The authors have no acknowledgements.

1. L&#39;etichettatura di reazione <ol><li> Prima dell&#39;uso, dUTPs pre-un&#39;aliquota cianinico 3 e 5-etichettati, nucleotidi senza etichetta e primer casuali alle concentrazioni consigliate dal produttore in lastre e negozio a 96 pozzetti a -20 C pronto per l&#39;uso. Ai fini del presente protocollo, aliquota 10,5 ml di adeguata dUTP etichettato e 10,5 ml nucleotidi senza etichetta e primer casuali in ogni pozzetto. </li><li> Scongelare il piatto pronto all&#39;uso 96 pozzetti di nucleotidi e primer a 4 ° C per circa 1 ora, al riparo dalla luce. </li><li> Una volta scongelato, equilibrare questo piatto a temperatura ambiente per almeno 30 minuti, al riparo dalla luce. </li><li> Equilibrare campioni di DNA a 60 ° C per almeno 15 min. </li><li> Utilizzando un robot liquido movimentazione, erogare acqua priva di nucleasi a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. NOTA: Il volume di acqua dipenderà dalla concentrazione di ciascun campione di DNA input e dovrebbe essere sufficiente a determinare una concentrazione finale di 50 ng / ul. </li><li> Utilizzando un han liquidorobot dling, pipetta 1 mg di DNA in un pozzo della piastra a 96 pozzetti (vedi 1.5) per portare il volume totale a 20 l. NOTA: Piccole quantità di DNA possono essere utilizzati anche se la qualità dei dati risultante può essere compromessa (per i campioni preziosi, le quantità di DNA di ingresso fino a 400 ng possono essere utilizzati). </li><li> Utilizzando un robot manipolatore liquida, trasferire 20 ml di nucleotidi equilibrate e primer in ciascun pozzetto della piastra di DNA diluito. </li><li> Sigillare la piastra a 96 pozzetti con tappi striscia (una tenuta stagna è fondamentale). </li><li> Denaturare il DNA a 99 ° C per 10 min in una macchina PCR con un coperchio riscaldato e quindi far scattare raffreddare su ghiaccio per 5 min a primer ricottura. </li><li> Utilizzando una gestione robot liquido, aggiungere 10 ml di Klenow DNA polimerasi Exo enzima per ogni DNA e mix pipetta accuratamente. NOTA: Il volume totale dovrebbe essere di 50 ml. </li><li> Sigillare la piastra a 96 pozzetti e incubare a 37 ° C per 16 ore. NOTA: A incubazione più breve di 4 ore è sufficiente tuttavia un O / N incubation può essere più conveniente. </li><li> Utilizzando un robot liquido movimentazione, aggiungere 5 ml di tampone di arresto a ciascun pozzetto. NOTA: Una sintesi dei reagenti utilizzati per la reazione di marcatura è mostrato in Tabella 1. </li></ol> 2. Rimozione di Unincorporated nucleotidi <ol><li> Rimuovere nucleotidi non incorporati utilizzando silice membrana a base colonne di spin e un robot di spin elaborazione colonna dedicato (le colonne di rotazione possono essere trattati manualmente). Seguire le istruzioni del produttore. <ol><li> Trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in una provetta 2 ml; pre-label questi con ID e di. NOTA: Questa fase può essere eseguita manualmente o, preferibilmente usando un robot di manipolazione di liquido. </li><li> Se si utilizza un trattamento robot Spin Column, quindi caricare il robot con 2 ml tubi, colonne di rotazione di purificazione del DNA e buffer associati. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di sale, di legame al DNA tampone (buffer PB) per la reazione di marcatura di legare il DNA marcato per la silicemembrana. </li><li> Rimuovere le impurità lavando membrana due volte con 500 microlitri tampone di lavaggio (tampone PE). </li><li> Aggiungere 15 microlitri tampone di eluizione basso sale (tampone EB) alla membrana per recuperare il purificato, DNA marcato in un volume di ~ 12 microlitri. </li></ol></li></ol> 3. Unire Hyb Pairs <ol><li> Unire le coppie appropriate di cianinico 3 e 5 DNA marcato, COT-1 DNA, un mix di blocco fornito dal produttore e un buffer di ibridazione fornito dal produttore con un robot di liquido di movimentazione. NOTA: Queste coppie Hyb possono essere un campione e un riferimento, o un campione vs campione se CNVs condivisa non sono un problema (ad esempio, abbiamo regolarmente pair campioni fenotipo-non corrispondenti, come ad esempio una displasia paziente renale vs un paziente craniosinostosi, in quanto sono molto improbabile portare la stessa clinicamente