يدويا). اتبع تعليمات الشركة الصانعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل محتويات كل بئر إلى أنبوب 2 مل. قبل تسمية هذه مع إسم البائع جيدا. ملاحظة: هذه الخطوة يمكن أن يؤديها يدويا أو باستخدام يفضل التعامل مع الروبوت السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة استخدام عمود الدوران وتجهيز الروبوت، ثم تحميل الروبوت مع 2 مل أنابيب، والأعمدة تدور تنقية الحمض النووي ومخازن المرتبطة بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر الملح عالية، والحمض النووي ملزمة عازلة (عازلة PB) إلى رد فعل التوسيم لربط الحمض النووي المسمى إلى السيليكاالغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشوائب عن طريق غسل غشاء مرتين مع 500 ميكرولتر غسل العازلة (العازلة PE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 ميكرولتر منخفض شطف العازلة الملح (العازلة EB) إلى غشاء لاسترداد، DNA النقي وصفت في حجم ~ 12 ميكرولتر. </li></ol></li></ol> 3. الجمع بين أزواج HYB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين الأزواج المناسبة من cyanine 3 و 5 DNA المسمى، COT-1 DNA، وهو مزيج عرقلة التي توفرها الشركة المصنعة وعازلة التهجين التي توفرها الشركة المصنعة باستخدام الروبوت التعامل مع السائل. ملاحظة: هذه الأزواج HYB يمكن أن يكون نموذج والمرجعية، أو عينة مقابل عينة إذا المشتركة التنوعات هي ليست قضية (على سبيل المثال، ونحن بشكل روتيني الزوج عينات النمط الظاهري متطابقة، مثل النمو الشاذ المريض الكلوي مقابل المريض تعظم الدروز الباكر، لأنها جدا من غير المرجح أن تحمل نفس CNV هامة سريريا). في حالة استخدام الحمض النووي المرجعية، ويوصى إمدادات DNA التجاري، وينبغي أن تتم معالجتها إلى جانب العينة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام معالجة السائل ريال عمانيبوت، إضافة COT-1 DNA (3333 نانوغرام / ميكرولتر)، ومنع المزيج وعازلة تهجين إلى كل بئر من لوحة 96-جيدا بحيث يكون لكل يحتوي أيضا 1.1 ميكرولتر COT-1 DNA، 4.95 ميكرولتر مزيج الحجب و24.75 التي توفرها الشركة المصنعة ميكرولتر العازلة التهجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 9.35 ميكرولتر من DNA cyanine المناسب 3 المسمى إلى كل بئر. قبل الرطب كل طرف لتعزيز pipetting لدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 9.35 ميكرولتر من DNA cyanine المناسب 5 المسمى إلى كل بئر. قبل الرطب كل طرف لتعزيز pipetting لدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة 96-جيدا ودوامة لمدة 1 دقيقة. تدور لوحة 96-جيدا لجمع محتويات في الجزء السفلي من كل بئر. </li></ol></li></ol> 4. التهجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سخن الفرن التهجين إلى 65oC وprewarm شريحة واحدة دعم واحد غرفة التهجين لكل شريحة صفيف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفسد الحمض النووي المسمى في الحضانة ما قبل التهجين قبل أن تنطبق على المصفوفات. أداء التهجين في فرن الدورية لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة 96-جيدا عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم تترك على 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل على منصة ساخنة في 42 درجة مئوية، وتحميل كل شريحة دعم في غرفة التهجين قبل استخدامها. تأكد من أن الجزء الشفاف من الشريحة طوقا محاذاة مع الجزء &quot;إطارات&quot; للغرفة التهجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 42 ميكرولتر من مزيج التهجين معدة مسبقا (انظر القسم 3) على الموقف المناسب على مجموعة دعم الشرائح. قبل الرطب كل طرف لتعزيز pipetting لدقة. الماصة ببطء على مركز كل موقف، والتأكد من السائل لا تلمس الحدود حلقة مطاطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وحالما يتم شغل كل المناصب على الشريحة الدعم، خفض بعناية الشريحة مجموعة على ذلك، وتجميع غرفة التهجين. تأكد من أن الجانب المصفوفة مع الكتابة على أنها تواجه الشريحة الدعم. تأكد من إحكام التهجين غرفة المسمار بالكامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد غرفة التهجين تجميعها. Eتكفل لللا يوجد أي تسرب من مزيج التهجين خارج حدود حلقة مطاطية وكل فقاعة الهواء ~ 4 مم في الارتفاع عند استراح في غرفة التهجين على نهايته عموديا. تدوير غرفة التهجين وتحقق من عدم وجود أي فقاعات الهواء التي عالقون في موقف وعدم التحرك. إذا كان هناك أي من هذه، وإعطاء الغرفة حنفية حاد على مقاعد البدلاء. تأكد من أن جميع فقاعات الهواء تتحرك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع غرفة التهجين في فرن الدورية عند 65 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تأكد من الدوار الفرن متوازن. استخدام غرف فارغة أخرى إذا لزم الأمر. </li></ol></li></ol> 5. غسل والشرائح الضوئي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل صفائف لإزالة الزائد المسمى DNA ثم مسح لقياس مضان من كل التحقيق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ غرف التهجين من الفرن وتفكيك. سوف يكون عالقا الشرائح مجموعة وحشية معا. غمر هذه في غسل العازلة 1 واستخدام زوج من البلاستيك، وملقط فوز شقة لابعاد بينهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ديscard الشريحة حشية ووضع الشريحة مجموعة إلى رف المغمورة في المخزن 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشريحة في مجموعة ~ 700 مل من غسل العازلة الطازجة 1 لمدة 5 دقائق مع التحريك بقوة (استخدام برغوث والنمام المغناطيسي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشريحة مجموعة إلى ~ 700 مل غسل عازلة 2 ويغسل لمدة 90 ثانية، واثارة بقوة. رفع بلطف الشرائح مجموعة من غسل العازلة 2، يجب أن ظهورها الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الشريحة مجموعة إلى حامل الشريحة من الماسح الضوئي، وذلك باستخدام واقي الشريحة. تحميل الشريحة في مجموعة الماسح الضوئي والمسح الضوئي باتباع إرشادات الشركة المصنعة الصفيف. