分析脾和心脏巨噬细胞以及骨髓单核细胞中的 离体 代谢通量

在这里，我们详细描述了从骨髓、脾脏和梗塞心脏中提取巨噬细胞的方法，并随后评估活细胞中的代谢通量。

代谢重编程是单核细胞/巨噬细胞活化和促炎状态和抗炎状态之间极化的标志。例如，促炎（即 M1 样）单核细胞/巨噬细胞表现出对厌氧糖酵解的更多依赖，对线粒体氧化磷酸化的依赖较少，而抗炎（M2 样）巨噬细胞对线粒体中葡萄糖和脂肪酸氧化的依赖程度更高。在这里，我们描述了从体内两个主要的单核细胞/巨噬细胞库（脾脏和骨髓）以及心肌梗死后心脏等受伤组织中提取巨噬细胞的深入方案。

使用抗体标记的微珠通过免疫磁性分选提取巨噬细胞或单核细胞，这些微珠很容易与细胞结合而不会影响其表型。然后将提取的细胞在 96 孔板中培养，然后使用代谢通量分析仪进行细胞外通量分析。糖酵解和线粒体氧化磷酸化都可以在少量细胞（少至 2-3 × 10⁵ 个细胞）中同时测量。该方法可在 1 天内轻松完成，并产生可靠且可重复的结果。最终，这些方法有助于增强我们对损伤和疾病的免疫和炎症反应期间代谢变化的理解，这可能导致免疫代谢途径的新型治疗靶点的开发。

免疫代谢是一个蓬勃发展的领域，研究代谢重编程在不同病理疾病和损伤状态下的免疫细胞中的作用。巨噬细胞是先天免疫系统的关键部分，在炎症、感染反应、抗原呈递和伤口愈合中起关键作用¹。了解巨噬细胞在不同疾病状态下的促炎和抗炎（M1 样和 M2 样）亚群之间如何极化是一个持续和深入研究的领域。最近的研究发现代谢重编程是巨噬细胞极化的关键机制。目前的范式是，广义上讲，M1 样巨噬细胞（通常是单核细胞样）更多地依赖糖酵解来促进促炎功能，而 M2 样巨噬细胞更多地依赖线粒体氧化磷酸化来平息促炎功能并促进抗炎过程²。了解巨噬细胞代谢在不同疾病状态下如何改变，可以深入了解可用于靶向代谢途径的潜在疗法。

例如，我们的实验室广泛研究了巨噬细胞代谢重编程在心肌梗死 （MI） 期间的作用^3,4,5。巨噬细胞在 MI 期间的炎症和伤口愈合反应中起关键作用，因此，随着梗死心脏经历重塑以形成替代疤痕组织，巨噬细胞会从 M1 样表型极化为 M2 样表型。使用本文描述的方法，我们已经证明这种极化的特征是葡萄糖和谷氨酰胺代谢以及线粒体功能的独特变化。我们描述了提取心脏巨噬细胞以及脾巨噬细胞和骨髓单核细胞的方法，这些方法可以与细胞外通量分析相结合，以评估一天内的离体代谢通量。我们希望所描述的方法为评估免疫细胞代谢表型提供一种标准化方法，以提高研究这一重要主题的实验室的可重复性。

以下方法描述了从 MI、脾脏和骨髓后从梗塞心脏中提取巨噬细胞和进行代谢通量离 体 分析的方案（图 1）。对于 MI 心脏和脾脏，使用的提取方法相同。所有涉及小鼠的方案均已获得密西西比大学医学中心机构动物护理和使用委员会（协议 #1371，Mouton）的批准。

1. 从梗死的心脏和脾脏中提取巨噬细胞

注：组织巨噬细胞的提取使用阴性选择策略首先去除用 Ly6G 微珠标记的中性粒细胞，然后使用阳性选择策略获得带有 CD11b-微珠 3,4,5,6 的巨噬细胞。执行此协议时，请快速工作并保持细胞低温。

