Auch wenn die Genbearbeitung für die Erforschung der Molekulargenetik von Nicht-Modellorganismen populär geworden ist, bleibt RNAi ein mächtiges synergistisches Werkzeug. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie auf verschiedene Entwicklungsstadien angewendet werden kann. Darüber hinaus kann ein partieller Knockdown verwendet werden, um diese ganzen Gene zu untersuchen.
Der Erfolg des Verfahrens beruht auf der Injektion von DSR und mit minimalem Schaden. Dies erfordert Praxis, also lassen Sie sich nicht entmutigen, wenn es ein paar Versuche braucht, um es richtig zu machen. Um Embryonen im Frühstadium für die Mikroinjektion vorzubereiten, gießen Sie zunächst kochende 20%Agarose in eine kleine Petrischale und legen Sie drei ein bis zwei Millimeter breite Kunststoffröhren auf die Oberfläche der flüssigen Agarose, bevor sie erstarrt.
Sobald die Agarose erstarrt ist, verwenden Sie ein Paar stumpfe Zange, um die Rohre zu entfernen und die resultierenden Einkerbungen mit 500 Mikroliter Autoklav destilliertem Wasser zu bedecken. Wenn der Sammelbehälter bereit ist, verwenden Sie einen feinen natürlichen Haarpinsel, um fünf acht Stunden alte T.marmoratus Embryonen aus den Käfernistplätzen in eine Glashohlraumschale zu übertragen, die mit Autoklavendestilliertem Wasser unter einem Stereomikroskop gefüllt ist. Mit dem Mikroskop und feinen Sezierzangen greifen die Chorion jedes Embryos von beiden Seiten und reißen die Chorion auf, so dass der Embryo sanft aus dem Gewebe gleiten kann.
Nach dem Entfernen beider Chorionsschichten aus allen gesammelten Embryonen verwenden Sie den Pinsel, um die Embryonen vorsichtig aus der Glashöhlenschale in die Rillen der vorbereiteten Agaroseplatte zu übertragen. Um Embryonen im Frühstadium mit genspezifischer doppelsträngiger RNA zu injizieren, bereiten Sie zunächst Mikroinjektionsnadeln auf einem Nadelpuler vor und verwenden sie das Stereomikroskop und finden Zangen, um jede Spitze bis zu einer scharfen Kante zu brechen. Nachdem Sie die gereinigte, doppelsträngige RNA auf Eis geworfen haben, fügen Sie der resultierenden Lösung einen Mikroliter 10-fachen Injektionspuffer hinzu und verwenden Sie doppelt destilliertes Wasser, um das Vinylvolumen der Lösung auf 10 Mikroliter zu bringen.
Verwenden Sie eine P10-Pipette, um eine der vorbereiteten Mikroinjektionsnadeln mit der arbeitenden doppelsträngigen RNA-Lösung zu füllen und die Nadel in einen Mikronadelhalter zu laden, der mit einem Mikroinjektionssystem verbunden ist, das die Druckauswurftechnologie nutzt. Schalten Sie das Mikroinjektionssystem und die Druckluftzufuhr ein und verwenden Sie das Mikroventil am Mikroinjektionssystem, um den Einspritzdruck auf 15 Pfund Druck pro Quadratzoll einzustellen und dann den Zeiteinstellungsknopf zu verwenden, um die Injektionsdauer auf Sekunden einzustellen. Um die Injektionsnadel zu kalibrieren, bewerten Sie das Volumen der Flüssigkeitsblase, die an der Spitze der Nadel gebildet wird, wenn sie in die Luft für T.marmoratus Embryo injiziert wird, verwenden Sie eine optimale Blasengröße von 100 bis 200 Mikrometer.
Die Injektionsnadel ist von guter Qualität, wenn optimale Blasen bei 15 Pfund Druck pro Quadratzoll mit einer Injektionsdauer von etwa drei Sekunden erreicht werden können. Wenn die Nadel aufgestellt ist, richtet die Nadel auf der Agaroseplatte von Embryonen so aus, dass sich die Nadel den Embryonen in einem Winkel von 45 bis 60 Grad nähert. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Mikronadel langsam zu bewegen, bis die Spitze die Oberfläche der Mitte eines Embryos berührt und dann vorsichtig die Nadel nach vorne bewegt, bis sie nur die Oberfläche des Embryos durchbohrt.
Sobald sich die Nadel im Embryo befindet, drücken Sie vorsichtig den Mikroinjektor-Injektionsknopf, um ein bis zwei Nanoliter doppelsträngiger RNA in den Embryo zu liefern. Wenn die gesamte RNA geliefert wurde, ziehen Sie die Nadel langsam aus dem Embryo zurück, ohne dass der Embryo bricht. Erfolgreich injizierte Embryonen können durch das Vorhandensein eines farbigen Flecks an der Injektionsstelle identifiziert werden.