significativa CNV). Se si utilizza un DNA di riferimento, si raccomanda una fornitura DNA commerciale, e dovrebbe essere elaborato fianco campione. <ol><li> Usando un trattamento liquido robot, aggiungere COT-1 DNA (3333 ng / ml), il fornito dal produttore di bloccaggio mix e tampone di ibridizzazione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti in modo che ogni pozzetto contiene 1,1 microlitri COT-1 DNA, 4,95 ml mix di blocco e 24.75 tampone di ibridazione microlitri. </li><li> Aggiungere 9.35 ml di DNA adeguato Cyanine 3-marcato in ciascun pozzetto. Pre-bagnato ogni suggerimento per migliorare accuratezza della dispensazione. </li><li> Aggiungere 9.35 ml di DNA Cyanine appropriata 5 marcato a ciascun bene. Pre-bagnato ogni suggerimento per migliorare accuratezza della dispensazione. </li><li> Sigillare la piastra a 96 pozzetti e vortex per 1 min. Spin la piastra a 96 pozzetti per raccogliere contenuti sul fondo di ciascun pozzetto. </li></ol></li></ol> 4. Ibridazione <ol><li> Preriscaldare il forno a 65 ° C e ibridazione preriscaldare una diapositiva di supporto e una camera di ibridazione per ogni diapositiva array. <ol><li> Denaturare il DNA marcato in incubazione pre-ibridazione prima di applicare agli array. Eseguire ibridazione in un forno rotante per 24 h. </li><li> Incubare la piastra a 96 pozzetti a 70 ° C per 30 min e poi lasciato a 37 ° C per almeno 5 minuti. </li><li> Lavorando ad una piattaforma riscaldata a 42 ° C, caricare ogni vetrino backup in una camera di ibridazione prima dell&#39;uso. Assicurarsi che la parte trasparente della slitta guarnizioni allinea con la parte &#39;finestrato&#39; della camera di ibridazione. </li><li> Dispensare 42 ml di mix ibridazione preparato in precedenza (vedi punto 3) sulla posizione appropriata sulla matrice sostegno diapositiva. Pre-bagnato ogni suggerimento per migliorare accuratezza della dispensazione. Pipettare lentamente sul centro di ciascuna posizione, assicurandosi che il liquido non tocchi il confine anello di gomma. </li><li> Una volta che tutte le posizioni sul vetrino supporto sono pieni, attenzione abbassare la diapositiva matrice su di esso e assemblare la camera di ibridazione. Assicurarsi che il lato della matrice con la scrittura su di esso si trova ad affrontare la diapositiva supporto. Assicurarsi di serrare la vite camera di ibridazione. </li><li> Ispezionare la camera di ibridazione assemblato. ENsure che non vi siano perdite di miscela di ibridazione fuori dei confini anello in gomma e ogni bolla d&#39;aria è ~ 4 mm quando la camera di ibridazione viene appoggiata sulla sua estremità verticalmente. Ruotare la camera di ibridazione e controllare che non vi siano bolle d&#39;aria che sono bloccati in posizione e non si muove. Se ci sono uno di questi, dare la camera di un forte tap in panchina. Verificare che tutte le bolle d&#39;aria si muovono. </li><li> Posizionare la camera di ibridazione in forno rotante a 65 ° C per 24 ore. Assicurarsi che il rotore del forno è equilibrato; utilizzare altre camere vuote se necessario. </li></ol></li></ol> 5. Lavaggio e la scansione di diapositive <ol><li> Lavare gli array per rimuovere l&#39;eccesso di DNA marcato e quindi eseguire la scansione per misurare la fluorescenza di ogni sonda. <ol><li> Prendere camere ibridazione di forno e smontare. Le diapositive di matrice e guarnizioni saranno incollati; immergere questi in tampone di lavaggio 1 e utilizzare un paio di plastica, pinze piatto da taglio per fare leva loro a parte. </li><li> Discard la diapositiva guarnizione e posizionare il vetrino array in un rack sommersa in tampone 1. </li><li> Lavare il vetrino array in ~ 700 ml di tampone di lavaggio fresco 1 per 5 min, agitando vigorosamente (utilizzare una pulce e un agitatore magnetico). </li><li> Trasferire il vetrino array per ~ 700 ml tampone di lavaggio 2 e lavare per 90 secondi, mescolando energicamente. Sollevare delicatamente le diapositive matrice su tampone di lavaggio 2, dovrebbero emergere a secco. </li><li> Caricare il vetrino array in un portavetrini dello scanner, utilizzando un protettore diapositiva. Caricare la diapositiva nello scanner matrice e la scansione seguendo le istruzioni del produttore della matrice. </li></ol></li></ol>