1. 根据 AALAC 和机构指南对小鼠实施安乐死，先用异氟醚过量，然后取出心脏。
2. 快速取出心脏和脾脏，称量组织。
3. 在测定之前，通过将 EDTA （2 mM） 和 0.5% 牛血清白蛋白 （w/v） 溶解在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中来制备 PEB 缓冲液。保持低温。
4. 将心脏放入冷的 Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 中。用无菌手术刀切成小块。
5. 制备含有 600 U/mL II 型胶原酶和 60 U/mL I 型 DNase 的消化溶液。在 MACS 细胞解离管中将组织与 10 mL 消化液混合。
   注：制备足够的消化液，每个组织使用 10 mL（室温）。
6. 根据制造商的方案使用细胞解离器孵育组织。这将在 37 °C 下轻轻旋转孵育切碎的组织 ~1 小时以产生细胞悬液。
7. 将悬浮液移至 15 mL 锥形管中，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
8. 将沉淀重悬于 1 mL PEB 缓冲液中。要生成单细胞悬液，请将悬浮液涂在 30 μm 过滤器上。
9. 要裂解红细胞，请加入 10 mL 的 1x 红细胞裂解液。在 4 °C 的黑暗中孵育 5-10 分钟。
10. 将悬浮液在 4 °C 下离心 300 × g 10 分钟。
11. 将沉淀重悬于 1 mL PEB 中，并使用血细胞计数器对细胞进行计数。
12. 将悬浮液在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
13. 为了去除中性粒细胞，通过每 10⁷ 个细胞混合 90 μL PEB 缓冲液和 10 μL 抗 Ly6G 微珠来制备微珠。将细胞沉淀与微珠悬浮液混合，并在 4 °C 的黑暗中孵育 10 分钟。
14. 要洗出未结合的微珠，加入 10 mL PEB 缓冲液，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
15. 在磁力架上准备磁柱（MS 或 LS）。通过添加 0.5-1.0 mL PEB 缓冲液润湿色谱柱。
    注意：对于具有大量免疫细胞（即脾脏）的组织，磁柱很容易堵塞并停止流动。因此，我们建议对脾脏使用 LS 柱。
16. 将细胞沉淀重悬于 500 μL PEB 缓冲液中。将细胞悬液添加到磁柱中，让未标记的细胞（即非嗜中性粒细胞）通过。用 500 μL PEB 缓冲液洗涤色谱柱 2 次。将未标记的细胞（即巨噬细胞和其他细胞）收集在 15 mL 锥形管中。
17. 将悬浮液在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
18. 通过每 10⁷ 个细胞将 90 μL PEB 缓冲液与 10 μL 抗 CD11b 微珠混合来制备微珠。将细胞沉淀与微珠悬浮液混合，并在 4 °C 下避光孵育 15 分钟。
19. 重复步骤 1.13-1.15。
20. 标记的巨噬细胞将与磁柱结合。要收集它们，请从磁力架上拆下磁柱，并将其放在新的 15 mL 锥形管上。
21. 向色谱柱中加入 1 mL 补充有 0.1% 胎牛血清 （FBS） 的 RPMI 培养基。使用柱塞将巨噬细胞提取到试管中。使用血细胞计数器计数巨噬细胞。
    注：巨噬细胞现在在试管中，可直接用于进一步检测。

2. 从骨髓中提取单核细胞

注：从骨髓中提取单核细胞使用阴性选择策略，其中非单核细胞，包括淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、红细胞和粒细胞（即中性粒细胞），被免疫磁性标记并去除。

1. 根据 AALAC 和机构指南对小鼠实施安乐死，先用异氟醚过量，然后取出心脏。
2. 从鼠标上取下支腿。在冷 HBSS 中，从胫骨和股骨上解剖肌肉，直到骨骼干净。
3. 小心地切掉骨头的两端。使用带有 27 G 针头的 10 mL 注射器，将骨髓冲洗到装有 PEB 缓冲液的 15 mL 锥形管中。将悬浮液在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
4. 执行步骤 1.8-1.12。
5. 每 5 × 10⁷ 个总细胞加入 175 μL PEB 缓冲液、25 μL FcR 封闭试剂和 50 μL 单核细胞生物素抗体混合物。在 4 °C 的黑暗中孵育 5 分钟。
6. 加入 10 mL PEB 缓冲液洗涤，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
7. 收集沉淀并将细胞重悬于 500 μL PEB 缓冲液和 100 μL 抗生物素微珠中。在 4 °C 的黑暗中孵育 10 分钟。
8. 在磁力架上准备磁柱 （LS）。通过添加 1.0 mL PEB 缓冲液润湿色谱柱。
9. 立即将细胞悬液涂在色谱柱上。使用 15 mL 试管收集含有单核细胞的流出液。非单核细胞与磁柱结合。
10. 用 1 mL PEB 缓冲液洗涤色谱柱 2 次。使用血细胞计数器计数单核细胞。
11. 为了准备用于下一步的单核细胞，请在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。 对于通量分析，将细胞沉淀重悬于 1 mL RPMI + 0.1% FBS 中。对于流式细胞术，将细胞保存在冷 PEB 中并继续染色。

