I. Die NanoDrop 2000c Spektrophotometer NanoDrop Technologie basiert auf einem innovativen Probenretention System, das die Oberflächenspannung zu halten und zu messen Mikrovolumens Proben zwischen zwei optischen Sockel ohne den Einsatz von Küvetten oder Kapillaren nutzt. Die NanoDrop 2000c Spektrophotometer verwendet diese Technologie, um schnell und einfach messen 0,5-2 ul Tröpfchen von Proteinen, DNA, RNA und andere Biomoleküle. Diese Fähigkeit ist immer wichtiger geworden als molekulare Techniken ständig weiterentwickeln, um kleinere Mengen an Material für die Analyse verwenden. Die Mikrovolumens Spektrophotometer ideal für Bedingungen, unter denen Probe ist begrenzt. Doch die Einfachheit der Benutzung, schnelle Messzyklus und, und umfangreiche Konzentrationsbereich auch das Spektralphotometer geeignet, wenn ausreichende Mengen der Probe vorhanden sind. Der Messzyklus ist auch stark reduziert, dass den Wissenschaftlern geholfen Steigerung der Effizienz in ihrem Workflows. Die Mikroprobe wird direkt auf der Detektion Oberfläche platziert und eine Flüssigkeitssäule zwischen den Enden der optischen Fasern durch die Oberflächenspannung erzeugt. Diese Flüssigkeitssäule bildet eine vertikale Strahlengang. Ein Xenon-Blitz-Lampe bietet der Lichtquelle und einem Spektrometer unter Verwendung eines linearen CCD-Array verwendet wird, um das Licht, das durch die Probe geht zu analysieren. Entfernen traditionellen Containment-Geräte wie Küvetten aus dem System hat mehrere Vorteile: sehr geringe Mengen von Probe für die Messung benötigt, Reinigung erfordert einfach Abwischen der optischen Oberflächen mit einem Labor zu wischen, und die Weglänge in Echtzeit während der Messung verändert werden. Die NanoDrop 2000c bestimmt die optimale Weglänge automatisch (1 mm bis 0,05 mm) und bietet die umfangreichste Palette von möglichen Proteinkonzentration Messungen ohne Verdünnungen. Durch die Verkürzung der Weglänge, können höhere Konzentrationen an Protein gemessen werden. Hierdurch werden die Notwendigkeit, Verdünnungen für die meisten Protein-Proben durchzuführen. Zum Beispiel kann die NanoDrop 2000c messen BSA-Konzentrationen so hoch wie 400 mg / mL. Die NanoDrop 2000c Spektrophotometer ist ein volles Spektrum Spektralphotometer für die Messung der Absorption von DNA, RNA, Proteine ​​und andere Biomoleküle. Dieses Video-Protokoll wird auf der Messung von Proteinen zu konzentrieren. II. Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung Mit A280 Absorptionsmessung a. Das Prinzip der A280-Messungen Das Protein A280 Verfahren ist anwendbar auf gereinigte Proteine, Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin Rückstände oder Cystein-Cystein Disulfidbrücken und zeigen Absorption bei 280 nm enthalten. Diese Methode verwendet die A280 Extinktionswert in Kombination mit entweder der Masse Extinktionskoeffizienten oder die molare Extinktionskoeffizient, um die Konzentration des gereinigten Proteins zu berechnen. Der Vorteil der direkten A280 Messungen ist, dass die Erzeugung einer Standardkurve nicht erforderlich ist, um Protein-Konzentration bestimmen. Wenn die Probe ein charakterisierten Protein-Lösung, Zelllysat oder Proteinrohextrakt, dann mit einem der vorkonfigurierten kolorimetrische Methoden finden Sie auf der NanoDrop 2000/2000c, wie BCA, Pierce 660 nm, Bradford und Lowry-Assays wird empfohlen. b. Mikrovolumen Protein A280 Messungen - Startup <ol><li> Wählen Sie das Protein A280 Anwendung aus dem Hauptmenü. </li><li> Wählen Sie die Art der Probe aus der Dropdown-Liste gemessen werden. Die Standardeinstellung ist für die meisten unbekanntes Protein Mischungen, in denen 1 Abs = 1 mg / mL. Empfohlen Wenn die Messung einer zuvor geprägt gereinigtes Protein, dann ist entweder die Masse Extinktionskoeffizienten oder molaren Extinktionskoeffizienten und Molekulargewicht kann eingegeben werden, um die Protein-Konzentration genauer zu bestimmen. </li><li> Wählen Sie die Konzentration Einheiten aus der Dropdown-Liste. </li></ol> c. Mikrovolumen Protein A280 Messungen - Blanking <ol><li> Stellen Sie eine