Cuantificar la mecánica celular que impulsa la germinación de la angiogénesis en tejidos vivos en 3D es todavía difícil, pero necesario para seguir avanzando en el campo de la medicina regenerativa. Este protocolo hace que la tarea sea más accesible al combinar la accesibilidad de los métodos cuantitativos 2D con la representatividad de los tejidos 3D. Los métodos existentes para la cuantificación de las fuerzas celulares durante la germinación angiogénica en el tejido vivo se limitan a la compleja y computacionalmente costosa inferencia de fuerzas 3D.
Nuestro protocolo une el control in vitro con la relevancia in vivo al adaptar la microscopía de fuerza de tracción para sistemas X-vivo, ofreciendo un método fácil de usar pero fisiológicamente relevante para la caracterización de fuerzas mecánicas espaciales y temporales. 2 El modelo Nav-D preserva un contexto fisiológico al tiempo que permite el análisis cuantitativo de la mecánica celular, ofreciendo un enfoque único para estudiar la mecánica que impulsa la angiogénesis germinal. Para comenzar, pipetee 120 microlitros de la solución de silano aglutinante en cada pocillo de una placa de 12 pocillos con fondo de vidrio.
Incuba la placa a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, lave los pocillos tres veces con etanol absoluto con una botella rociadora, seque la placa con gas nitrógeno. Pipetee 11,5 microlitros de la mezcla de poliacrilamida o gel de PAA recién preparada en el fondo de vidrio de cada pocillo.
Coloque suavemente un cubreobjetos de 13 milímetros encima de cada gota. Después de la polimerización, agregue PBS al pocillo. Con una aguja doblada, afloje suavemente el cubreobjetos del gel PAA.
Luego use pinzas para quitar el cubreobjetos del pozo. Añadir 75 microlitros de un miligramo por mililitro de sulfa sampa, disueltos en agua ultrapura sobre los geles de PAA. Coloque la placa bajo luz ultravioleta de 365 nanómetros durante cinco minutos.
Enjuague rápidamente las sulfas sampa de los geles con PBS. A continuación, lave los geles de PAA funcionalizados dos veces con PBS durante 10 minutos cada uno. Pipetear 50 microlitros de solución de colágeno 4 en los geles de PAA funcionalizados e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados.
Al día siguiente, lave los geles dos veces con PBS y déjelos secar durante cinco minutos. Agregue 50 microlitros de crecimiento de células endoteliales o medio de ECG encima de los geles. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante una hora.
Para comenzar, usando pinzas quirúrgicas estériles, transfiera la arteria carótida porcina del frasco de transporte que contiene solución de CREB modificada a una placa de Petri grande llena de PBS estéril. Elimine el exceso de tejido que rodea la arteria carótida con pinzas quirúrgicas y un bisturí. Corte de dos a tres centímetros de ambos extremos de la arteria con un bisturí para eliminar las áreas cercanas a las bifurcaciones de las arterias.
Con la ayuda de unas pinzas finas de punta redonda y un bisturí, retire la fascia arterial que rodea la arteria carótida. Con unas pinzas, transfiera la arteria carótida limpia a una nueva placa de Petri grande llena de PBS. Corta la arteria en anillos de aproximadamente dos milímetros de ancho.
A continuación, transfiera los anillos a una pequeña placa de Petri precalentada que contenga medio de ECG. Coloca los anillos a 37 grados centígrados. Para comenzar, usando pinzas de punta redonda, transfiera el anillo de la arteria carótida porcina del medio del ECG a una placa de Petri de tamaño mediano llena de PBS.
Con la ayuda de pinzas de punta redonda y un bisturí, corte el anillo por la mitad, luego diseccione la mitad de un anillo en láminas de aproximadamente dos milímetros de ancho para crear láminas arteriales con dimensiones de dos por dos milímetros. Con pinzas de punta redonda, sostenga la lámina arterial en la parte posterior y coloque la lámina en el borde del gel de PAA con el revestimiento interno endotelial hacia el sustrato de PAA. A continuación, con la ayuda de unas pinzas, mueva suavemente la lámina arterial hasta el centro del hidrogel PAA sin tocar el gel.