3. 用于代谢通量分析的细胞的制备

1. 水合传感器探针板（检测前一天）
   1. 从包装中取出传感器盒。从孔中取出传感器板（绿色），将 200 μL 校准液移液到每个孔中。将传感器板放回卡板顶部，使传感器浸没在校准液中。
   2. 将小柱放入非 CO₂ 加湿培养箱 （37 °C） 中过夜。
2. 电镀细胞
   1. 将细胞接种在 96 孔培养板中，在 200 μL 培养基中至少 1 小时。至少将一个孔留空以进行背景测量（对于空白孔，请使用相同体积的培养基）。
      注意：应在实验前确定最佳细胞数。有关更多详细信息，请参阅讨论中的“故障排除提示”。
   2. 准备进行检测时，准备代谢通量培养基（即不含葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸等的基础 RPMI 或 DMEM）。对于糖酵解应激测试，确保基础培养基中补充有 2 mM 谷氨酰胺。对于线粒体应激测试，确保基础培养基中补充有 2 mM 谷氨酰胺、10 mM 葡萄糖和 1 mM 丙酮酸。
   3. 通过缓慢移液，小心地用新的基础培养基替换旧培养基（小心不要移出任何细胞）。在显微镜下检查细胞以确保它们仍然存在。
   4. 将细胞板置于非 CO₂ 加湿培养箱 （37 °C） 中。
3. 加载助焊剂板
   1. 从培养箱中取出水合传感器盒/助焊剂板。
   2. 准备用于糖酵解或线粒体压力测试的测试化合物。
      1. 糖酵解：使用糖酵解基础培养基，通过将葡萄糖溶解在 3 mL 中，将寡霉素溶解在 270 μL （100 μM） 中，将 2-脱氧葡萄糖溶解在 3 mL 中来制备储备液。制备 10 μM 的工作寡霉素溶液。
      2. 线粒体：使用线粒体基础培养基，通过将寡霉素溶解在 630 μL （100 μM） 中、将羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙 （FCCP） 溶解在 720 μL （100 μM） 中，以及将鱼藤酮/抗霉素 A 溶解在 540 μL （50 μM） 中来制备储备液。制备寡霉素 （0.5-2.5 μM）、FCCP （0.125-2.0 μM） 和鱼藤酮/抗霉素 A （0.5 μM） 的工作溶液。
         注：我们发现 1.5 μM 寡霉素和 2.0 μM FCCP 产生最佳结果。
   3. 使用以下体积将测试化合物上样到端口中：端口 A-20 μL、端口 B-22 μL、端口 C-25 μL、端口 D-27 μL。可选：将所选药物或化合物上样到端口 A，并将测试化合物上样到端口 B、C 和 D，以评估对糖酵解或线粒体呼吸的急性影响。如果不使用其他药物或化合物，请将端口 D 留空。
4. 运行检测
   1. 打开软件并选择 Mitochondrial Stress Test。
      注意：该程序也可用于糖酵解负荷测试，因为测量细胞外酸化率 （ECAR）。
   2. 选择将使用的孔。要减去背景，请确保至少 1 个孔中没有细胞。
   3. 运行程序。在取下盖子的情况下加载助焊剂板，以便校准板（~20 分钟）。
   4. 校准板后，软件将提示加载电池板。从培养箱中取出细胞板，取下助焊板底部，将细胞板放入支架中。按 run。该测定需要 ~2.5 小时才能完成。
   5. 使用 Metabolic Flux 软件⁷ 或其他选择的分析软件分析结果。

