I. Il NanoDrop 2000c spettrofotometro NanoDrop tecnologia si basa su un innovativo sistema di ritenzione di esempio che utilizza la tensione superficiale di tenere e misurare campioni microvolumi tra due piedistalli ottico senza l&#39;uso di cuvette o capillari. Il NanoDrop 2000c spettrofotometro utilizza questa tecnologia per misurare rapidamente e facilmente 0,5-2 ml di gocce proteine, DNA, RNA, e altre biomolecole. Questa capacità è diventato sempre più importante come si evolvono continuamente le tecniche molecolari di utilizzare piccole quantità di materiale per l&#39;analisi. L&#39;ideale spettrofotometro microvolumi per le condizioni in cui è limitato campione. Tuttavia, la facilità d&#39;uso, ciclo di misura veloce e, e gamma di concentrazione estesa anche fare lo spettrofotometro adatto quando grandi quantità di campione sono disponibili. Il ciclo di misura è inoltre notevolmente ridotto, aiutando gli scienziati aumentare l&#39;efficienza per tutta la loro flussi di lavoro. Il microsample è posizionato direttamente sulla parte superiore della superficie di rilevamento e una colonna di liquido si crea tra le estremità delle fibre ottiche dalla tensione superficiale. Questa colonna liquida forma un percorso verticale ottico. Una lampada flash allo xeno fornisce la fonte di luce e uno spettrometro utilizza un CCD lineare viene utilizzato per analizzare la luce che passa attraverso il campione. Rimozione dei dispositivi di contenimento tradizionali come cuvette dal sistema presenta diversi vantaggi: piccole quantità di campione sono necessari per la misura, la pulizia richiede semplicemente strofinando le superfici ottiche con un laboratorio pulire, e la lunghezza del percorso può essere modificato in tempo reale durante la misurazione. Il 2000c NanoDrop determina la lunghezza ottimale percorso automaticamente (1 mm a 0,05 mm), fornendo la più ampia gamma di misure possibili concentrazione proteica senza diluizioni. Accorciando la lunghezza del percorso, più alte concentrazioni di proteine ​​può essere misurata. Questo rimuove efficacemente la necessità di effettuare diluizioni dei campioni più proteine. Ad esempio, il 2000c NanoDrop in grado di misurare le concentrazioni di BSA alto come 400 mg / ml. Il NanoDrop 2000c spettrofotometro è uno spettrofotometro spettro per misurare la densità ottica di DNA, RNA, proteine ​​e altre biomolecole. Questo protocollo video sarà incentrato sulla misurazione delle proteine. II. Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​Utilizzando A280 Misure Assorbanza a. Principio di A280 Misure Il metodo A280 proteina è applicabile a proteine ​​purificate che contengono triptofano, tirosina, fenilalanina o residui di cisteina-cisteina legami disolfuro e assorbanza esporre a 280 nm. Questo metodo utilizza il valore di assorbanza A280 in combinazione con il coefficiente di estinzione di massa o il coefficiente di estinzione molare per calcolare la concentrazione della proteina purificata. Il vantaggio di diretto A280 misure è che la generazione di una curva standard non è necessario per determinare la concentrazione di proteine. Se il campione è una soluzione proteica non caratterizzato, lisato cellulare, o l&#39;estratto di proteina grezza, quindi utilizzando uno dei metodi colorimetrici preconfigurato disponibile sul 2000/2000c NanoDrop, come ad esempio BCA, Pierce 660 nm, Bradford, Lowry e saggi, è raccomandata. b. Microvolumi Proteine ​​A280 Misure - Avvio <ol><li> Selezionare l&#39;applicazione A280 proteine ​​dal menu principale. </li><li> Seleziona il tipo di campione da misurare dal menu a discesa. L&#39;impostazione predefinita è consigliata per la maggior parte delle miscele di proteine ​​sconosciute in cui 1 Abs = 1 mg / mL. Se misura una proteina precedentemente caratterizzata purificata, allora o il coefficiente di estinzione di massa o coefficiente di estinzione molare e peso molecolare possono essere inseriti per determinare la concentrazione di proteine ​​più preciso. </li><li> Scegliere l&#39;unità di concentrazione dal menu a discesa. </li></ol> c. Microvolumi Proteine ​​Misure A280 - Blanking <ol><li> Stabilire il bianco con un buffer adeguato. E &#39;importante utilizzare il buffer in cui viene sospesa la proteina. Il buffer utilizzato deve essere lo stesso pH e di una forza simile ionica come la soluzione del campione. Nota: buffer RIPA contribuire assorbanza troppo a 280 nm e sono quindi incompatibili con le misure dirette proteine ​​A280. Per le proteine ​​sospese in un buffer RIPA, si consiglia di concentrazione proteica essere determinata usando un test tampone compatibile RIPA colorimetriche. </li><li> Pipettare 2 ml di soluzione appropriata di chiusura sul piedistallo in basso, abbassare il braccio e fare clic su Vuoto. </li><li> Pulire la soluzione del bianco dal piedistalli inferiore e superiore con un laboratorio panno asciutto. </li></ol> d. Microvolumi Proteine ​​Misure A280 di misura Considerazioni importanti: L&#39;omogeneità del campione è estremamenteimportante, in quanto tale un piccolo volume che viene misurato. Per garantire che i campioni siano omogenei, mescolare delicatamente ma accuratamente i campioni immediatamente prima di assumere una aliquota per la misurazione. Evitare l&#39;introduzione di bolle durante la miscelazione e pipettaggio. A causa della variabilità della tensione superficiale tra le diverse proteine, si consiglia di carico 2 ml di campioni per assicurare un&#39;adeguata formazione colonna. Utilizzare sempre bassi puntali di ritenzione. Per caricare un campione, toccare la punta della pipetta sulla superficie inferiore piedistallo ottica mentre espellere la soluzione per evitare che la soluzione di aderire alla parte esterna della punta della pipetta. Espellere inferiore all&#39;importo totale del campione per evitare scoppio e l&#39;introduzione di bolle nel campione. <ol><li> Immettere un ID campione nel campo appropriato, carico 2 l di primo campione come descritto per la Misura vuoto e fare clic. Una nuova aliquota 2μL del campione dovrebbe essere utilizzato per ogni misura. </li><li> Rimuovere il campione dal piedistalli inferiore e superiore con un laboratorio panno asciutto. </li></ol> e. Microvolumi