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	<li>Miller, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+statement:+chromosomal+microarray+is+a+first-tier+clinical+diagnostic+test+for+individuals+with+developmental+disabilities+or+congenital+anomalies.">Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies.</a> Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).</li><li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+CGH+as+a+first+line+diagnostic+test+in+place+of+karyotyping+for+postnatal+referrals+-+results+from+four+years'+clinical+application+for+over+8,700+patients.">Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients.</a> Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).</li><li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+implementation+of+array+comparative+genomic+hybridisation+as+a+first+line+test+in+place+of+postnatal+karyotyping+for+genome+imbalance.">Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance.</a> Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).</li><li>Beaudet, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+chromosomal+microarray+analysis+in+developmental+and+behavioral+pediatrics.">The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics.</a> Child Dev. 84, 121-132 (2013).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implementation+of+whole-genome+array+CGH+as+a+first-tier+test+in+5080+pre+and+postnatal+cases.">Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases.</a> Mol. Cytogenet. 4, 12 (2011).</li><li>Iafrate, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+large-scale+variation+in+the+human+genome.">Detection of large-scale variation in the human genome.</a> Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).</li><li>Redon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+variation+in+copy+number+in+the+human+genome.">Global variation in copy number in the human genome.</a> Nature. 444, 444-454 (2006).</li><li>Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+features+in+patients+with+15q11.2(BP1-BP2)+deletion:+Further+delineation+of+an+emerging+syndrome.">Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome.</a> Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).</li><li>Molin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microdeletion+syndrome+at+3q13.31+characterised+by+developmental+delay,+postnatal+overgrowth,+hypoplastic+male+genitals,+and+characteristic+facial+features.">A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features.</a> J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).</li><li>Tropeano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-biased+autosomal+effect+of+16p13.11+copy+number+variation+in+neurodevelopmental+disorders.">Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders.</a> PLoS One. 8, e61365 (2013).</li><li>Bon, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+delineation+of+the+15q13+microdeletion+and+duplication+syndromes:+a+clinical+spectrum+varying+from+non-pathogenic+to+a+severe+outcome.">Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome.</a> J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Array CGH non rileverà riarrangiamenti bilanciati o anomalie ploidia quali triploidia. Inoltre, basso livello squilibri mosaico non possono essere rilevati. Tuttavia, CGH array ha una risoluzione più alta per il rilevamento CNV di analisi cromosomica G-banded quale essa ha sostituito in molti laboratori di citogenetica. E &#39;quindi il gold standard attuale per tutto il genoma di rilevamento CNV. Essa può essere sostituito da tecnologie di sequenziamento di prossima generazione per il futuro, ma attualmente, il loro costo e la complessità tecnica associata con l&#39;utilizzo di breve legge per il rilevamento CNV significa che questa non è ancora una buona misura per uso clinico. Il protocollo qui descritto è in uso di routine nel nostro laboratorio servizio clinico. Due percorsi di 96 campioni ciascuna sono trattati ogni settimana con un robot di gestione dei liquidi e una membrana di silice elaborazione Spin Column robot dedicato. Automation è altamente raccomandato per migliorare la coerenza e mantenere la qualità. DNA estratto da sangue, Saliva, campioni prenatali (ad esempio, villi coriali o liquido amniotico) o campioni di tessuto possono essere, e di routine è, usato con questo protocollo. L&#39;ozono è noto a degradare cianine e quindi si raccomanda un monitoraggio dell&#39;ozono e protezione. Variazione stagionale dei livelli di ozono è anche comune. I nostri monitor di laboratorio e di aggiudicazione di ozono continuamente. Un&#39;unità rimozione di ozono a parete viene utilizzato per ridurre i livelli di ozono e zone particolarmente sensibili del protocollo (ossia, il lavaggio e la scansione array) vengono eseguite in cappe senza ozono. Se possibile, i livelli di ozono sono mantenuti al di sotto di 5 ppb. La maggior parte dei reagenti vengono acquistati come kit da produttori di esternalizzare efficacemente il controllo della qualità; questo ha dimostrato di essere una strategia efficace. Tuttavia, questo non significa che non è richiesto il controllo di qualità. In effetti, le metriche di qualità sono attentamente monitorati per eventuali anomalie: derivata deviazione standard dei rapporti log2 (DLRS) dovrebbe essere Below 0.2, cianinici 3 e 5-segnale intensità dovrebbe essere maggiore di 500 e cianinico 3 e 5-rapporto segnale rumore dovrebbe essere&gt; 30. Questi parametri vengono generati come parte del protocollo di scansione dal software di scansione e vengono registrati per il monitoraggio a lungo termine.