leere mit einem geeigneten Puffer. Es ist wichtig, um den Puffer, in dem das Protein suspendiert verwenden. Der Puffer verwendet werden, sollten den gleichen pH-Wert und einer ähnlichen Ionenstärke als die Probelösung werden. Hinweis: RIPA Puffer beitragen zu viel Absorption bei 280 nm und sind daher nicht mit direkten A280 Protein-Messungen. Für Proteine ​​in einer RIPA-Puffer suspendiert, ist es empfehlenswert Proteinkonzentration bestimmt mit einem RIPA Puffer kompatibel Farbtestverfahren werden. </li><li> Pipette 2 ul der entsprechenden Blenden-Lösung auf den Boden Sockel, senken Sie den Arm aus und klicken Sie Blank. </li><li> Wischen Sie die leere Lösung aus dem unteren und oberen Sockel mit einem trockenen Labor zu wischen. </li></ol> d. Mikrovolumen Protein A280 Messungen Messen Wichtige Überlegungen: Die Homogenität der Probe ist extremwichtig, da so ein kleines Volumen gemessen wird. Um sicherzustellen, dass die Proben homogen sind, sanft, aber gründlich mischen die Proben unmittelbar vor der Entnahme eines Aliquots für die Messung. Vermeiden Sie die Einführung Blasen beim Mischen und Pipettieren. Aufgrund der Variabilität der Oberflächenspannung zwischen verschiedenen Proteinen, empfehlen wir loading 2 ul der Proben, um die ordnungsgemäße Spalte Bildung zu gewährleisten. Verwenden Sie immer geringer Retention Pipettenspitzen. So laden Sie eine Probe, berühren Sie die Pipettenspitze auf die geringere optische Sockel Oberfläche, während der Vertreibung der Lösung für die Lösung von der Einhaltung der Außenseite der Pipettenspitze zu verhindern. Expel weniger als den vollen Betrag der Probe Blowout und Einführung von Blasen in der Probe zu verhindern. <ol><li> Geben Sie einen Proben-ID in das entsprechende Feld, Last 2 ul der ersten Probe für die leer und klicken Sie messen beschrieben. Ein frischer 2μL Aliquot der Probe sollte für jede Messung verwendet werden. </li><li> Entfernen Sie die Probe aus dem unteren und oberen Sockel mit einem trockenen Labor zu wischen. </li></ol> e. Mikrovolumen Protein A280 Messungen Reinigung Ein gewöhnlicher, fusselfreien, Labor wischen reicht oft für die Reinigung der optischen Podesten zwischen den Messungen. f. Erstellen Protein A280 Messungen Überholung Lösungen und Reagenzien Tenside kann die Messung Sockel Oberflächen im Laufe der Zeit bedingungslos und verhindert die Probenflüssigkeit Spalte zu bilden. Eine Abflachung des Tropfens auf dem unteren Sockel ist bezeichnend für die optische Oberfläche immer unbedingt. Wenn die Oberflächeneigenschaften beeinträchtigt worden, die Instandsetzung der Sockel ist wichtig, Probe Spalte Bildung zu gewährleisten. Wenn dies geschieht, buff, die optischen Flächen kräftig mit Labor wischen oder NanoDrop Pedestal Überholung Compound (PR-1), wie verwiesen. III. Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit kolorimetrischen Assays a. Das Prinzip der kolorimetrischen Nachweis Die NanoDrop 2000c Spektrophotometer kann auch verwendet werden, um nicht charakterisierten Protein-Lösungen, Zelllysate, und Rohprotein Extrakten mittels kolorimetrischen Assays zu messen. Kolorimetrischen Methoden sind indirekte Methoden, die Interaktion eines Farbstoffs mit dem Protein-Komponente der Probe zu einem neuen Komplex, der Licht absorbiert im sichtbaren Wellenlängenbereich produzieren zu beteiligen. Die NanoDrop 2000c Spektrophotometer hat mehrere vorkonfigurierte kolorimetrischen Assays einschließlich BCA, Pierce 660, Bradford und Lowry-Methoden. Der BCA-Assay wird als ein Beispiel Farbtestverfahren mit einem Spektralphotometer Mikrovolumens nachgewiesen werden. (Screenshot) Die BCA (Bicinchoninsäure)-Assay ist ein gemeinsames kolorimetrischen Methode oft für verdünnte Proteinlösungen und Proteine ​​in Gegenwart von Komponenten, die signifikante UV (280 nm) Absorption benutzt haben. Im Gegensatz zu den Protein A280-Methode erfordert die Protein BCA-Methode, die eine Standardkurve generiert, bevor Probe Proteinkonzentrationen gemessen werden kann. Das Verfahren nutzt Bicinchoninsäure (BCA) als Nachweisreagenz. Die Cu-BCA-Chelat in Gegenwart von Protein gebildet wird bei 562 nm gemessen und normalisiert bei 750 nm. b. Mikrovolumen BCA Assay Messungen BCA Assay Vorbereitung <ol><li> BCA-Reagenz A, BCA-Reagenz B, Kompatibilität Reagenz Rekonstitution Puffer und Albumin (BSA)-Standards: Die benötigten Reagenzien sind in das Reduktionsmittel kompatibel Kit (.. Thermo Scientific Pierce Kat.