Proteine ​​A280 Misure di pulizia Un normale e privo di lanugine, pulire laboratorio è spesso sufficiente per pulire i piedistalli ottica tra le misurazioni. f. Fare Proteine ​​A280 Misure Ricondizionamento Soluzioni e reagenti contenenti tensioattivi può uncondition le superfici di misura piedistallo nel corso del tempo, impedendo la colonna di liquido campione di forma. Un appiattimento della goccia sul piedistallo più basso è indicativo della superficie ottica diventa incondizionato. Se le proprietà di superficie sono stati compromessi, ricondizionamento i piedistalli è importante garantire colonna formazione del campione. In questo caso, lucidare le superfici ottiche con forza usando laboratorio pulire o utilizzare Compound NanoDrop piedistallo Ricondizionamento (PR-1) come indicato. III. Microvolumi Concentrazione Determinazione proteine ​​mediante test colorimetrici a. Principio di rilevamento colorimetrico Lo spettrofotometro NanoDrop 2000c può essere utilizzato anche per misurare soluzioni di proteine ​​non caratterizzato, lisati di cellule, proteine ​​ed estratti grezzi mediante test colorimetrici. Metodi colorimetrici sono metodi indiretti che richiedono l&#39;interazione di una tintura con la componente proteica del campione per la produzione di un nuovo complesso che assorbe la luce nella gamma di lunghezze d&#39;onda visibili. Lo spettrofotometro NanoDrop 2000c ha diversi test colorimetrici pre-configurati tra cui BCA, Pierce 660, Bradford, Lowry e metodi. Il test BCA sarà dimostrato come un test colorimetrico esempio utilizzando uno spettrofotometro microvolumi. (Screenshot) L&#39;(acido Bicinchoninic) BCA test è un metodo comune colorimetrico spesso utilizzato per soluzioni di proteine ​​diluite e proteine ​​in presenza di componenti che sono significativi UV (280 nm) assorbanza. A differenza del metodo A280 proteine, il metodo BCA Protein richiede che una curva standard essere generato prima di concentrazioni di proteine ​​del campione può essere misurata. Il metodo utilizza acido bicinchoninic (BCA) come reagenti di rilevamento. Il Cu-BCA chelato formano in presenza di proteine ​​è misurata a 562 nm e normalizzato a 750 nm. b. Microvolumi BCA saggio Misure BCA saggio Preparazione <ol><li> I reagenti necessari sono contenuti nel kit riducente compatibile (Thermo Scientific gatto Pierce non 23250..): Reagente BCA A, B reagente BCA, reagente compatibilità, buffer di ricostituzione, e albumina (BSA) standard. </li><li> Equilibrare tutte le proteine ​​sconosciute e gli standard di proteine ​​a temperatura ambiente e mescolare accuratamente. </li><li> Preparare abbastanza fresca reagente di lavoro per gli standard ed i campioni da misurare con un rapporto di 50:1 di reagente A: B </li><li> Per l&#39;analisi micro, utilizzare un rapporto 1:1 di reagente di lavoro a campione. Aggiungere 10 ml di reagente di lavoro a ciascuna provetta con tubi sufficiente a coprire tutti i campioni e standard. Per l&#39;alta gamma test, utilizzare un rapporto di 20:01 di reagente di lavoro a campione. Aggiungere 190 ml di reagente di lavoro a ciascuna provetta con tubi sufficiente a coprire tutti i campioni e standard. Fare riferimento alla BCA Pierce corredo della documentazione per stabilire quale rapporto è adatto per i vostri campioni. </li><li> Aggiungere 10 ml di standard o campione per ciascun tubo contenente reagente. Mescolate bene delicatamente vortex. </li><li> Incubare le provette a 37 ° C per 30 minuti. </li><li> Lasciare le reazioni a temperatura ambiente (~ 10 minuti). </li></ol> c. Microvolumi Misure saggio BCA Generazione Curva Standard <ol><li> Selezionare il metodo BCA Protein dal menu principale. Se la finestra di verifica lunghezza d&#39;onda appare, assicurarsi che il braccio è basso. </li><li> Immettere i valori per ogni concentrazione standard nella tabella riquadro di destra. Il software permette di riferimento e fino a 7 additstandard ionale. Il riferimento e / o norme devono essere misurate in replica. Nota: Il requisito minimo per la generazione di curva standard è la misura di due standard o la misura del riferimento zero e almeno uno standard. Si raccomanda che gli standard aggiuntivi essere inclusi come necessario per coprire il previsto intervallo di concentrazione test. </li><li> Stabilire un vuoto. Il vuoto per test colorimetrici è generalmente deionizzata H 2 O. </li><li> Pipettare 2 ml di dH 2 O sul piedistallo in basso, abbassare il braccio e fare clic su Vuoto. Solo un vuoto necessario per coprire tutte le successive misurazioni di riferimento e standard. </li><li> Stabilire il riferimento pipettando un&#39;aliquota di 2 microlitri contenente solo reagente di lavoro e di buffer con nessuna proteina sul piedistallo più basso. Abbassare il braccio e Misura clic. </li><li> Nella scheda standard, evidenziare lo standard desiderato e Pipettare 2 ml di standard desiderato sul piedistallo più basso. Abbassare il braccio e Misura clic. Ripetere la procedura per tutte le norme. Assicurati di misurare tutti gli standard prima di campioni di misura. Per visualizzare curva standard fare clic su Visualizza Curva Standard. </li></ol> d. Microvolumi Misure Assay BCA 2 Misure proteine ​​microlitri <ol><li> Dopo tutti gli standard sono stati misurati, fare clic sul pulsante Campioni. Inserire l&#39;ID del campione. Carico 2 l di campione sul piedistallo più basso e fare clic su Misura. Una nuova aliquota 2 l di campione deve essere utilizzato per ogni misurazione. </li><li> Pulire il campione dal piedistalli inferiore e superiore con un laboratorio panno asciutto. </li></ol> e. Microvolumi Misure di analisi BCA di pulizia e ricondizionamento Effettuare la pulizia e ricondizionamento, come descritto nella diretto A280 misurazioni dell&#39;assorbanza. Rappresentante dei risultati: Determinazione delle proteine ​​microvolumi concentrazione è effettuata sia da un diretto A280 misura o un saggio colorimetrico indiretto. L&#39;A280 esempio di misura determina la concentrazione di proteine ​​in base al coefficiente di estinzione della proteina di interesse. Il test colorimetrico BCA esempio determina la concentrazione di proteine ​​a base di una curva standard di concentrazioni di proteina nota.