从不同组织获得的典型细胞数量取决于动物的大小、年龄和性别。对于成年雄性小鼠（即 16 周龄，~30 g），脾脏可能产生 3.0-4.0 × 10⁶ 个巨噬细胞，而骨髓（两个胫骨和两个股骨）通常产生 1.0-1.5 × 10⁶ 个单核细胞（图 2A）。梗塞心脏通常也会产生大量数据，具体取决于 MI ^4,5,6 后的第二天。第 3 天，产量通常为 ~1.5 × 10⁶ 个细胞/心脏。健康的心脏通常只有很少的巨噬细胞（0.1-0.2 × 10⁵/心脏）⁶;因此，如果使用来自健康（非梗死心脏）的巨噬细胞作为对照，则可能需要汇集多个心脏。图 2B 显示了提取的巨噬细胞或单核细胞的代表性流式细胞术图，显示了 CD11b 高度阳性和 Ly6G 阴性的群体。心脏和脾巨噬细胞对单核细胞标志物 Ly6C 表现出异质性，而骨髓单核细胞对 Ly6C 高度阳性。来自梗死心脏、脾脏和骨髓（即整个组织）的分选中性粒细胞（心脏和脾脏）和未分选细胞的代表性流式细胞术图显示在补充图 S1、补充图 S2 和补充图 S3 中。

细胞外通量分析的结果表示为 ECAR （mPh/min） 和耗氧率 （OCR， pmol O₂/min） 的变化。结果通常以折线图的形式呈现，y 轴为 ECAR 或 OCR，x 轴为时间（图 3）。特定测量值显示为条形图。

从原始数据中，可以计算出几个代谢参数。还可以计算每个孔的 OCR/ECAR 比率，以得出对糖酵解与线粒体呼吸的依赖性，线粒体呼吸在不同条件下可能会发生变化⁴。例如，我们让小鼠 （成年雄性 C57BL/6J） 禁食过夜以评估巨噬细胞代谢的变化。通过降低血糖水平和增加血酮来证实禁食表型（补充图 S4），这减少了循环白细胞和中性粒细胞（Hemavet 950FS 自动血液分析仪; 补充图 S5）。我们从进食小鼠与禁食小鼠中分离骨髓单核细胞和脾巨噬细胞，并通过细胞外通量分析评估代谢变化（图 4）。在骨髓单核细胞中，空腹在线粒体压力测试和糖酵解压力测试中减少了糖酵解并增加了 OCR/ECAR 比率（图 4A）。在脾巨噬细胞中，禁食对糖酵解没有显着影响，但增加了备用容量和 ATP 相关呼吸（图 4B）。 图 4C 显示了手术后 3 天从梗塞心脏分离的巨噬细胞代谢通量的示例。

图 1：提取的巨噬细胞/单核细胞中代谢通量分析的代表性示意图。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：从小鼠中分离的心脏和脾巨噬细胞以及骨髓单核细胞的代表性结果。 （A） 分离的心脏和脾巨噬细胞以及骨髓单核细胞 （4x） 的代表性图像;每只小鼠的平均细胞数。比例尺 = 1 毫米。（B） 来自心脏（心肌梗死第 3 天）和脾巨噬细胞和骨髓单核细胞的代表性流式细胞术图。CD45 用作泛白细胞标志物，CD11b 作为髓系细胞标志物。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：测试的代表性结果。 （A） 糖酵解和 （B） 线粒体压力测试。N = 3 个独立测量值（脾巨噬细胞）。平均值 ± SEM。缩写： ECAR = 细胞外酸化率;OCR = 耗氧率;FCCP = 羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：隔夜禁食对细胞代谢的影响。 （A） 骨髓单核细胞和 （B） 脾巨噬细胞代谢。（C） 心肌梗死后 3 天心脏巨噬细胞的代表性细胞外通量图。N = 每组 3-4 个。缩写：FCCP = 羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充文件 1：进食和禁食小鼠的代表性流式细胞术图以及血糖和酮水平。请点击此处下载此文件。

我们的方法详细介绍了从骨髓、脾脏和梗死心脏中快速提取巨噬细胞，然后可用于进行下游分析，例如细胞外代谢通量分析。这两种方法的结合是一种强大的工具，可以量化不同疾病或损伤状态下巨噬细胞的代谢变化，或代谢状态（如运动）。虽然我们的方法侧重于骨髓和脾巨噬细胞，但也可以使用其他巨噬细胞储库，例如腹膜室⁸。虽然我们不是第一个使用这种方法的人，但我们希望这篇文章能增加曝光率并提高跨实验室的标准化。

