Quantificare la meccanica cellulare che guida l'angiogenesi germinativa nei tessuti viventi 3D è ancora difficile, eppure è necessario per continuare a fare progressi nel campo della medicina rigenerativa. Questo protocollo rende il compito più accessibile combinando l'accessibilità dei metodi quantitativi 2D con la rappresentatività dei tessuti 3D. I metodi esistenti per la quantificazione delle forze cellulari durante la germinazione angiogenica nei tessuti viventi sono limitati all'inferenza di forza 3D complessa e computazionalmente costosa.
Il nostro protocollo collega il controllo in vitro con la rilevanza in vivo, adattando la microscopia della forza di trazione per i sistemi X-vivo, offrendo un metodo facile da usare ma fisiologicamente rilevante per la caratterizzazione della forza meccanica temporale spaziale. 2 Il modello Nav-D preserva un contesto fisiologico consentendo al contempo l'analisi quantitativa della meccanica cellulare, offrendo un approccio unico per studiare la meccanica che guida l'angiogenesi germinativa. Per iniziare, pipettare 120 microlitri della soluzione di silano legante in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti con fondo di vetro.
Incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora. Dopo l'incubazione, lavare i pozzetti tre volte con etanolo assoluto utilizzando un flacone spray, asciugare la piastra con azoto gassoso. Pipettare 11,5 microlitri della miscela di poliacrilammide o gel PAA appena preparata sul fondo di vetro di ciascun pozzetto.
Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti da 13 millimetri sopra ogni gocciolina. Dopo la polimerizzazione, aggiungere PBS al pozzetto. Usando un ago piegato, allenta delicatamente il vetrino coprioggetto dal gel PAA.
Quindi usa una pinzetta per rimuovere il vetrino coprioggetto dal pozzo. Aggiungere sui gel PAA 75 microlitri di milligrammo per millilitro di sulfamidico sampa, sciolto in acqua ultrapura. Posizionare la piastra sotto la luce ultravioletta a 365 nanometri per cinque minuti.
Sciacquare rapidamente la sulfamidica sampa sui gel con PBS. Quindi lavare i gel PAA funzionalizzati due volte con PBS per 10 minuti ciascuno. Pipettare 50 microlitri di soluzione di collagene 4 sui gel PAA funzionalizzati e incubare per una notte a quattro gradi Celsius.
Il giorno successivo, lava i gel due volte con PBS e lasciali asciugare per cinque minuti. Aggiungere 50 microlitri di terreno per la crescita delle cellule endoteliali o ECG sopra i gel. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per un'ora.
Per iniziare, utilizzando una pinzetta chirurgica sterile, trasferire l'arteria carotide suina dal flacone di trasporto contenente la soluzione di CREB modificata in una grande capsula di Petri riempita con PBS sterile. Rimuovere il tessuto in eccesso che circonda l'arteria carotide usando una pinzetta chirurgica e un bisturi. Taglia da due a tre centimetri da entrambe le estremità dell'arteria usando un bisturi per eliminare le aree vicino alle biforcazioni delle arterie.
Con l'aiuto di una pinzetta a punta tonda e di un bisturi, rimuovere la fascia arteriosa che circonda l'arteria carotide. Usando una pinzetta, trasferisci l'arteria carotide pulita in una nuova grande capsula di Petri riempita di PBS. Tagliare l'arteria in anelli larghi circa due millimetri.
Quindi trasferire gli anelli in una piccola piastra di Petri preriscaldata contenente terreno ECG. Posizionare gli anelli a 37 gradi Celsius. Per iniziare, utilizzando una pinzetta a punta tonda, trasferire l'anello dell'arteria carotide suina dal medio ECG a una piastra di Petri di medie dimensioni riempita di PBS.
Con l'aiuto di una pinzetta a punta tonda e di un bisturi, tagliate l'anello a metà, quindi sezionate mezzo anello in fogli di circa due millimetri di larghezza per creare fogli arteriosi con dimensioni di due per due millimetri. Utilizzando una pinzetta a punta tonda, tenere il foglio arterioso sul retro e posizionare il foglio sul bordo del gel PAA con il rivestimento interno endoteliale rivolto verso il substrato PAA. Successivamente, con l'aiuto di una pinzetta, sposta delicatamente il foglio arterioso al centro dell'idrogel PAA senza toccare il gel.