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	<li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+by+UV+absorption.">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels.">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li><li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. u. j. i. m. o. t. o., Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li></ol>

Gli autori sono dipendenti di Thermo Fisher Scientific che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Quantificazione microvolumi utilizza le proprietà intrinseche tensione superficiale di un campione a formare una colonna di liquido tra due superfici di misura. L&#39;assenza di un dispositivo di contenimento, la lunghezza del percorso permette di modificare in tempo reale, essenzialmente eliminando la necessità di eseguire diluizioni. Questa capacità aumenta notevolmente la gamma dinamica delle concentrazioni di proteine, nonché la velocità di misura. Utilizzando quantità minime di campione, un gran numero di campioni possono essere analizzati rapidamente e con precisione, permettendo agli scienziati di prendere più misure e ottenere il controllo di qualità migliore. Inoltre, e, se necessario, i campioni preziosi possono essere recuperati dopo l&#39;assunzione di una misura. Quando questi piccoli volumi vengono misurati, l&#39;omogeneità del campione è estremamente importante per evitare gli errori di campionamento. Bassa puntali di conservazione deve essere sempre usato per i campioni di carico e le punte dovrebbe essere cambiato tra il campione replica. Le superfici piedistallo devono essere puliti e condizionati a garantire i risultati più accurati. Infine, lo spettrofotometro microvolumi è ideale quando campione è limitato, tuttavia, la facilità d&#39;uso, velocità e ampia gamma dinamica dello spettrometro lo rendono adatto campione quando è abbondante.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory wipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23250</td><td>Reducing agent compatible</td></tr><tr><td>PR-1 Reconditioning Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