虽然从这些方法获得的数据为不同巨噬细胞区室的代谢状态提供了宝贵的见解，但强烈建议使用其他方法来补充代谢通量数据，以获得更完整的代谢图景。例如，将代谢通量数据与代谢组学（即细胞内代谢物的定量）以及代谢酶的基因/蛋白质表达和/或活性相结合，通常用于对巨噬细胞的代谢状态进行全面评估 ^5,9。在许多情况下，来自同一动物的细胞可用于不同的检测。

根据我们的经验，协议的优化可能涉及几个不同步骤 的故障排除 。最重要的事情之一是快速工作并保持细胞低温，这将提高细胞产量和活力。确定细胞外通量的最佳细胞数是另一个关键点，因为细胞太少不会给出可检测的信号，而太多的细胞会耗尽培养基中的营养物质，因此不会对注射的化合物产生反应。对于巨噬细胞，我们发现来自 MI 心脏的 2.0 × 10⁵ 个细胞和 96 孔板中的 3.0 × 10⁵ 个细胞可提供最可靠和可重复的结果。但是，这可能因实验室而异。应格外小心，以确保样品和组之间的细胞数相等。不同的细胞数量对检测中使用的药物有不同的反应，并且可能会引入不需要的变异性。

在进行实验之前，还应优化分析中包含的注射药物（寡霉素、FCCP）的最佳浓度。例如，我们发现 1.5 μM 寡霉素和 2.0 μM FCCP 产生最稳健的反应。另一个常见的错误是提取后没有让细胞有足够的时间粘附在培养皿上，这会导致在更换细胞外通量培养基时细胞丢失。我们建议至少 1 小时，最多 2 小时，以使细胞粘附。

过于激进的移液也会导致细胞丢失;建议非常小心地移液，并经常在显微镜下检查细胞。最后一点是在准备助焊板时快速工作，尤其是在进行糖酵解应力测试时。由于这些细胞在测定前缺乏葡萄糖，因此较长的孵育时间（在基础培养基中超过 1 小时）可以改变对葡萄糖的初始反应。我们建议在用基础培养基替换正常培养基（~30 分钟）后立即准备助焊板，然后校准板（需要 ~20 分钟）。应始终考虑批间差异。在组之间进行直接比较时，应始终努力在同一板或实验中执行所有组。

虽然我们描述了两种经常使用的标准检测方法（糖酵解应激和线粒体压力检测），但应该注意的是，还有其他几种标准化检测可用于评估其他代谢途径，例如线粒体燃料弯曲试验¹⁰、脂肪酸/棕榈酸酯氧化¹¹ 和 ATP 速率测定¹².新的研究证明了 BAM15 解偶联剂的功效，该解偶联剂包含在 T 细胞代谢分析试剂盒中。BAM15 似乎是比 FCCP 更可靠的解偶联剂，细胞毒性作用较小¹³。未来的研究应探索这种解偶联剂在巨噬细胞代谢评估中的潜力。

此方法存在一些限制。首先是由于步骤数量众多，一个人可能很难及时执行。特别是，当使用大量样品（最多 8 个）时，建议让两个人一起工作以提高结果的质量。我们发现，即使有两个人，一天也很难处理 8 个以上的样品。另一个限制是，由于测定是在 体外进行的，因此提取程序始终有可能引起细胞表型⁶ 的变化。虽然没有明显的方法可以消除这一限制，但超极化磁共振成像等 体内 成像技术已被用于可视化 MI¹⁴ 后巨噬细胞乳酸的产生，并且有望继续发展作为我们描述的 离体 方法的补充或替代品。细胞外通量方法的一个局限性是，虽然它可以捕获糖酵解和 OXPHOS 之间的变化，但它并不能完全反映这些途径中 ATP 生成速率的变化¹⁵。此外，培养基酸化 （ECAR） 的变化可能并不总是反映糖酵解产生的乳酸，但也可能受到 TCA 循环产生 CO₂ 的影响，TCA 循环转化为碳酸氢盐¹⁵。因此，用户通过糖酵解和 OXPHOS 计算 ATP 生成速率可能是有利的，这可以评估这些途径对整体 ATP 生成的贡献。

作者没有需要声明的利益冲突。

我们要感谢支持这项工作的资金：NIH/NHBLI 166737、NIH R00 HL146888、NIH U54HL169191、NIH/NIGMS P20GM104357 和 NIH/NIGMS P30GM149404这项工作。