Aggiungere 50 microlitri di terreno ECG sopra il foglio arterioso assicurandosi che la gocciolina rimanga sul gel. Usando le pinzette a punta tonda, posizionare un vetrino coprioggetti asciutto da 13 millimetri sopra il foglio arterioso sul substrato PAA nel mezzo. Utilizzare il bordo interno del fondo in vetro per abbassare delicatamente il vetrino coprioggetti fino a quando la gocciolina media non si diffonde al di sotto.
Lasciare che il tessuto si attacchi a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per cinque ore. Successivamente, aggiungere un millilitro di terreno ECG a ciascun pozzetto. Incubare il foglio arterioso sul substrato PAA a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore.
Il giorno successivo, utilizzando un ago piegato, sollevare con cautela il vetrino coprioggetto e rimuoverlo dal foglio arterioso con una pinzetta. Rimuovere il terreno dal pozzetto e dal tessuto circostante utilizzando un'aspirazione a vuoto senza toccare il tessuto, aggiungere una goccia da 10 microlitri di miscela di gel di collagene di tipo 1 su ciascun foglio arterioso. Lasciare polimerizzare il gel per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente un millilitro di terreno ECG preriscaldato a ciascun pozzetto. Trasferire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Una maggiore efficienza di attacco dei fogli arteriosi è stata osservata quando è stato utilizzato un vetrino coprioggetti non trattato da 13 millimetri, riducendo al minimo le forze durante la sua rimozione.
Dopo 24 ore di coltura dell'arteria carotide suina nel sistema 2.5D, verificare la presenza di angiogenesi germinativa. Se si osserva un'angiogenesi germinativa, aggiornare il mezzo ECG e posizionare la piastra a 12 pozzetti nel supporto del tavolino all'interno della scatola di incubazione preriscaldata a 37 gradi Celsius del microscopio. Selezionare l'obiettivo del microscopio in base alle esigenze di imaging.
Impostare il tempo di esposizione e regolare il piano di messa a fuoco utilizzando l'imaging a contrasto di fase. Quindi aggiungere il canale fluorescente per l'imaging delle perline fluorescenti e impostare nuovamente il tempo di esposizione. Selezionate più regioni di interesse nel campione e regolate il piano di messa a fuoco per ogni posizione.
Definisci il time-lapse di interesse selezionando un intervallo di tempo da 5 a 20 minuti e una durata da 4 a 24 ore. Attivare il sistema di messa a fuoco per mantenere una messa a fuoco stabile durante l'imaging time-lapse. Successivamente, per la microscopia della forza di trazione, aggiungere il 5% di SDS in acqua ultrapura al pozzo e attendere alcuni minuti affinché le cellule in crescita si stacchino.
Acquisire una pila Z di marcatori fluorescenti nel substrato PAA per ogni posizione selezionata per ottenere uno stato rilassato dei marcatori fluorescenti come immagine di riferimento. Utilizzando i codici MATLAB personalizzati, è possibile selezionare immagini time-lapse e di riferimento per l'elaborazione delle immagini e definire i parametri per l'analisi. Allinea e ritaglia le immagini time-lapse rispetto alla migliore immagine di riferimento per un'analisi precisa.
Misurare lo spostamento dei marcatori fluorescenti nell'idrogel PAA eseguendo l'asimmetria vel dell'immagine delle particelle tra l'immagine time-lapse e l'immagine di riferimento. Configura l'analisi dell'asimmetria dell'immagine per dividere le immagini in finestre di interrogazione di 32 x 32 pixel con una sovrapposizione di 0,5. Infine, calcola le forze di trazione cellulare in base alle proprietà meccaniche del gel PAA.
La formazione di germogli cellulari è stata osservata all'interno dei modelli 2.5D e 3D del foglio arterioso suino, simili a modelli angiogenici, mentre il modello 2D non ha mostrato angiogenesi germinativa. La rigidità del substrato morbido dell'idrogel PAA ha promosso l'angiogenesi precoce della germinazione arteriosa rispetto a un substrato PAA più rigido, dimostrando effetti di rigidità della matrice. La microscopia della forza di trazione ha rivelato che i germogli cellulari mostravano forze di trazione alle sporgenze e forze di spinta lungo l'asse del germoglio, guidate da cellule leader e follower.