Spettrofotometria tradizionale richiede ponendo i campioni in cuvette o capillari. Questo è spesso impraticabile a causa del volume campione limitato spesso utilizzati per l&#39;analisi delle proteine. La Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spettrofotometro risolve questo problema con un innovativo sistema di ritenzione del campione che tiene campioni microvolumi tra due superfici di misura utilizzando le proprietà di tensione superficiale dei liquidi, consentendo la quantificazione di campioni in volumi più bassi 0,5-2 microlitri. L&#39;eliminazione di cuvette o capillari consente di modificare in tempo reale lunghezza del percorso, che riduce il tempo di misura mentre aumentando notevolmente la gamma dinamica delle concentrazioni di proteine ​​che possono essere misurati. La necessità di diluizioni è anche eliminata, e preparati per la quantificazione del campione sono relativamente facili come le superfici di misurazione può essere semplicemente cancellato con laboratorio pulire. In questo articolo video presenta le modifiche ai metodi tradizionali di proteine ​​concentrazione determinazione per la quantificazione degli importi microvolumi di proteine ​​utilizzando A280 letture di assorbanza o il saggio colorimetrico BCA.

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Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Campioni microvolumi sono quantificati da un sistema spettrofotometro che utilizza naturale tensione superficiale di conservare i campioni senza l&#39;uso di cuvette o capillari. La gamma dinamica di concentrazioni di proteine ​​e la velocità con cui possono essere misurati sono notevolmente aumentata con questo metodo.

Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

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Research

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Video: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

Proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile Microarrays di conteggio

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

Norme per quantitativa Metalloproteomic analisi utilizzando Size Exclusion ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

Chimica

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Bioingegneria

UV-Vis Spectroscopic Characterization of Nanomaterials in Aqueous Media

The physicochemical characterization of nanomaterials (NMs) is often an analytical challenge, due to their small size (at least one dimension in the nanoscale, i.e. 1&#8211;100 nm), dynamic nature, and diverse properties. At the same time, reliable and repeatable characterization is paramount to ensure safety and quality in the manufacturing of NM-bearing products. There are several methods available to monitor and achieve reliable measurement of nanoscale-related properties, one example of which is Ultraviolet-Visible Spectroscopy (UV-Vis). This is a well-established, simple, and inexpensive technique that provides non-invasive and fast real-time screening evaluation of NM size, concentration, and aggregation state. Such features make UV-Vis an ideal methodology to assess the proficiency testing schemes (PTS) of a validated standard operating procedure (SOP) intended to evaluate the performance and reproducibility of a characterization method. In this paper, the PTS of six partner laboratories from the H2020 project ACEnano were assessed through an interlaboratory comparison (ILC). Standard gold (Au) colloid suspensions of different sizes (ranging 5&#8211;100 nm) were characterized by UV-Vis at the different institutions to develop an implementable and robust protocol for NM size characterization.

This study presents the benchmarking results for an interlaboratory comparison (ILC) designed to test the standard operating procedure (SOP) developed for gold (Au) colloid dispersions characterized by ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), amongst six partners from the H2020 ACEnano project for sample preparation, measurement, and analysis of the results.

