标准化和可扩展的测定，以研究iPSC衍生内皮细胞在Vitro的渗透3D血管生成发芽

这种体外测定在高通量和可扩展的平台上演示了血管生成发芽。这可以用来在血管生成中寻找新的靶点。此血管生成测定结合了复杂的细胞微环境，包括梯度和灌注与与高通量筛选兼容的平台。

血管生成在健康和疾病中都起着重要作用。了解血管生成过程中发生的机制可以帮助我们了解癌症是如何生长的以及组织如何修复的。该方法可以深入了解心血管疾病和组织再生过程中的机制。

在这两个中，血管生成起着重要的作用。对于首次使用这种微流体平台，您需要了解体积定律以及如何移液。您可以通过在显微镜下观察或倒置盘子来确认步骤。

当只阅读方法时，有些步骤很难得到感觉，例如微流体通道有多小，或者如何握住盘子。演示这些程序的将是温迪·斯塔姆，一个来自我们实验室的技术人员。首先，将微流体 384 井板转移到无菌层流罩中。

使用多通道移液器，取下盖子，将 50 微升水或磷酸盐缓冲盐水添加到 40 个观察井中。然后向每个微流体单元的凝胶入口添加 1.5 微升，每毫升胶原蛋白 4 毫克。确保凝胶液滴放置在每一个井的中间，以便凝胶进入通道。

填充五个微流体单元后，将板倒置，以目视检查凝胶通道的正确填充。将微氟板放在37摄氏度的培养箱中，将5%的二氧化碳放置10分钟，以聚合胶原蛋白。然后将板从培养箱中取出，转移到无菌层流罩中。

在每个微流体单元顶部灌注通道的出水口井中加入 50 微升，每毫升纤维素编码溶液为 10 微克。将移液器尖端压在井的一侧，以正确填充井，而不会捕获气泡。通道充满，出口上的液体盘没有填充出口。

然后将盘子放在孵化器中至少两天。现在，在37摄氏度的水浴中快速解冻冷冻的IPSC-DC不到一分钟。然后将细胞转移到15毫升管中，然后慢慢加入10毫升的基础介质以稀释。

绘制溶液的 10 微升，并计算单元格计数器上的单元格。将管子以100倍g离心5分钟。吸升液而不干扰细胞颗粒，并在基底介质中重新暂停，每毫升产生2倍10至第七细胞的浓度。

接下来，将微流体384井板从培养箱转移到无菌层流罩。从灌注口吸出纤维素编码溶液，并在出水口中加入25微升基底介质。在每个顶部灌注进气口中加入一个微升的细胞悬浮液滴。

液滴在几秒钟内变平。在显微镜下检查播种是否在单个通道内和通道之间是均匀的。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育微流体井板1至1.5小时。

之后，检查细胞，以确认它们已粘附。从顶部灌注出口井中拆下基底介质。在顶部灌注入口和出口中加入温暖的容器培养介质。

将板放在摇杆平台上，该平台设定在 7 度角和 8 分钟摇点间隔内。在第一天和播种后的第二天，使用 Brightfield 显微镜与自动阶段成像板，以确认细胞的生存能力。两天后，一个汇合单层对胶原蛋白形成了一个脚手架。

首先，用4.5微升VEGF库存、4.5微升PMA库存和2.25微升S1P库存补充4.5毫升基础介质，准备4.5毫升的血管生成发芽介质。用5.1微升VEGF和3.4微升的BFGF补充基底介质，准备8.5毫升的容器生长介质。从井中吸出培养剂，在顶部灌注进气口和出口井以及凝胶进气井和出口井中加入50微升新鲜容器培养介质。

然后将50微升的血管发芽混合物添加到每个底部灌注通道入口和出口孔中。将板放回摇杆平台上的培养箱中，形成血管生长因子的梯度。在添加血管生成因子的一天和两天后，使用 Brightfield 显微镜在自动舞台上对油井进行成像。

为了研究阿托莫病和芽稳定，在顶部灌注入口中加入每毫升0.5毫克的微升荧光标记白蛋白。然后将溶液与 50 微升移液器混合。将板转移到荧光显微镜上，自动舞台和培养箱设定在摄氏37度。

将显微镜设置为 10 倍目标，并纠正曝光设置。每分钟获取延时图像 10 分钟。从显微镜上取下板，将板转移到无菌层流罩中。

从井中去除所有介质，并更换相应井中的容器培养介质和血管发芽介质。将微流体板放回培养箱中，继续血管生成发芽。第六天，重复成像以研究渗透性。

要修复细胞培养，请从井中吸出所有培养媒体。在 PBS 中加入 25 微升 4%PFA，加入所有灌注进气口和出口井。然后将微流体板的一侧以五度的轻微角度放在盖子上，以诱导流动。

在室温下孵育10分钟。之后，从井中吸入PFA。用 50 微升 HBSS 洗涤所有灌注液和插座两次。

然后从井中吸出HBSS。甲醛是一种危险化学品，应戴手套处理，且仅在烟罩中打开。接下来，在所有灌注输液和出口中加入50微升0.2%非离子表面活性剂，在室温下渗透10分钟，并将微流体板以5度的轻微角度放在盖子上。

从油井中吸出非离子表面活性剂，通过在所有灌注进气孔和出口井中加入 50 微升 HBSS 来清洗灌注通道两次。从井中吸出 HBSS。准备 Hoechst 1，000 到 2，000 染色核，并准备 Phs 中的 Phaloidin 100 到 200 染色 F-actin。

将六毫升的哈佛商学院、30微升的F-actin和3微升的霍赫斯特混合在猎鹰管中。然后在每个灌注进气口和出口井中加入25微升。将板放在一个轻微的角度下，在室温下孵育至少30分钟。

在所有灌注输液口和插座中用 50 微升 HBSS 洗涤两次。然后直接成像使用荧光显微镜与自动阶段或存储板保护免受光在四摄氏度以后使用。在此协议中，微血管不断被注入并暴露在血管生长因子的梯度中。

使用无源泵送方法播种 IPSC-DC 可产生均匀播种密度。放置在微流体通道入口顶部的液滴的延时显示加法后的水滴，加法后在进气管上滴，直到液滴半月板被入口固定，导致流向出口。暴露于血管生成因子的梯度导致一种凝胶内的微血管定向性血管发芽。

清除尖端细胞形成和入侵胶原蛋白一凝胶在添加血管生成梯度后24小时可见，而包括流明形成在内的库存细胞在48小时后可见。固定和染色后，这些芽的形状和长度被识别。然而，如果没有增加生长因子，没有进入胶原蛋白一凝胶被观察到。

通过共声成像，确定了芽直径，确定了流明的形成。这种方法可用于筛选新的血管生成抑制剂。这可能有助于找到治疗糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎和癌症的新疗法。

我们目前正在探索如何创造共同文化，包括血脑屏障和血管化器官的模型。