Name: nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids
Uploaded: 2010-11-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
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Richard W. Beringer und David L. Ash, Applications Wissenschaftler, Thermo Scientific NanoDrop Produkte, für die technische Unterstützung und Filmen.

1. Mikrovolumen Nucleic Acid Quantifizierung Mit einem NanoDrop 2000c Spektrophotometer <ol><li> Um zu beginnen, reinigen Sie den oberen und unteren optischen Oberflächen der Mikrovolumens Spektralphotometer Probe Rückhaltesystem durch Pipettieren von 2 bis 3 ul von sauberem VE-Wasser auf die untere optische Oberfläche. </li><li> Schließen Sie den Hebelarm, sicherzustellen, dass die obere Podest in Kontakt mit dem VE-Wasser kommt. Heben Sie den Hebelarm und wischen Sie die beiden optischen Oberflächen mit einem sauberen, trockenen, fusselfreien Tuch Labor. </li><li> Öffnen Sie die NanoDrop Software und wählen Sie die Nukleinsäure-Anwendung. Verwenden Sie einen kleinvolumigen, kalibrierte Pipette, um eine leere Messung durch den Verzicht auf 1 ul des Puffers auf die untere optische Oberfläche durchzuführen. Senken Sie den Hebel, und wählen Sie &quot;Blank&quot; in der Nukleinsäure-Anwendung. </li><li> Sobald die Blank-Messung abgeschlossen ist, reinigen Sie beide optischen Oberflächen mit einem sauberen, trockenen, fusselfreien Tuch Labor. </li><li> Wählen Sie die entsprechende Konstante für die Probe, die gemessen werden soll. <table border="1"><tbody><tr><td> Sample Type </td><td> Wählen Sie die Option </td><td> Konstante, mit der Konzentration berechnen </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Brauch </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Typische Nukleinsäure Konzentrationsbereiche für direkte A280 Absorptionsmessungen mit einem NanoDrop Mikrovolumens Spektralphotometer, einem traditionellen Küvette-based-Spektralphotometer mit einem TrayCell Mikrozelle Küvette verwendet, und ein Mikrovolumens NanoDrop fluorospectrometer in Verbindung mit dem PicoGreen Assay. </li><li> Dispense 1 ul der Nukleinsäure-Probe auf die geringere optische Sockel und schließen Sie den Hebelarm. Da die Messung Volumen unabhängig, die Probe muss nur die Kluft zwischen den beiden optischen Oberflächen für eine Messung vorgenommen werden überbrücken. </li><li> Wählen Sie &quot;Messen&quot; in der Anwendungssoftware. Die Software berechnet automatisch die Nukleinsäure-Konzentration und Reinheit Verhältnisse. Nach Probenmessung, überprüfen Sie die spektrale Leistung. </li><li> Die Software berechnet automatisch die Nukleinsäure-Konzentration und Reinheit Verhältnisse. Nach Probenmessung, überprüfen Sie die spektrale Bild auf Probe Qualität zu beurteilen. </li><li> Ein typisches Nukleinsäureprobe haben ein sehr charakteristisches Profil. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Ein typisches Nukleinsäureprobe haben ein sehr charakteristisches Profil. </li><li> Häufige Quellen von Verunreinigungen mit spezifischen Nukleinsäure-Isolierung-Verfahren sind die Phenol / Trizol und Spalte Extraktion. Im Falle von Phenol / Trizol-Extraktion, können Rest-Reagenz Kontamination durch abnorme Spektren zwischen 220 bis 240 nm sowie durch Verschiebungen in der 260-280 nm-Bereich angegeben werden. Umgekehrt kann Rest-Guanidin aus Spalte Extraktion auf einen Spitzenwert in der Nähe 230 nm und eine Verschiebung in den Trog von 230 nm bis etwa 240 nm beitragen. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die Verschiebungen in den Höhen und Tiefen der Proben B und C im Vergleich zu Probe A zeigen, wie Verunreinigungen können die Spektren von Nukleinsäure-Proben beeinflussen. </li><li> Um genau zu beurteilen Probe Qualität, sollte 260/280 oder 260/230 Verhältnisse in Verbindung mit der tonalen Qualität analysiert werden. Reine Nukleinsäuren typischerweise ergeben eine 260/280 Ratio von etwa 1,8 und einem 260/280 Ratio von ~ 2,0 für DNA und RNA, bzw.. Dieses Verhältnis ist abhängig vom pH-Wert und Ionenstärke des Puffers verwendet, um den Leerwert und Probe-Messungen zu machen. Saure Lösungen werden unter-stellen das Verhältnis um 0,2-0,3, während einer basischen Lösung wird über-stellen das Verhältnis um 0,2-0,3. Signifikant verschieden Reinheit Verhältnisse können auf das Vorhandensein von Protein-, Phenol-oder andere Verunreinigungen, die stark absorbieren bei oder nahe bei 280 nm. Die 260/230 Reinheit Verhältnis ist eine zweite Maßnahme der DNA-Reinheit mit den Werten für eine &quot;reine&quot; Nukleinsäure üblicherweise im Bereich von 1,8-2,2. Purity-Verhältnisse, die deutlich niedriger als die erwarteten Werte sind möglicherweise für die Isolierung verwendete Technik kann weiter optimiert werden müssen. </li><li> NanoDrop Spektralphotometer kann auch verwendet werden, um Proteine ​​durch direkte Absorption oder durch Protein kolorimetrischen Assays quantifizieren. Um eine ordnungsgemäße Spalte Bildung und Reproduzierbarkeit, sind 