E &#39;noto da molti anni che delezioni o copie extra di segmenti cromosomici causano ritardo mentale, dismorfismi e malformazioni congentical, e in alcuni casi causare sindromi genetiche 1. Tuttavia, l&#39;unica tecnologia disponibile fino alla metà degli anni 2000 per la rilevazione genoma a livello di questi cambiamenti era G fasciato analisi cromosomica, che ha una risoluzione di circa 5-10 MB, a seconda della regione e la natura dello squilibrio, e che non può rilevare cromosomi anormali in cui il materiale è stato sostituito da una regione di un cromosoma differente con lo stesso pattern di bande. Ausiliari tecniche di citogenetica, come ibridazione fluorescente in situ e multiplex specifici legatura probe amplificazione sono stati disponibili per l&#39;interrogatorio di loci specifico, in caso di sospetto di squilibrio sindromico specifico, ma non è stato fino all&#39;introduzione della matrice ibridazione genomica comparativa (CGH array) nella routine clinica s diagnosticoervice 2-5 che il rilevamento a livello di genoma di numero di copie varianti (CNV) è diventato disponibile in forte aumento la risoluzione (in genere circa 120 KB). Lavori di manutenzione clinica accanto studi di ricerca hanno dimostrato che CNVs per alcune regioni sono molto diffuse nella popolazione normale 6-7, mentre altri CNVs, precedentemente non rilevabili, sono associati con neurodisabilities come l&#39;autismo e l&#39;epilessia 8-11. Il protocollo descritto in questo documento viene utilizzato nel nostro UK National Health Service (NHS) laboratorio di diagnosi clinica; usiamo strategie di ibridazione nuove, prove per lotto e robotica per minimizzare i costi di questo servizio finanziati dallo Stato. Prima il protocollo descritto di seguito, il DNA di alta qualità dovrebbe essere estratto dal materiale di partenza appropriati, comunemente sangue, cellule coltivate o campioni di tessuto. Spettrofotometria può essere utilizzato per misurare la concentrazione (dovrebbe essere&gt; 50 ng / ul) e controllare 260: 280 rapporti di assorbanza (dovrebbe be 1.8-2.0). Elettroforesi gel può essere utilizzato per verificare che il DNA è di alto peso molecolare senza degradazione significativa. Questo protocollo è stato progettato per i laboratori di throughput più elevate che sono l&#39;etichettatura 96 ​​campioni per analisi utilizzando la robotica automatizzata gestione dei liquidi. Tuttavia, può essere adattato per laboratori di throughput inferiori senza automazione.