-Nr. 23250) enthalten. </li><li> Äquilibrieren alle unbekannten Proteinen und Protein-Standards auf Raumtemperatur und gründlich mischen. </li><li> Bereiten Sie genügend frisches arbeiten Reagenz für die Standards und Proben zu messen mit einem 50:1-Verhältnis von Reagenz A: B </li><li> Für die Mikro-Assay, mit einem Verhältnis von 1:1 arbeiten Reagenz zur Probe. Fügen Sie 10 ul der Arbeit Reagenz in jedes Röhrchen mit genügend Rohre für alle Proben und Standards abdecken. Für den High-Bereich Assay verwenden ein 20:1-Verhältnis von Arbeit Reagenz zur Probe. Add 190 &amp;mgr; l der Arbeit Reagenz in jedes Röhrchen mit genügend Rohre für alle Proben und Standards abdecken. Lesen Sie die Pierce BCA-Kit Literatur, um festzustellen, welches Verhältnis eignet sich für Ihre Proben. </li><li> Fügen Sie 10 ul Standard bzw. Probe in jedes Röhrchen Reagenz. Gut mischen durch vorsichtiges Vortexen. </li><li> Die Röhrchen bei 37 ° C für 30 Minuten. </li><li> Lassen Sie die Reaktionen auf Raumtemperatur (~ 10 Minuten) ausgleichen. </li></ol> c. Mikrovolumen BCA Assay Messungen Generierung Standardkurve <ol><li> Wählen Sie das Protein BCA-Methode aus dem Hauptmenü. Wenn die Wellenlänge Überprüfung angezeigt wird, sicherzustellen, wird der Arm nach unten. </li><li> Geben Sie die Werte für jedes Standard-Konzentration im rechten Fensterbereich Tisch. Die Software ermöglicht die Referenz-und bis zu 7 additional Standards. Die Bezugs-und / oder Standards sollten in Wiederholungen gemessen werden. Hinweis: Die Mindestanforderung für Standardkurve Generation ist die Messung von zwei Normen oder die Messung der Null-Referenz und mindestens ein Standard. Es wird empfohlen, zusätzliche Standards wie nötig, um die erwarteten Assaykonzentration abdecken einbezogen werden. </li><li> Stellen Sie eine leere. Der Rohling für kolorimetrische Assays ist in der Regel H 2 O. deionisiertem </li><li> Pipette 2 &amp;mgr; l dH 2 O auf den Boden Sockel, senken Sie den Arm aus und klicken Sie Blank. Nur eine leere ist notwendig, um alle nachfolgenden Messungen der Referenz-und-Standards abdecken. </li><li> Stellen Sie die Referenz durch Pipettieren einer 2 ul-Aliquot, die nur arbeiten Reagenz und Puffer ohne Protein auf den unteren Sockel. Senken Sie den Arm aus und klicken Sie messen. </li><li> Unter der Standards Registerkarte, markieren Sie den gewünschten Standard und Pipette 2 ul der gewünschten Norm auf den unteren Sockel. Senken Sie den Arm aus und klicken Sie messen. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Standards. Achten Sie darauf, alle Standards vor Maßnahme zur Messung von Proben. Um Standardkurve klicken Sie auf Standard-Kurve. </li></ol> d. Mikrovolumen BCA Assay Messungen 2 ul Protein-Messungen <ol><li> Nach all den Standards gemessen worden sind, auf die Proben-Button. Geben Sie die Proben-ID. Last 2 ul der Probe auf die untere Sockel und klicken Sie auf Messen. Ein frisches 2 ul-Aliquot der Probe sollte für jede Messung verwendet werden. </li><li> Wischen Sie die Probe aus dem unteren und oberen Sockel mit einem trockenen Labor zu wischen. </li></ol> e. Mikrovolumen BCA Assay Messungen Reinigung und Wiederaufbereitung Führen Sie die Reinigung und Instandsetzung in der direkten A280 Absorptionsmessungen beschrieben. Repräsentative Ergebnisse: Mikrovolumen Proteinkonzentration Bestimmung wird entweder durch eine direkte Messung A280 oder eine indirekte kolorimetrische Assay durchgeführt. Die A280-Messung beispielsweise bestimmt Proteinkonzentration auf die Extinktionskoeffizienten des Proteins von Interesse sind. Die BCA Farbtestverfahren Beispiel wird bestimmt, Proteinkonzentration einer Standardkurve mit bekannten Protein-Konzentrationen auf.