Agregue 50 microlitros de medio ECG en la parte superior de la lámina arterial mientras se asegura de que la gota permanezca en el gel. Con las pinzas de punta redonda, coloque un cubreobjetos seco de 13 milímetros encima de la lámina arterial sobre el sustrato de PAA en el medio. Use el borde interior del fondo del vaso para bajar suavemente el cubreobjetos hasta que la gota mediana se extienda por debajo.
Deje que el tejido se adhiera a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cinco horas. Después, añade un mililitro de medio ECG a cada pocillo. Incubar la lámina arterial en el sustrato de PAA a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.
Al día siguiente, con una aguja doblada, levante con cuidado el cubreobjetos y retírelo de la lámina arterial con pinzas. Retire el medio del pocillo y del tejido circundante mediante una succión al vacío sin tocar el tejido, agregue una gota de 10 microlitros de mezcla de gel de colágeno tipo 1 en cada lámina arterial. Deje que el gel se polimerice durante una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Después de la incubación, agregue suavemente un mililitro de medio ECG precalentado a cada pocillo. Transfiera la placa a una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Se observó un aumento de la eficiencia de fijación de las láminas arteriales cuando se utilizó un cubreobjetos de 13 milímetros sin tratar, lo que minimizó las fuerzas de horma durante su extracción.
Después de 24 horas de cultivo de la arteria carótida porcina en el sistema 2.5D, verifique si hay angiogénesis germinal. Si se observa angiogénesis germinal, refresque el medio de ECG y coloque la placa de 12 pocillos en el soporte de la platina dentro de la caja de incubación precalentada a 37 grados Celsius del microscopio. Seleccione el objetivo del microscopio en función de las necesidades de imagen.
Establezca el tiempo de exposición y ajuste el plano de enfoque mediante imágenes de contraste de fase. A continuación, añada el canal fluorescente para obtener imágenes de las perlas fluorescentes y vuelva a ajustar el tiempo de exposición. Seleccione varias regiones de interés en la muestra y ajuste el plano de enfoque para cada posición.
Defina el lapso de tiempo de interés seleccionando un intervalo de tiempo de 5 a 20 minutos y una duración de 4 a 24 horas. Encienda el sistema de enfoque para mantener un enfoque estable durante toda la imagen de lapso de tiempo. A continuación, para la microscopía de fuerza de tracción, agregue 5%SDS en agua ultrapura al pocillo y espere unos minutos para que se desprendan las células que crecen.
Adquiera una pila Z de marcadores fluorescentes en el sustrato PAA para cada posición seleccionada para obtener un estado relajado de los marcadores fluorescentes como imagen de referencia. Con códigos de MATLAB personalizados, seleccione imágenes de referencia y time-lapse para el procesamiento de imágenes y defina los parámetros para el análisis. Alinee y recorte las imágenes de lapso de tiempo en relación con la mejor imagen de referencia para un análisis preciso.
Mida el desplazamiento de los marcadores fluorescentes en el hidrogel PAA realizando la asimetría de la imagen de partículas entre la imagen de lapso de tiempo y la imagen de referencia. Configure el análisis de asimetría de vel de imagen para dividir las imágenes en ventanas de interrogación de 32 por 32 píxeles con una superposición de 0,5. Por último, calcule las fuerzas de tracción celular en función de las propiedades mecánicas del gel PAA.
En los modelos 2,5D y 3D de la lámina arterial porcina se observó formación de brotes celulares, que se asemejan a patrones angiogénicos, mientras que el modelo 2D no mostró angiogénesis por brotación. La rigidez del sustrato blando del hidrogel de PAA promovió la angiogénesis de la brotación arterial temprana en comparación con un sustrato de PAA más rígido, lo que demuestra efectos de rigidez de la matriz. La microscopía de fuerza de tracción reveló que los brotes celulares exhibieron fuerzas de tracción en las protuberancias y fuerzas de empuje a lo largo del eje del brote, impulsadas por células líderes y seguidoras.