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Miller, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+statement:+chromosomal+microarray+is+a+first-tier+clinical+diagnostic+test+for+individuals+with+developmental+disabilities+or+congenital+anomalies.">Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies.</a> Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).</li><li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+CGH+as+a+first+line+diagnostic+test+in+place+of+karyotyping+for+postnatal+referrals+-+results+from+four+years'+clinical+application+for+over+8,700+patients.">Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients.</a> Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).</li><li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+implementation+of+array+comparative+genomic+hybridisation+as+a+first+line+test+in+place+of+postnatal+karyotyping+for+genome+imbalance.">Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance.</a> Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).</li><li>Beaudet, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+chromosomal+microarray+analysis+in+developmental+and+behavioral+pediatrics.">The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics.</a> Child Dev. 84, 121-132 (2013).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implementation+of+whole-genome+array+CGH+as+a+first-tier+test+in+5080+pre+and+postnatal+cases.">Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases.</a> Mol. Cytogenet. 4, 12 (2011).</li><li>Iafrate, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+large-scale+variation+in+the+human+genome.">Detection of large-scale variation in the human genome.</a> Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).</li><li>Redon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+variation+in+copy+number+in+the+human+genome.">Global variation in copy number in the human genome.</a> Nature. 444, 444-454 (2006).</li><li>Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+features+in+patients+with+15q11.2(BP1-BP2)+deletion:+Further+delineation+of+an+emerging+syndrome.">Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome.</a> Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).</li><li>Molin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microdeletion+syndrome+at+3q13.31+characterised+by+developmental+delay,+postnatal+overgrowth,+hypoplastic+male+genitals,+and+characteristic+facial+features.">A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features.</a> J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).</li><li>Tropeano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-biased+autosomal+effect+of+16p13.11+copy+number+variation+in+neurodevelopmental+disorders.">Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders.</a> PLoS One. 8, e61365 (2013).</li><li>Bon, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+delineation+of+the+15q13+microdeletion+and+duplication+syndromes:+a+clinical+spectrum+varying+from+non-pathogenic+to+a+severe+outcome.">Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome.</a> J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ومجموعة [ك] لم يكشف إعادة ترتيب متوازنة أو تشوهات الصيغة الصبغية مثل تثلث الصيغة الصبغية. وعلاوة على ذلك، قد لا يتم الكشف عن الاختلالات الفسيفساء مستوى منخفض. ومع ذلك، مجموعة [ك] لديها دقة أعلى للكشف CNV من التحليل الصبغي G النطاقات الذي حل محله في العديد من المختبرات علم الوراثة الخلوية. ولذلك فمن معيار الذهب الحالي لالجينوم على نطاق الكشف CNV. ويمكن استبداله تقنيات التسلسل الجيل القادم في المستقبل لكن في الوقت الراهن، تكلفتها والتعقيدات التقنية المرتبطة باستخدام باختصار يقرأ للكشف CNV يعني أن هذه ليست حتى الآن مناسبا للاستخدام السريري. بروتوكول الموصوفة هنا هو في الاستخدام الروتيني في المختبر خدمة السريري لدينا. تتم معالجة اثنان أشواط من كل 96 عينات من كل أسبوع باستخدام الروبوت التعامل مع السائل ومخصص غشاء السيليكا معالجة عمود الدوران الروبوت. ينصح بشدة الآلي لتحسين الاتساق والحفاظ على الجودة. الحمض النووي المستخرج من الدمواللعاب، وعينات ما قبل الولادة (على سبيل المثال، الزغابات المشيمية أو السائل الذي يحيط بالجنين)، أو عينات الأنسجة يمكن أن يكون، وبشكل روتيني غير، وتستخدم مع هذا البروتوكول. ومن المعروف الأوزون للحط من الأصباغ cyanine وبالتالي يوصى رصد الأوزون وحمايتها. التغيرات الموسمية في مستويات الأوزون هي أيضا شائعة. مراقبو مختبرنا ومستويات سجلات الأوزون بشكل مستمر. ويتم استخدام وحدة إزالة الأوزون الحائط للحد من مستويات الأوزون وأجزاء حساسة بشكل خاص للبروتوكول (أي والغسيل والمسح صفائف) يتم تنفيذها في اغطية خالية من الأوزون. إذا كان ذلك ممكنا، يتم الاحتفاظ مستويات الأوزون أقل من 5 جزء في البليون. ويتم شراء معظم الكواشف إلى مجموعات من الشركات المصنعة الاستعانة بمصادر خارجية على نحو فعال مراقبة الجودة؛ وقد أثبت هذا أن يكون استراتيجية فعالة. ومع ذلك، هذا لا يعني أن مراقبة الجودة غير مطلوب. في الواقع، يتم مراقبة مقاييس جودة بعناية لأي الشذوذ: الانحراف المعياري مشتق من نسب log2 (دولار اميركي) ينبغي لبelow 0.2، يجب أن يكون cyanine 3 و 5-إشارة شدة أكبر من 500 وcyanine 3 و 5 إشارة إلى أن نسب الضوضاء يكون&gt; ​​30. يتم إنشاء هذه المقاييس كجزء من بروتوكول المسح من قبل برنامج المسح وسجلت لرصد المدى الطويل.