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	<li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+by+UV+absorption.">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels.">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li><li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. u. j. i. m. o. t. o., Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li></ol>

Die Autoren sind Mitarbeiter von Thermo Fisher Scientific, dass Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert.

Mikrovolumen Quantifizierung verwendet die intrinsische Oberflächenspannung Eigenschaften einer Probe zu einer Flüssigkeitssäule zwischen zwei Messflächen bilden. Das Fehlen eines Containment-Gerät ermöglicht die Weglänge, um in Echtzeit zu ändern, im Wesentlichen entfällt die Notwendigkeit, Verdünnungen durchzuführen. Diese Fähigkeit erhöht drastisch die Dynamik von Protein-Konzentrationen sowie die Schnelligkeit der Messung. Durch die Verwendung von minimalen Mengen der Probe, kann eine große Anzahl von Proben schnell und genau analysiert werden, so dass die Wissenschaftler mehr Messungen und eine bessere Qualitätskontrolle. Darüber hinaus, und wenn nötig, können wertvolle Proben nach der Messung zurückgewonnen werden. Wenn solche kleinen Volumina gemessen werden, ist Probenhomogenität äußerst wichtig, Stichprobenfehler zu vermeiden. Low Retention Pipettenspitzen sollte immer zum Laden Proben verwendet werden und die Spitzen sollte geändert werden zwischen Probe repliziert werden. Der Sockel Flächen müssen ordnungsgemäß gereinigt und aufbereitet, um die genauesten Ergebnisse zu gewährleisten. Schließlich ist die Mikrovolumens Spektrophotometer ideal ist, wenn Probe ist jedoch begrenzt, um die Einfachheit der Nutzung, Geschwindigkeit und umfangreichen Dynamikbereich des Spektrometers ist geeignet, wenn Probe reichlich ist.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory wipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23250</td><td>Reducing agent compatible</td></tr><tr><td>PR-1 Reconditioning Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