Wenn alle Embryonen sorgfältig injiziert wurden, legen Sie die Schale vorsichtig in eine Feuchtigkeitskammer in einem 25 Grad Celsius Inkubator eingestellt, um einen 14 Stunden licht 10 Stunden dunklen Zyklus für vier bis fünf Tage. Überwachen Sie täglich den Entwicklungsfortschritt der Embryonen unter dem Stereomikroskop, um morphologisch sichtbare Knockdown-Phänotypen zu identifizieren. Verwenden einer hochauflösenden Digitalkamera zur Dokumentation des Entwicklungsprozesses.
Entfernen Sie alle toten Embryonen und füllen Sie das Wasser auf der Agaroseplatte täglich auf, um austrocknung und die Ausbreitung der mikrobiellen Kontamination auf andere überlebende Embryonen während der Inkubationszeit zu vermeiden. Vor dem Sammeln der Larve zuerst 60 bis 70 Grad Celsius 2% flüssige Agarose zu einer kleinen Petrischale hinzufügen. Wenn die Agarose verfestigt hat, verwenden Sie stumpfe Zangen, um eine flache Gruppe pro Larve herzustellen, die in die Agarose injiziert werden soll, und das Wasser vorsichtig aus den Larvenkulturbechern abtropfen zu lassen.
Nach der Anästhesie verwenden Sie weiche, gemittelte Zangen, um die Larve vorsichtig auf die Immobilisierungsplatte mit den Hälsen und Körpern in den Rillen zu legen, aber der Schwanz befindet sich über der Agarose-Oberfläche. Wenn alle Larven platziert worden waren, bedecken Sie jede Lava mit einer dicken Schicht Von Agarose, die noch flüssig ist, aber nicht gefährlich heiß und frei alle Geschichten, die versehentlich bedeckt wurden, wie nötig. für eine doppelsträngige RNA-Mikroinjektionslast eine Mikronadel mit der genspezifischen, von Interesse zeigenden doppelsträngigen RNA-Arbeitslösung.
Ziehen Sie den Kolben einer manuell gesteuerten Mikroinjektionsspritze zurück und laden Sie die Nadel auf das Mikroinjektionssystem. Positionieren Sie die immobilisierte Larve unter dem Stereomikroskop so, dass die Injektionsstelle in einem relativ flachen Winkel an der Flugbahn der Mikroinjektionsnadel ausgerichtet ist. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadelspitze vorsichtig in die Larve zu bewegen und langsam und vorsichtig Druck auf die Spritze auszuüben, indem Sie den Injektionsdruck entsprechend der Bewegung der farbigen Injektionsflüssigkeit in der Nadel bei Bedarf anpassen.
Wenn die gesamte RNA injiziert wurde, verwenden Sie weiche Zangen, um die Larve von der Agarose zu befreien und legen Sie die Larve in einen neuen Behälter mit Raumtemperatur Wasser bei 25 bis 28 Grad Celsius und einem 14 Stunden Licht 10 Stunden dunklen Zyklus. In dieser repräsentativen Analyse wurden drei verschiedene Gene in einer Vielzahl von verschiedenen Entwicklungsstadien des Sonnenkäfers T.marmoratus niedergeschlagen. Die RNA-Interferenz wird durch die Injektion von doppelsträngiger RNA in einem sehr frühen Stadium der Embryogenese nachgewiesen.
Einige der Embryonen überleben den Prozess nicht und werden nekrotisch. In diesen Bildern steuern sie Einzelne und eine Person mit einer etwas helleren Augenfarbe beobachtet werden. In diesem Individuum, ein schwererKnockdown, in dem die mehr ventralen Lügen des Clusters sind völlig unpigmentiert, aber die do Verbündeten noch zeigen einige Pigmentierung beobachtet werden können.
Hier wird ein Beispiel für ein anderes Individuum mit im Wesentlichen vollständigen Pigmentverlust in allen Augen gezeigt. Lac2 in Larven niedergeschlagen ergebnisse in einer weniger pigmentierten Nagelhaut, leichtere erwachsene Personen mit etwas deformierten Flügeln wahrscheinlich aufgrund der ungewöhnlichen Weichheit des Gewebes wurden auch erhalten. Achten Sie darauf, ihre injizierten Tiere täglich genau zu beobachten und sofort tote Individuen zu entfernen.
Die Kraft dieser Technik ist, dass sie auf die Gene vieler verschiedener Organismen angewendet werden kann. Diese Technik wurde auch weit verbreitet und erfolgreich auf die evolutionäre Entwicklungsbiologie angewendet.