وقد كان من المعروف لسنوات عديدة أن الحذف أو نسخ إضافية من شرائح الكروموسومات تسبب الإعاقة الفكرية، وخلل البنية؛ شوهة والتشوهات congentical، وفي بعض الحالات تسبب متلازمات وراثية 1. ومع ذلك، فإن التكنولوجيا الوحيدة المتاحة حتى منتصف 2000s للكشف على نطاق الجينوم من هذه التغييرات G-النطاقات تحليل كروموسوم، التي لديها قرار حول 5-10Mb، اعتمادا على المنطقة وطبيعة الخلل، والتي لا يمكن كشف الكروموسومات غير طبيعية حيث تم استبدال المواد من قبل المنطقة من كروموسوم مختلفة مع نمط النطاقات نفسه. كانت التقنيات الوراثية الخلوية الإضافية مثل مضان التهجين في الموقع ومتعدد ربط محددة التحقيق التضخيم في متاحة للاستجواب مواضع محددة، في حالات يشتبه الخلل المتلازمة محدد، لكنه لم يكن حتى إدخال مجموعة التهجين الجينومي المقارن (مجموعة [ك]) في الصورة الروتينية التشخيص السريريأصبح ervice 2-5 أن الكشف على نطاق الجينوم من عدد نسخ المتغيرات (التنوعات في عدد النسخ) ممكن في قرار زيادة كبيرة (عادة حوالي 120kb). وقد أظهرت أعمال الخدمة السريرية إلى جانب الدراسات البحثية أن التنوعات في عدد النسخ لبعض المناطق على نطاق واسع بين السكان العادي 6-7، في حين الآخرين التنوعات في عدد النسخ، غير قابلة للكشف في وقت سابق ترتبط مع neurodisabilities مثل التوحد والصرع 8-11. يتم استخدام بروتوكول صفها في هذه الورقة في المملكة المتحدة لدينا الخدمة الصحية الوطنية (NHS) مختبر التشخيص السريري. نستخدم استراتيجيات التهجين جديدة، واختبار دفعة والروبوتات لتقليل التكلفة في هذه الخدمة التي تمولها الدولة. قبل بروتوكول المفصلة أدناه، ينبغي استخراج DNA ذات جودة عالية من المواد الانطلاق المناسبة، عادة الدم، الخلايا المستزرعة أو عينات الأنسجة. الطيفي يمكن استخدامها لقياس تركيز (يجب أن يكون&gt; ​​50 نانوغرام / UL) وتحقق 260: 280 نسب الامتصاصية (يجب بالبريد 1،8-2،0). الكهربائي للهلام يمكن استخدامها للتحقق من أن الحمض النووي هو من ارتفاع الوزن الجزيئي دون تدهور كبير. تم تصميم هذا البروتوكول للمختبرات الإنتاجية المرتفعة التي وصفها 96 عينة في التشغيل باستخدام الآلي الروبوتات معالجة السائل. ومع ذلك، فإنه يمكن تكييفها لأقل معامل الإنتاجية دون الأتمتة.