<table><tbody><tr><td>CGH microarray 8 x 60K</td><td>Agilent</td><td>G4126</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH wash buffers</td><td>Agilent</td><td>5188-5226</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH hybridisation buffer</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Minelute purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH labelling kit</td><td>Enzo</td><td>ENZ-42672-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

array comparative genomic hybridization (array cgh) for detection of genomic copy number variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Ogni sonda su una matrice ibrida è visualizzato come una miscela di fluorocromi rosso e verde (vedi Figura 1). Il rapporto di rosso al segnale verde fluorescente per ciascuna sonda viene quantificato dallo scanner e il relativo software traccia questi come rapporti log2 base alla loro posizione genomica, e identifica le regioni di confine preimpostati fuori. L&#39;array tracce risultanti permettono l&#39;interpretazione delle regioni identificate come genomicamente sbilanciato. Per esempio, la traccia di un bambino con sindrome di Williams, una sindrome microdeletion ricorrente mediata da ripetizioni copia bassi nella regione prossimale del cromosoma 7, è illustrato nella figura 2. Tale squilibrio è stato identificato dal software ed indicato da una linea rossa. Sonda rapporti log fluorescenti dovrebbero raggrupparsi strettamente circa 0, come illustrato in figura 2, che indica un verde / rosso rapporto di 1: 1 per normali regioni del genoma. Tracce di array sparsi possono Resul<html> t in chiamata imprecisa delle regioni anomale, o mancata identificazione squilibrio genomica (vedi figura 3). Tale dispersione può essere causato da una serie di fattori, tra cui la qualità scadente DNA, o la presenza di livelli elevati di ozono nell&#39;atmosfera. Si raccomanda il monitoraggio dei livelli di ozono, e dove i livelli di ozono elevati sono problematici, armadi esclusione ozono dedicati sono disponibili; uso di questi armadi genere provoca notevolmente migliorata qualità array. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51718/51718fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Immagine di un seguito ibridazione array. La scatola bianca presenta un&#39;area ingrandita, in cui le sonde rosse e verdi sonde possono essere visualizzati (indicando squilibrio per le regioni rappresentate da queste sonde), in un contesto di sonde giallo (che indica le regioni genomiche bilanciati ). ONTENUTO &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51718/51718fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. (A) Esempio di traccia per cromosoma 7 in un campione con una delezione 1.7Mb, dimostrato da un rapporto medio -0.8 per 43 sonde consecutivi. La regione eliminata in questo caso è associata con la sindrome di Williams-Beuren, in linea con l&#39;indicazione rinvio di dismorfismi, un difetto cardiaco e ritardo mentale. (B) La regione cancellata sopra visualizzato nel browser USCS genoma, mostrando i geni all&#39;interno della cancellata regione. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51718/51718fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51718/51718fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3.Esempio di una traccia matrice sparsi per cromosoma 7 in un campione con scarsa ibridazione. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51718/51718fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) </td></tr><tr><td> Primer e tampone di reazione </td><td align="right"> 20 </td></tr><tr><td> DNA (1 ug) + acqua </td><td align="right"> 20 </td></tr><tr><td> Polimerasi Klenow Exonuclease DNA </td><td align="right"> 10 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Sintesi dei reagenti utilizzati per la reazione di marcatura.

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Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

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Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

19.5K Views.  Guy's & St Thomas' NHS Foundation Trust.  Array CGH per la rilevazione di varianti del numero di copie genomiche ha sostituito l'analisi del cariotipo G-fasciato. Questo articolo descrive la tecnologia e la sua applicazione in un laboratorio di servizio diagnostico. 

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Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

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Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

Rilevamento di una variante rara trascrizione CDH1 in tessuti di cancro gastrico fresco congelato mediante PCR digitale basata su Chip

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

Dimostrazione tecnica di ibridazione Whole Genome Array Comparative Genomic

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Biologia

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation genetic test, this technique has its unique advantages in scalability, throughput, and cost. For the pre-implantation genetic test for aneuploidy analysis, the semiconductor-based next-generation sequencing (NGS) system presented here provides a comprehensive approach to determine structural genetic variants at a minimum resolution of 8 Mb. From sample acquisition to the final report, the working process requires multiple steps with close adherence to protocols. Since various critical steps could determine the outcome of amplification, quality of the library, coverage of reads, and output of data, descriptive information with visual demonstration other than words could offer more detail to the operation and manipulation, which may have a great impact on the results of all critical steps. The methods presented herein will display the procedures involved in whole genome amplification (WGA) of biopsied Trophectoderm (TE) cells, genomic library construction, sequencer management, and finally, generating copy number variants' reports.