2-ul-Proben für Protein-Proben empfohlen. Beachten Sie die folgenden JoVE Video: Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung Mit dem NanoDrop Spektralphotometer <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/index/Details.stp?ID=1610">https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol><ol><li> Um zu demonstrieren, mit hoher Empfindlichkeit Mikrovolumens Nukleinsäure Quantifizierung mit dem NanoDrop 3300, ist ein PicoGreen Fluoreszenz-Kit verwendet. Um zu beginnen, äquilibrieren dem Kit-Standards und aller Nukleinsäure-Proben auf Raumtemperatur. Fluoreszierende Proben sind lichtempfindlich und sollte in Bernstein oder Aluminium verpackt Röhren gehalten werden. </li><li> Bereiten Sie genug 1x TE-Puffer für alle Standards und Proben sowie für die PicoGreen funktionierende Lösung, die benötigt werden, gemessen werden. Bereiten 1xTE Puffer durch Verdünnen der bereitgestellten 20x TE-Puffer mit Nuklease-freiem Wasser pro Protokoll des Herstellers. Reaction Volumes können aus 200 ul, so wenig wie 10 ul-Bereich. In diesem Beispiel werden 10 ul Reaktionsvolumen vorbereitet werden. </li><li> Bereiten seriell verdünnt dsDNA-Standards bei 2x die endgültige gewünschte Konzentration in Nuklease-freies Fläschchen oder Tuben. Transfer-5 ul der verdünnten dsDNA-Standards in einen einzelnen markierten Nuklease-freies Bernstein oder Folie abgedeckten Röhre. </li><li> Aliquot 5 ul jeder dsDNA Probe von Interesse in entsprechend gekennzeichneten Nuklease-freies Bernstein oder Folie abgedeckten Rohre. </li><li> Bereiten PicoGreen funktionierende Lösung nach dem Protokoll des Herstellers. Übertragung der gleichen Menge des PicoGreen funktionierende Lösung in jedes Röhrchen, die entweder eine Standard-oder Probe von Interesse (5 ul in diesem Beispiel). </li><li> Die gleiche Menge 1x TE-Puffer und PicoGreen funktionierende Lösung, die negative Kontrolle, die als Referenz-Lösung dient vorzubereiten. </li><li> Mischen Sie die Inhalte der einzelnen Reaktionsgefäß durch leichtes Pipettieren und inkubieren Sie die Reaktionen bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Alle Standards und Proben sollten äquilibriert auf die gleiche Temperatur vor der Messung der Fluoreszenz-Signal von der Temperatur beeinflusst wird. </li><li> Zur Vorbereitung der Instrumente und Messungen durchführen, zuerst reinigen Sie den unteren und oberen Flächen der Probe Rückhaltesystem. Pipettieren von 2 bis 3 ul entionisiertem Wasser auf die untere optische Oberfläche, in der Nähe öffnen Sie dann den Hebelarm, und tupfen Sie den oberen und unteren Sockel mit einem sauberen, fusselfreien, wischen Labor. Sicherstellen, dass die Oberflächen sind frei von Flusen, bevor Sie fortfahren wie Flusen weisen in Gegenwart von einer Anregungsquelle Fluoreszenz und kann die Messung stören. </li><li> Öffnen Sie den Geräte-Software, wählen Sie die &quot;Nukleinsäuren&quot; Anwendung, und wählen Sie die &quot;PicoGreen-dsDNA&quot;-Option. </li><li> Um leere das Instrument, fügen Sie 2 &amp;mgr; l 1x TE auf den unteren Sockel, in der Nähe der Arm, und wählen Sie &quot;Blank&quot; in das Instrument Software-Bereich. Einmal leer abgeschlossen ist, abtupfen der Blindprobelösung von beiden Oberflächen der Probe Rückhaltesystem. </li><li> Mix der Referenz-Lösung durch vorsichtiges Pipettieren. Mit geringer Retention, Pipette 2 ul auf den unteren Sockel und schließen Sie den Arm. </li><li> Wählen Sie &quot;Referenz&quot; in die Messung ein, und wählen Sie die gewünschten Einheiten. Klicken Sie auf &quot;Messen&quot; der Messzyklus zu initiieren. </li><li> Wenn der Messzyklus abgeschlossen ist, öffnen Sie den Arm und gründlich abtupfen der Probe Rückhaltesystem Oberflächen. Distanzen bis zu fünf Wiederholungen der Referenz, mit einem frischen Aliquot für jede Wiederholung. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für die weiteren Standards, um eine Standardkurve zu erstellen. Bis zu sieben Standards verwendet werden. Die Software wurde entwickelt, um bis zu fünf Wiederholungen für jede Norm. Repliziert der Standards werden gemittelt, um eine Standardkurve aus dem die Probe Konzentrationen automatisch ermittelt werden zu generieren. </li><li> Sobald der Standard-Kurve abgeschlossen ist, wählen Sie die &quot;Samples&quot; Registerkarte, geben Sie die jeweilige Probe-ID-Informationen und messen jede unbekannte Probe. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity.">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li><li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Quantification+of+Nucleic+Acids:+LabelGuard+enables+photometric+quantification+of+submicroliter+samples+using+a+standard+photometer.">Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer.</a> Implen Applications Note. , (2006).</li><li>Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).</li><li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA.">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li></ol>