Caratterizzazione spettroscopica UV-Vis di nanomateriali in mezzi acquosi

The physicochemical characterization of nanomaterials (NMs) is often an analytical challenge, due to their small size (at least one dimension in the ...

Ingegneria

Ampliamento dell'intervallo di concentrazione dell'analisi della fotometria di massa con la microfluidica

Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without labels. Mass photometry is generally suited to analyzing samples in the 100 pM-100 nM concentration range. However, in many biological systems, it is necessary to measure more concentrated samples to study low-affinity or transient interactions. Here, we demonstrate a method that effectively expands the range of sample concentrations that can be analyzed by mass photometry from nanomolar to tens of micromolar. 
In this protocol, mass photometry is combined with a novel microfluidics system to investigate the formation of protein complexes in solution in the micromolar concentration range. With the microfluidics system, users can maintain a sample at a desired higher concentration followed by dilution to the nanomolar range - several milliseconds prior to the mass photometry measurement. Due to the speed of the dilution, data is obtained before the equilibrium of the sample has shifted (i.e., dissociation of the complex). 
The technique is applied to measure interactions between an immunoglobulin G (IgG) antibody and the neonatal Fc receptor, showing the formation of high-order complexes that were not quantifiable with static mass photometry measurements. 
In conclusion, the combination of mass photometry and microfluidics makes it possible to characterize samples in the micromolar concentration range and is proficient in measuring biomolecular interactions with weaker affinities. These capabilities can be applied in a range of contexts - including the development and design of biotherapeutics - enabling thorough characterization of diverse protein-protein interactions.

Autore in primo piano: Caratterizzazione delle interazioni proteiche a bassa affinità in soluzione utilizzando la tecnologia MassFluidix

This protocol combines mass photometry with a novel microfluidics system to investigate low-affinity protein-protein interactions. This approach is based on the rapid dilution of highly concentrated complexes in solution, which enables low-affinity measurements and broadens the applicability of mass photometry.

Analisi della formazione di complessi proteici a concentrazioni micromolari mediante accoppiamento di microfluidica con fotometria di massa

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without ...

Biochimica

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Biologia

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinazione concentrazione di acidi nucleici e proteine ​​Utilizzando il Micro-volume Bio-spec Spettrofotometro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually untranslated &#8212; first exons. Bcrp1 (Abcg2), the murine orthologue of the ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), has at least four alternative promoters that are designated by the corresponding four alternative first exons produced: E1U, E1A, E1B, and E1C. Herein, in-silico protocols are presented to predict alternative promoter usage for Bcrp1. Furthermore, reporter assay methods are described to produce reporter constructs for alternative promoters and to determine the functionality of putative promoters upstream of the alternative first exons that are identified.

With the murine ABC transporter Bcrp1 (Abcg2) as an example, in-silico protocols are presented to detect alternative promoter usage in genes expressed in mouse tissues, and to evaluate the functionality of the alternative promoters identified using reporter assays.

Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

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Capitoli in questo video

Proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile Microarrays di conteggio

Norme per quantitativa Metalloproteomic analisi utilizzando Size Exclusion ICP-MS

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l'analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Caratterizzazione spettroscopica UV-Vis di nanomateriali in mezzi acquosi

Analisi della formazione di complessi proteici a concentrazioni micromolari mediante accoppiamento di microfluidica con fotometria di massa

Analisi della formazione di complessi proteici a concentrazioni micromolari mediante accoppiamento di microfluidica con fotometria di massa

Analisi della formazione di complessi proteici a concentrazioni micromolari mediante accoppiamento di microfluidica con fotometria di massa

NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

Determinazione concentrazione di acidi nucleici e proteine Utilizzando il Micro-volume Bio-spec Spettrofotometro Nano

I metodi per scoprire alternative Uso Promotore e regolazione trascrizionale di Murine Bcrp1

Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

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Norme per quantitativa Metalloproteomic analisi utilizzando Size Exclusion ICP-MS

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Analisi della formazione di complessi proteici a concentrazioni micromolari mediante accoppiamento di microfluidica con fotometria di massa

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Determinazione concentrazione di acidi nucleici e proteine ​​Utilizzando il Micro-volume Bio-spec Spettrofotometro Nano

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Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

Determinazione concentrazione di acidi nucleici e proteine Utilizzando il Micro-volume Bio-spec Spettrofotometro Nano