<table><tbody><tr><td>CGH microarray 8 x 60K</td><td>Agilent</td><td>G4126</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH wash buffers</td><td>Agilent</td><td>5188-5226</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH hybridisation buffer</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Minelute purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH labelling kit</td><td>Enzo</td><td>ENZ-42672-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

array comparative genomic hybridization (array cgh) for detection of genomic copy number variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

وتصور كل مسبار على مجموعة المهجنة على شكل مزيج من fluorochromes الأحمر والأخضر (انظر الشكل 1). وكميا نسبة اللون الأحمر إلى إشارة الفلورسنت الخضراء لكل التحقيق بواسطة الماسح الضوئي والبرامج المرتبطة المؤامرات هذه كما نسب log2 وفقا لموقفهم الجيني، ويحدد المناطق التي تقع خارج حدود محددة مسبقا. آثار مجموعة الناتجة تسمح تفسير المناطق تحديدها على أنها غير متوازنة genomically. على سبيل المثال، تتبع من طفل متلازمة وليامز، وهو متلازمة microdeletion المتكررة بوساطة يكرر نسخة منخفضة في المنطقة القريبة من كروموسوم 7، هو موضح في الشكل (2). وقد تم تحديد هذا الخلل من قبل البرنامج والمشار إليها بواسطة خط أحمر. بحث يجب أن نسب سجل الفلورسنت العنقودية بشكل وثيق حول 0، كما هو مبين في الشكل 2، مما يدل على أن نسبة خضراء / حمراء 1: 1 لمناطق طبيعية من الجينوم. آثار مجموعة متناثرة قد بالنتيجه<html> تي في الدعوة غير دقيقة للمناطق غير طبيعية، أو الفشل في تحديد الخلل الجيني (انظر الشكل 3). قد يكون سبب هذا مبعثر من قبل عدد من العوامل، بما في ذلك نوعية الحمض النووي الفقراء، أو وجود ارتفاع مستويات الأوزون في الغلاف الجوي. ويوصى رصد مستويات الأوزون، وحيث مستويات الاوزون مرتفعة هي الإشكالية، هي مكرسة خزانات استبعاد الأوزون يتوفر؛ استخدام هذه الخزانات النتائج عموما في تحسين ملحوظ نوعية صفيف. <img alt="الشكل (1)" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51718/51718fig1highres.jpg" width="600" /> الشكل 1. صورة من مجموعة التهجين التالية. ويظهر مربع أبيض منطقة مكبرة، حيث تحقيقات الحمراء والخضراء تحقيقات يمكن تصور (تشير إلى عدم التوازن للمناطق التي تمثلها هذه التحقيقات)، على خلفية تحقيقات الصفراء (تشير إلى المناطق الجينومية متوازنة ). ontent &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الشكل 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51718/51718fig2highres.jpg" width="600" /> الشكل 2. (A) مثال أثر للكروموسوم 7 في عينة مع حذف 1.7MB، يتضح من متوسط ​​نسبة -0.8 43 تحقيقات متتالية. ويرتبط المنطقة المحذوفة في هذه الحالة يعانون من متلازمة وليامز-بيرون، بما يتفق مع دلالة الإحالة من الميزات تشوه، وجود خلل في القلب والإعاقة الذهنية. (ب) منطقة حذف فوق عرض في مستعرض USCS الجينوم، والتي تبين الجينات داخل المحذوفة المنطقة. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51718/51718fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51718/51718fig3highres.jpg" width="600" /> الشكل (3).مثال على أثر مجموعة متناثرة لكروموسوم 7 في عينة مع الفقراء التهجين. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51718/51718fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف </td><td> الحجم (ميكرولتر) </td></tr><tr><td> الاشعال ورد فعل العازلة </td><td align="right"> 20 </td></tr><tr><td> الحمض النووي (1μg) + الماء </td><td align="right"> 20 </td></tr><tr><td> Klenow نوكلياز خارجية DNA بوليميريز </td><td align="right"> 10 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. ملخص من الكواشف المستخدمة للتفاعل وضع العلامات.