Philippe Desjardins und Debra Conklin von Thermo Scientific NanoDrop Products, Inc, dass die Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert beschäftigt.

Die Quantifizierung Protokolle hier präsentiert werden, auf die am meisten akzeptierte Mikrovolumens Systemen. Derartige Systeme bieten eine praktische Alternative für traditionelle Nukleinsäure Quantifizierung Methodik, die auf größere Probenvolumina und den Einsatz von Containment-Apparat angewiesen. NanoDrop Mikrovolumens Technologie verwendet eine Probe Rückhaltesystem, das auf die Oberflächenspannung Eigenschaften der Probe gemessen, um eine Flüssigkeitssäule Form setzt. Es ist wichtig, dass die Probe Kontakt mit dem oberen und unteren optische Messung Flächen für die richtige Spalte Bildung. Wenn zu irgendeinem Zeitpunkt die Messergebnisse ungenau oder nicht reproduzierbar scheint, ist es sehr wahrscheinlich das Ergebnis der Probe Heterogenität oder Flüssigkeitssäule Bruch. Wasch-und Isopropylalkohol werden nicht empfohlen, Reinigungsmittel, da sie das Podest Messflächen kann bedingungslos. Eine unbedingte Podest tritt auf, wenn die hydrophobe Oberfläche Eigenschaften des Sockels kompromittiert wurden, was zu einer Abflachung der Probe Tropfen. Unconditioned Sockel kann zum Bruch der Flüssigkeitssäule während der Messung führen. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Unconditioned Oberfläche wird durch eine Abflachung eines Wassertropfens aus. Uncondtioned Sockel Oberflächen können überholt mit NanoDrop Pedestal Überholung Compound (PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Products) werden. Eine dünne Schicht der Wiederaufbereitung Verbindung der oberen und unteren Sockel Oberflächen, dürfen für ~ 30 Sekunden trocken angewendet wird, dann abgerieben mit einem sauberen, trockenen, fusselfreien Tuch Labor. Ein erfolgreich überholt Zustand wird durch einen Wassertropfen Sicken auf, wenn auf den Boden Sockel Oberfläche aufgebracht wird. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Ein erneuerter Oberfläche wird durch eine Sicke bis eines Wassertropfens aus. Mikrovolumen Quantifizierung Systemen erheblich reduzieren Probe Verbrauch und einem dramatischen Anstieg der Konzentrationsbereich, wenn zu traditionellen Quantifizierung Systeme verglichen. Obwohl Mikrovolumens Quantifizierung ist oft eine grundlegende Technologie für bestimmte Umstände wie begrenzt Zellmasse wie Nadel-Biopsien und Laser-Mikrodissektion, die Effizienz und Einfachheit der Anwendung dieser Methode hat es eine weithin akzeptierte Alternative zu herkömmlichen Nukleinsäure Quantifizierung Methoden werden auch wenn Probe ist reichlich.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