Traditionelle Spektrophotometrie erfordert Platzierung Proben in Küvetten oder Kapillaren. Dies ist oft unpraktisch aufgrund der begrenzten Probenmengen oft für Protein-Analyse verwendet. Die Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spektrophotometer löst dieses Problem mit einer innovativen Probenretention System, das Mikrovolumens Proben hält zwischen zwei Messflächen mit der Oberflächenspannung von Flüssigkeiten, wodurch die Quantifizierung von Proben in Mengen so gering wie 0,5-2 ul. Die Beseitigung von Küvetten oder Kapillaren ermöglicht Echtzeit Veränderungen in Weglänge, die die Messung der Zeit verringert, während eine starke Erhöhung der Dynamik von Protein-Konzentrationen, die gemessen werden kann. Die Notwendigkeit für Verdünnungen ist ebenfalls eliminiert, und die Vorbereitungen für die Probe quantifiziert sind relativ einfach, da die Messung Oberflächen können einfach mit Labor wischen abgewischt werden. Dieses Video Artikel stellt Änderungen an traditionellen Proteinkonzentration Bestimmungsmethoden für die Quantifizierung der Mikrovolumens Mengen an Protein mit A280 Absorptionswerte oder der BCA Farbtestverfahren.

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Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Mikrovolumen Proben werden mit einem Spektrophotometer, das natürliche Oberflächenspannung verwendet, um Proben ohne den Einsatz von Küvetten oder Kapillaren behalten quantifiziert. Der dynamische Bereich des Protein-Konzentrationen und die Geschwindigkeit, mit denen sie gemessen werden können, sind stark mit dieser Methode erhöht.

Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem NanoDrop 2000c Spektrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

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microvolume-protein-concentration-determination-using-nanodrop-2000c

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

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Serie: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

Zählen Proteine in einzelne Zellen mit adressierbaren Tröpfchen Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Forschung

Krebsforschung

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

Standards für die quantitative Metalloproteomic Analyse mit Größenausschluss-ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

Chemie

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Biotechnik

UV-Vis Spectroscopic Characterization of Nanomaterials in Aqueous Media

The physicochemical characterization of nanomaterials (NMs) is often an analytical challenge, due to their small size (at least one dimension in the nanoscale, i.e. 1&#8211;100 nm), dynamic nature, and diverse properties. At the same time, reliable and repeatable characterization is paramount to ensure safety and quality in the manufacturing of NM-bearing products. There are several methods available to monitor and achieve reliable measurement of nanoscale-related properties, one example of which is Ultraviolet-Visible Spectroscopy (UV-Vis). This is a well-established, simple, and inexpensive technique that provides non-invasive and fast real-time screening evaluation of NM size, concentration, and aggregation state. Such features make UV-Vis an ideal methodology to assess the proficiency testing schemes (PTS) of a validated standard operating procedure (SOP) intended to evaluate the performance and reproducibility of a characterization method. In this paper, the PTS of six partner laboratories from the H2020 project ACEnano were assessed through an interlaboratory comparison (ILC). Standard gold (Au) colloid suspensions of different sizes (ranging 5&#8211;100 nm) were characterized by UV-Vis at the different institutions to develop an implementable and robust protocol for NM size characterization.