Watch this Scientific Journal Video about Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants at JoVE.com

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

حلت محل مجموعة [ك] للكشف عن الجينومية المتغيرات في عدد النسخ تحليل النمط النووي G النطاقات. وتصف هذه الورقة التكنولوجيا وتطبيقاتها في مختبر خدمة التشخيص.

مجموعة المقارن الجينوم التهجين (صفيف [ك]) عن الكشف عن الجينوم نسخ عدد المتغيرات

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

array-comparative-genomic-hybridization-array-cgh-for-detection

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

19.5K Views.  Guy's & St Thomas' NHS Foundation Trust.  حلت محل مجموعة [ك] للكشف عن الجينومية المتغيرات في عدد النسخ تحليل النمط النووي G النطاقات. وتصف هذه الورقة التكنولوجيا وتطبيقاتها في مختبر خدمة التشخيص. 

Video: Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Genetics

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

مصل وبلازما نسخة الكشف رقم PCR الوقت الحقيقي باستخدام

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Cancer Research

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including biological such as T-DNA or transposon, chemical such as ethyl methanesulfonate (EMS), or physical such as ionization radiation. The type of mutation observed varies depending on the mutagen used. For ionization radiation induced mutants, mutations include deletion, duplication, or rearrangement. While T-DNA or transposon-based mutagenesis is limited to species that are susceptible to transformation, chemical or physical mutagenesis can be applied to a broad range of species. However, the characterization of mutations derived from chemical or physical mutagenesis traditionally relies on a map-based cloning approach, which is labor intensive and time consuming. Here, we show that a high-density genome array-based comparative genomic hybridization (aCGH) platform can be applied to efficiently detect and characterize copy number variations (CNVs) in mutants derived from fast neutron bombardment (FNB) mutagenesis in Medicago truncatula, a legume species. Whole genome sequence analysis shows that there are more than 50,000 genes or gene models in M. truncatula. At present, FNB-induced mutants in M. truncatula are derived from more than 150,000 M1 lines, representing invaluable genetic resources for functional studies of genes in the genome. The aCGH platform described here is an efficient tool for characterizing FNB-induced mutants in M. truncatula.

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

This protocol provides experimental steps and information about reagents, equipment, and analysis tools for researchers who are interested in carrying out whole genome array-based comparative genomic hybridization (CGH) analysis of copy number variations in plants.

المستندة إلى صفيف "مقارنة الجينوم التهجين منصة" "الكشف عن كفاءة من نسخ عدد الاختلافات" في طفرات "سريعة النيوترون" المستحثة فصة برميلية

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

الكشف عن متغير CDH1 نسخة نادرة في الأنسجة المجمدة الطازجة سرطان المعدة ببكر الرقمية المستندة إلى شرائح

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

تظاهرة فنية من الجامعة التهجين الجينومي المقارن صفيف الجينوم

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation genetic test, this technique has its unique advantages in scalability, throughput, and cost. For the pre-implantation genetic test for aneuploidy analysis, the semiconductor-based next-generation sequencing (NGS) system presented here provides a comprehensive approach to determine structural genetic variants at a minimum resolution of 8 Mb. From sample acquisition to the final report, the working process requires multiple steps with close adherence to protocols. Since various critical steps could determine the outcome of amplification, quality of the library, coverage of reads, and output of data, descriptive information with visual demonstration other than words could offer more detail to the operation and manipulation, which may have a great impact on the results of all critical steps. The methods presented herein will display the procedures involved in whole genome amplification (WGA) of biopsied Trophectoderm (TE) cells, genomic library construction, sequencer management, and finally, generating copy number variants' reports.