Biomolekulare Analysen werden kontinuierlich weiterentwickelt, dass die Verwendung immer kleiner Mengen von Material, oft entgegensteht, die Verwendung von konventionellen Küvette Instrumente für Nukleinsäure-Quantifizierung für diejenigen, die Mikrovolumens Quantifizierung durchführen können. Die NanoDrop Mikrovolumens Probenretention System (Thermo Scientific NanoDrop Products)-Funktionen durch die Kombination von LWL-Technik und natürliche Oberflächenspannung Eigenschaften zu erfassen und zu behalten winzige Mengen der Probe unabhängig von traditionellen Containment Geräte wie Küvetten oder Kapillaren. Darüber hinaus verwendet das System kürzere Weglängen, die sich in einer breiten Palette von Nukleinsäure-Konzentration Messungen im Wesentlichen entfällt die Notwendigkeit, Verdünnungen durchzuführen. Verringerung des Volumens der Probe für die spektroskopische Analyse erforderlich erleichtert auch die Aufnahme von zusätzlichen Qualitätskontrolle Schritten über viele molekulare Abläufe, Steigerung der Effizienz und letztlich zu mehr Vertrauen in nachgelagerten Ergebnisse. Die Notwendigkeit hoher Empfindlichkeit fluoreszierender Analyse der begrenzten Masse hat auch mit den jüngsten experimentellen Fortschritte hervor. Mit der gleichen Mikrovolumens Probenretention Technologie kann Fluoreszenz-Messungen mit 2 ul des Materials durchgeführt werden, so dass Fluoreszenzassays Volumen Anforderungen deutlich reduziert werden. Solche Mikroreaktionen von 10 ul oder weniger sind jetzt möglich mit einem dedizierten Mikrovolumens fluorospectrometer. Zwei Mikrovolumens Nukleinsäure Quantifizierung Protokolle zeigten, dass die Verwendung integrierter Probe Rückhaltesysteme als praktische Alternative zu herkömmlichen Küvetten-basierte Protokolle werden. Zunächst wird eine direkte A260 Absorption unter Verwendung eines Mikrovolumens Spektralphotometer beschrieben. Dies wird durch eine Demonstration eines Fluoreszenz-basierten Verfahren, das mit reduziertem Volumen Fluoreszenz Reaktionen ermöglicht mit einem Mikrovolumens fluorospectrometer gefolgt. Diese neuen Techniken ermöglichen die Beurteilung von Nukleinsäure-Konzentrationen von 1 pg / ul bis 15.000 ng / ul mit minimalem Verbrauch der Probe.

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NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Die Verwendung von NanoDrop Mikrovolumens Systeme als praktische und effiziente Alternative zu herkömmlichen Nukleinsäure Quantifizierung Methodik ist durch die Demonstration von zwei Mikrovolumens Nukleinsäure Quantifizierung Protokollen beschrieben.

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Serie: NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Methylierte DNA Immunpräzipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Forschung

Biologie

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem NanoDrop 2000c Spektrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Biotechnik

<meta charset="utf8"></head><body>Präzisions-DNAzyme-Nanomaschinen für die diskriminative RNA- und DNA-Analyse

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei DNA-Nanosensoren – Bewältigung der Herausforderungen bei Empfindlichkeit und Selektivität beim molekularen Nachweis

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

Biochemie

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

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Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Methylierte DNA Immunpräzipitation

Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem NanoDrop 2000c Spektrophotometer

Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays