用于活组织中发芽血管生成的 离体 机械表征的 2.5D 模型

量化驱动 3D 活组织中发芽血管生成的细胞机制仍然很困难，但对于继续在再生医学领域取得进展是必要的。该协议通过将 2D 定量方法的可访问性与 3D 组织的代表性相结合，使任务更易于执行。现有量化活组织中血管生成发芽过程中细胞力的方法仅限于复杂且计算成本高昂的 3D 力推断。

我们的协议通过将牵引力显微镜应用于 X-vivo 系统，将体外控制与体内相关性联系起来，为时空机械力表征提供了一种易于使用但生理相关的方法。2 Nav-D 模型保留了生理背景，同时允许对细胞力学进行定量分析，提供了一种独特的方法来研究驱动发芽血管生成的机制。首先，将 120 微升结合硅烷溶液移液到玻璃底 12 孔板的每个孔中。

将板在室温下孵育 1 小时。孵育后，使用喷雾瓶用无水乙醇清洗孔 3 次，使用氮气干燥板。将 11.5 微升新鲜制备的聚丙烯酰胺或 PAA 凝胶混合物移液到每个孔的玻璃底部。

轻轻地将 13 毫米的盖玻片放在每个液滴的顶部。聚合后，向孔中加入 PBS。使用弯曲的针头，轻轻松开 PAA 凝胶上的盖玻片。

然后用镊子从孔中取出盖玻片。将 75 微升每毫升 1 毫克的磺胺 sampa 加入 PAA 凝胶中，溶于超纯水中。将板置于 365 纳米紫外线下 5 分钟。

用 PBS 快速冲洗凝胶上的磺胺 sampa。然后用 PBS 洗涤功能化的 PAA 凝胶 2 次，每次 10 分钟。将 50 微升胶原蛋白 4 溶液移液到功能化的 PAA 凝胶上，并在 4 摄氏度下孵育过夜。

第二天，用 PBS 洗涤凝胶 2 次，并让其干燥 5 分钟。在凝胶顶部加入 50 μL 内皮细胞生长或 ECG 培养基。将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 1 小时。

首先，使用无菌手术镊子，将猪颈动脉从含有改良 CREB 溶液的运输瓶转移到装有无菌 PBS 的大培养皿中。使用手术镊子和手术刀去除颈动脉周围的多余组织。使用手术刀从动脉两端切下 2 到 3 厘米，以消除动脉分叉附近的区域。

在细圆尖镊子和手术刀的帮助下，切除颈动脉周围的动脉筋膜。使用镊子将清洁后的颈动脉转移到装满 PBS 的新大培养皿中。将动脉切成大约 2 毫米宽的环。

然后将环转移到含有 ECG 培养基的预热小培养皿中。将圆环置于 37 摄氏度。首先，使用圆头镊子将猪颈动脉环从 ECG 培养基转移到装满 PBS 的中型培养皿中。

在圆头镊子和手术刀的帮助下，将环切成两半，然后将半个环解剖成大约 2 毫米宽的片材，以创建尺寸为 2 x 2 毫米的动脉片。使用圆尖镊子，将动脉片固定在背面，并将动脉片放置在 PAA 凝胶的边缘，使内皮内衬面向 PAA 基材。接下来，在镊子的帮助下，将动脉片轻轻移动到 PAA 水凝胶的中心，不要接触凝胶。

在动脉片顶部添加 50 μL ECG 培养基，同时确保液滴保留在凝胶上。使用圆头镊子，将干燥的 13 毫米盖玻片放在培养基中 PAA 基材上的动脉片顶部。使用玻璃底部的内缘轻轻降低盖玻片，直到中等液滴在下面扩散。

让组织在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下附着 5 小时。然后，向每个孔中加入 1 毫升 ECG 培养基。将动脉片在 PAA 基材上于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳孵育 24 小时。

第二天，使用弯曲的针头，小心地提起盖玻片，然后用镊子将其从动脉片上取下。在不接触组织的情况下，使用真空抽吸从孔和周围组织中取出培养基，在每个动脉片上加入 10 微升 1 型胶原蛋白凝胶混合物滴。让凝胶在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下聚合 1 小时。

孵育后，向每个孔中轻轻添加 1 mL 预热的 ECG 培养基。将板转移到 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中 24 小时。当使用 13 毫米未经处理的盖玻片时，观察到动脉片的附着效率提高，最大限度地减少了其移除过程中的剪切力。

在 2.5D 系统中培养猪颈动脉 24 小时后，检查发芽血管生成。如果观察到发芽血管生成，请刷新 ECG 培养基并将 12 孔板放入显微镜 37 摄氏度预热孵育箱内的载物台支架中。根据成像需求选择显微镜物镜。

使用相差成像设置曝光时间并调整焦平面。然后添加荧光通道以对荧光珠进行成像并再次设置曝光时间。在样品中选择多个感兴趣的区域，并调整每个位置的焦平面。

通过选择 5 到 20 分钟的时间间隔和 4 到 24 小时的持续时间来定义感兴趣的时间流逝。打开对焦系统可在整个延时摄影成像过程中保持稳定的对焦。接下来进行牵引力显微镜检查，将 5%SDS 的超纯水加入井中，等待几分钟让生长的细胞分离。

在 PAA 衬底中为每个选定位置获取荧光标记物的 Z 堆栈，以获得荧光标记物的松弛状态作为参考图像。使用自定义的 MATLAB 代码，选择用于图像处理的延时图像和参考图像，并定义用于分析的参数。相对于最佳参考图像对齐和裁剪延时图像以进行精确分析。

通过在延时图像和参考图像之间执行粒子图像 vel 不对称性来测量荧光标记物在 PAA 水凝胶中的位移。配置图像 vel 不对称分析，将图像划分为 32 x 32 像素的询问窗口，重叠 0.5 个。最后，根据 PAA 凝胶的机械特性计算细胞牵引力。

在猪动脉片的 2.5D 和 3D 模型中观察到细胞芽的形成，类似于血管生成模式，而 2D 模型显示没有发芽血管生成。与较硬的 PAA 基质相比，PAA 水凝胶的软基质刚度促进了早期动脉发芽血管生成，证明了基质刚度效应。牵引力显微镜显示，细胞芽在突起处表现出拉力和沿芽轴的推力，由前导细胞和追随细胞驱动。