The protocol presents the overall in-lab procedures required in pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor-based next-generation sequencing platform. Here we present the detailed steps of whole genome amplification, DNA fragment selection, library construction, template preparation, and sequencing working flow with representative results.

الاختبار الجيني قبل الزرع لمرض الصبغيات العدلية على منصة تسلسل الجيل التالي القائمة على أشباه الموصلات

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective anti-tumor strategies. Although concerns are frequently raised due to differences in sample processing and depth of coverage, next-generation sequencing of solid tumors have unraveled a highly variable degree of ITH across tumor types. Capturing the genetic relatedness between primary and metastatic lesions through the identification of clonal and subclonal populations is critical to the design of therapies for advance-stage diseases. Here, we report a method for comparative lesions analysis that allows for the identification of clonal and subclonal populations among different specimens from the same patient. The experimental approach described here integrates three well-established approaches: histological analysis, high-coverage multi-lesion sequencing, and immunophenotypic analyses. In order to minimize the effects on the detection of subclonal events by inappropriate sample processing, we subjected tissues to careful pathological examination and neoplastic cell enrichment. Quality controlled DNA from neoplastic lesions and normal tissues was then subjected to high coverage sequencing, targeting the coding regions of 409 relevant cancer genes. While only looking at a limited genomic space, our approach enables evaluating the extent of heterogeneity among somatic alterations (single-nucleotide mutations and copy-number variations) in distinct lesions from a given patient. Through comparative analysis of sequencing data, we were able to distinguish clonal vs. subclonal alterations. The majority of ITH is often ascribed to passenger mutations; therefore, we also used immunohistochemistry to predict functional consequences of mutations. While this protocol has been applied to a specific tumor type, we anticipate that the methodology described here is broadly applicable to other solid tumor types.

This article describes a method to identify clonal and subclonal alterations among different specimens from a given patient. Although the experiments described here focus on a specific tumor type, the approach is broadly applicable to other solid tumors.

تحليل آلافات المقارنة من خلال نهج التسلسل المستهدف

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Behavior

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

ميكروأرس] DNA : نموذج مراقبة الجودة ، وتهجين صفيف والمسح الضوئي

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

الكشف عن التعديلات الوراثية الجسدية في عينات الورم عن طريق التقاط اكسون وتسلسلها الموازي واسع

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

DNA Microarrays

Microarrays are high-throughput and relatively inexpensive assays that can be automated to analyze large quantities of data at a time. They are used in genome-wide studies to compare gene or protein expression under two varied conditions, such as healthy and diseased states. Microarrays consist of glass or silica slides on which probe molecules are covalently attached through surface functionalization. Most commonly, the slides are prepared through the chemisorption of silanes to silica surfaces.
While DNA microarrays are used to monitor gene expression, protein microarrays detect biologically relevant interactions of a fluorescently labeled protein with other proteins, DNA, or small molecules.
DNA microarray slides are often called gene chips or DNA chips. DNA chips are widely used to profile thousands of genes parallelly. Other than gene expression, they are also used in studying microRNA expression, DNA copy numbers, and single-nucleotide polymorphism detection. Commercially, these chips are used in biotechnology, forensics, toxicology, drug discovery, and targeted therapy for infectious and genetic diseases.
The chemically stable nature of DNA probes makes DNA chips the most popular of the microarray technologies. The covalently bound single-stranded DNA probe retains its native interactions despite harsh chemicals and temperatures that are used during probe loading and chip preparation.
The most obvious shortcoming of DNA microarrays is the prerequisite of a known target sequence. Because DNA microarray probes are designed to complement the target cDNA sequence, the sequence of the mRNA from which the cDNA is copied must be known. This makes the technology unusable while looking for novel mRNA sequences. For such purposes, RNASeq is the preferred albeit expensive option.

DNA Microarrays: High-throughput Gene Expression Profiling

المصفوفات الدقيقة للحمض النووي

Microarrays are high-throughput and relatively inexpensive assays that can be automated to analyze large quantities of data at a time. They are used in ...