The protocol presents the overall in-lab procedures required in pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor-based next-generation sequencing platform. Here we present the detailed steps of whole genome amplification, DNA fragment selection, library construction, template preparation, and sequencing working flow with representative results.

Test genetici preimpianto per aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective anti-tumor strategies. Although concerns are frequently raised due to differences in sample processing and depth of coverage, next-generation sequencing of solid tumors have unraveled a highly variable degree of ITH across tumor types. Capturing the genetic relatedness between primary and metastatic lesions through the identification of clonal and subclonal populations is critical to the design of therapies for advance-stage diseases. Here, we report a method for comparative lesions analysis that allows for the identification of clonal and subclonal populations among different specimens from the same patient. The experimental approach described here integrates three well-established approaches: histological analysis, high-coverage multi-lesion sequencing, and immunophenotypic analyses. In order to minimize the effects on the detection of subclonal events by inappropriate sample processing, we subjected tissues to careful pathological examination and neoplastic cell enrichment. Quality controlled DNA from neoplastic lesions and normal tissues was then subjected to high coverage sequencing, targeting the coding regions of 409 relevant cancer genes. While only looking at a limited genomic space, our approach enables evaluating the extent of heterogeneity among somatic alterations (single-nucleotide mutations and copy-number variations) in distinct lesions from a given patient. Through comparative analysis of sequencing data, we were able to distinguish clonal vs. subclonal alterations. The majority of ITH is often ascribed to passenger mutations; therefore, we also used immunohistochemistry to predict functional consequences of mutations. While this protocol has been applied to a specific tumor type, we anticipate that the methodology described here is broadly applicable to other solid tumor types.

This article describes a method to identify clonal and subclonal alterations among different specimens from a given patient. Although the experiments described here focus on a specific tumor type, the approach is broadly applicable to other solid tumors.

Analisi comparativa delle lesioni attraverso un approccio di sequenziamento mirato

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Comportamento

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

DNA microarray: Esempio di controllo della qualità, ibridazione e scansione di array

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

Rilevamento somatici genetiche Alterazioni in campioni tumorali da Exon Capture e Sequencing Massively Parallel

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

DNA Microarrays

Microarrays are high-throughput and relatively inexpensive assays that can be automated to analyze large quantities of data at a time. They are used in genome-wide studies to compare gene or protein expression under two varied conditions, such as healthy and diseased states. Microarrays consist of glass or silica slides on which probe molecules are covalently attached through surface functionalization. Most commonly, the slides are prepared through the chemisorption of silanes to silica surfaces.
While DNA microarrays are used to monitor gene expression, protein microarrays detect biologically relevant interactions of a fluorescently labeled protein with other proteins, DNA, or small molecules.
DNA microarray slides are often called gene chips or DNA chips. DNA chips are widely used to profile thousands of genes parallelly. Other than gene expression, they are also used in studying microRNA expression, DNA copy numbers, and single-nucleotide polymorphism detection. Commercially, these chips are used in biotechnology, forensics, toxicology, drug discovery, and targeted therapy for infectious and genetic diseases.
The chemically stable nature of DNA probes makes DNA chips the most popular of the microarray technologies. The covalently bound single-stranded DNA probe retains its native interactions despite harsh chemicals and temperatures that are used during probe loading and chip preparation.
The most obvious shortcoming of DNA microarrays is the prerequisite of a known target sequence. Because DNA microarray probes are designed to complement the target cDNA sequence, the sequence of the mRNA from which the cDNA is copied must be known. This makes the technology unusable while looking for novel mRNA sequences. For such purposes, RNASeq is the preferred albeit expensive option.

DNA Microarrays: High-throughput Gene Expression Profiling

Microarray di DNA

Microarrays are high-throughput and relatively inexpensive assays that can be automated to analyze large quantities of data at a time. They are used in ...