This study presents the benchmarking results for an interlaboratory comparison (ILC) designed to test the standard operating procedure (SOP) developed for gold (Au) colloid dispersions characterized by ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), amongst six partners from the H2020 ACEnano project for sample preparation, measurement, and analysis of the results.

UV-Vis Spektroskopische Charakterisierung von Nanomaterialien in wässrigen Medien

The physicochemical characterization of nanomaterials (NMs) is often an analytical challenge, due to their small size (at least one dimension in the ...

Ingenieurwesen

Erweiterung des Konzentrationsbereichs der Massenphotometrie-Analyse mit Mikrofluidik

Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without labels. Mass photometry is generally suited to analyzing samples in the 100 pM-100 nM concentration range. However, in many biological systems, it is necessary to measure more concentrated samples to study low-affinity or transient interactions. Here, we demonstrate a method that effectively expands the range of sample concentrations that can be analyzed by mass photometry from nanomolar to tens of micromolar. 
In this protocol, mass photometry is combined with a novel microfluidics system to investigate the formation of protein complexes in solution in the micromolar concentration range. With the microfluidics system, users can maintain a sample at a desired higher concentration followed by dilution to the nanomolar range - several milliseconds prior to the mass photometry measurement. Due to the speed of the dilution, data is obtained before the equilibrium of the sample has shifted (i.e., dissociation of the complex). 
The technique is applied to measure interactions between an immunoglobulin G (IgG) antibody and the neonatal Fc receptor, showing the formation of high-order complexes that were not quantifiable with static mass photometry measurements. 
In conclusion, the combination of mass photometry and microfluidics makes it possible to characterize samples in the micromolar concentration range and is proficient in measuring biomolecular interactions with weaker affinities. These capabilities can be applied in a range of contexts - including the development and design of biotherapeutics - enabling thorough characterization of diverse protein-protein interactions.

Autor im Rampenlicht: Charakterisierung von Proteininteraktionen mit geringer Affinität in Lösung mit der MassFluidix-Technologie

This protocol combines mass photometry with a novel microfluidics system to investigate low-affinity protein-protein interactions. This approach is based on the rapid dilution of highly concentrated complexes in solution, which enables low-affinity measurements and broadens the applicability of mass photometry.

Analyse der Proteinkomplexbildung bei mikromolaren Konzentrationen durch Kopplung von Mikrofluidik und Massenphotometrie

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without ...

Biochemie

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Biologie

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually untranslated &#8212; first exons. Bcrp1 (Abcg2), the murine orthologue of the ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), has at least four alternative promoters that are designated by the corresponding four alternative first exons produced: E1U, E1A, E1B, and E1C. Herein, in-silico protocols are presented to predict alternative promoter usage for Bcrp1. Furthermore, reporter assay methods are described to produce reporter constructs for alternative promoters and to determine the functionality of putative promoters upstream of the alternative first exons that are identified.

With the murine ABC transporter Bcrp1 (Abcg2) as an example, in-silico protocols are presented to detect alternative promoter usage in genes expressed in mouse tissues, and to evaluate the functionality of the alternative promoters identified using reporter assays.

Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem NanoDrop 2000c Spektrophotometer

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Kapitel in diesem Video

Zählen Proteine in einzelne Zellen mit adressierbaren Tröpfchen Microarrays

Standards für die quantitative Metalloproteomic Analyse mit Größenausschluss-ICP-MS

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

UV-Vis Spektroskopische Charakterisierung von Nanomaterialien in wässrigen Medien

Analyse der Proteinkomplexbildung bei mikromolaren Konzentrationen durch Kopplung von Mikrofluidik und Massenphotometrie

Analyse der Proteinkomplexbildung bei mikromolaren Konzentrationen durch Kopplung von Mikrofluidik und Massenphotometrie

Analyse der Proteinkomplexbildung bei mikromolaren Konzentrationen durch Kopplung von Mikrofluidik und Massenphotometrie

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer

Methoden Alternative Promoter Verwendung und Transkriptions-Verordnung von Murine Bcrp1 zu entdecken