果 蝇 头部的直接冷冻切片，用于增强脑荧光染色和免疫染色

本研究提出了一种简化的组织处理方案，包括斩首、固定、冷冻切片、荧光染色、免疫染色和成像，可扩展到共聚焦和多光子成像。该方法保持了与复杂解剖相当的疗效，无需高级运动技能。定量图像分析提供了广泛的调查潜力。

黑 腹果蝇 大脑免疫染色对于探索复杂行为、神经回路和蛋白质表达模式背后的机制至关重要。传统方法通常涉及挑战，例如在高分辨率成像过程中进行复杂的解剖、保持组织完整性以及可视化特定的表达模式。我们提出了一种将冷冻切片与荧光染色和免疫染色相结合的优化方案。这种方法改善了组织保存和信号清晰度，并减少了果蝇脑成像对费力解剖的需求。该方法需要快速解剖、最佳固定、冷冻保护和冷冻切片，然后进行荧光染色和免疫染色。该方案可显著减少组织损伤，增强抗体渗透性，并产生清晰、清晰的图像。我们通过高保真地可视化特定的神经群和突触蛋白来证明这种方法的有效性。这种通用方法允许跨多个 z 平面分析成人大脑中的各种蛋白质标志物，并且可以适用于其他组织和模式生物。该方案为研究人员在果蝇神经生物学研究中进行高质量免疫组织化学提供了一种可靠且高效的工具。该方法的详细可视化有助于对神经解剖学、病理学和蛋白质定位进行全面分析，使其在神经科学研究中特别有价值。

从社交互动¹ （Social interactions）、感官知觉和处理 2 （sensory perception and processing^）、学习 3 （learning^） 到运动⁴ （movement） 的复杂行为都是由大脑驱动的。神经系统疾病也越来越普遍，预计会随着时间的推移而增加 ^5,6。研究大脑在健康和疾病中的工作原理至关重要。分子生物学的中心法则表明，生物单位最重要的功能之一是蛋白质⁷，它们的表达量和表达位置对于理解大脑的工作原理都至关重要。

黑腹果蝇，俗称果蝇，是研究衰老和病理生理条件下大脑功能的重要模型⁸。果蝇中先进的遗传工具使研究人员能够探索几乎任何蛋白质的功能⁹，几乎所有基因的综合遗传文库都很容易获得¹⁰。再加上其寿命短、繁殖率高，这些特征使果蝇成为大脑研究的特殊模型¹¹。这带来了重大成就，包括开发了苍蝇¹² 的完整大脑图谱，甚至因阐明昼夜节律和分子钟的神经元机制而获得诺贝尔奖 13,14,15。因此，果蝇仍然是一个强大且用途广泛的系统，推动我们对大脑功能的理解，并为神经过程提供前所未有的见解。

免疫组化和免疫荧光是原位研究蛋白质表达的基础工具。与蛋白质印迹法等仅允许半定量分析且通常在大量组织中进行的技术¹⁶ 或复杂且昂贵的技术（如质谱法）测量蛋白质水平¹⁷ 相比，免疫组织化学相对简单，既可以定量蛋白质表达，也可以测量蛋白质在组织或细胞内的定位。重要的是，荧光免疫组化也可以进行多重检测，以测量多种蛋白质，以识别特定细胞类型和组织或回答同一组织中的多个问题。此外，组织固定可以允许在不同的实验条件、基因型、年龄和昼夜节律时间点之间进行比较。然而，荧光免疫组化可能具有挑战性，并且许多因素会影响图像质量。这种针对果蝇大脑的优化冷冻切片和免疫染色方案旨在通过改善组织保存、抗体渗透以及神经群体和蛋白质标志物的可视化来增强高分辨率成像。为解决传统方法中的挑战而开发，例如复杂的解剖、组织损伤和与全脑支架相关的有限成像分辨率¹⁸.该方案将冷冻切片与荧光染色相结合，以确保结构完整性和跨多个 z 平面的清晰成像。与整装制剂相比，这种方法可最大限度地减少变形，促进更深的抗体扩散，并提供清晰的神经解剖学和蛋白质定位分析¹⁸。它的多功能性允许适应其他组织和模式生物，为神经科学研究提供可靠和高效的工具^19,20。它可以适应观察几乎任何蛋白质，并应用于研究任何病症、疾病或模型。

1. 设备准备

1. 确保低温恒温器已通电并设置为 -20 °C。 打开玻片加热器或小型培养箱的电源，确保其设置为 37 °C。
   注意：在此阶段，可以将标记的载玻片放在加热器或培养箱上，并无限期放置直到切片。

2. 溶液的制备

1. 从 10x PBS 原液中制备 50 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS），pH 7.4。制备 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，最终体积为 10 mL。
2. 在喷雾瓶中制备 70% 乙醇水溶液的清洁溶液。制备封闭溶液（来自 20x 原液的 Tris 缓冲盐水中的 3% 牛血清白蛋白 （BSA））。制备一抗溶液（稀释度取决于实验）。此处使用 ApoE 小鼠抗体在 3% BSA 的 TBS 溶液中按 1：250 的稀释度。
3. 制备二抗溶液（稀释度取决于实验）。在这里，使用 Alexa Flour 750 A21037 山羊抗小鼠二抗在 TBS 中的 3% BSA 的 1：500 稀释液。
4. 制备荧光染色溶液（稀释度取决于实验）。在这里，制备了 5 μg/mL 的 PBS 中尼罗红溶液。
   注意：所有溶液，尤其是荧光液，都应冷藏并储存在黑暗的冷藏容器中。它们也应在使用前加热至室温。

3. 组织收集

1. 在老化小瓶中取出果蝇后，打开 CO₂ 垫上的阀门，将果蝇快速倒在垫子上，以避免逃逸。等待苍蝇大部分失去知觉，停止大部分活动。通过将垫子移动到物镜下方，将苍蝇定位在 SZ61 显微镜下方。调整放大倍率和焦距，使苍蝇清晰可见且易于斩首。
   注意：本例中使用的果蝇是 ELAV/+ 和 ELAV>ApoE4
2. 在胸部和头部之间插入弹簧剪刀，用力挤压，每个实验组斩首 5 至 10 个苍蝇头。将未使用的果蝇放回其老化的小瓶中。
   注意：如果担心固定剂的渗透性，可以在头部后部做一个小切口，以增加步骤 4.1 中固定剂的渗透。
3. 使用刷子，将磁头轻轻放入冰上标记的 1.5 mL 试管中，直到收集到 ELAV/+ 和 ELAV>ApoE4 组。

4. 固定整个组织

1. 从冰中取出试管，将 100 μL 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液移液到每个试管中，确保所有头部都浸没在溶液中。如果头部粘附在管壁上并避免与溶液接触，请使用刷子轻轻将它们向下推或轻轻敲击水平表面以确保适当接触。
2. 置于使用中等设置的轨道振荡器上 15 分钟。15 分钟后，弃去多聚甲醛溶液，用 1x PBS 替换 10 分钟，确保所有头都浸没在溶液中。
3. 每次丢弃先前的溶液，用 PBS 洗涤组织 2 次，每次 10 分钟，总共洗涤 3 次。
4. 最后一次洗涤后，将头部转移到 PBS 溶液中的 10% 蔗糖中，确保头部浸没在管内。将这些放置过夜以获得最佳饱和度。
   注意：如果需要当天成像，可以减少蔗糖输注;然而，冷冻保护剂的效果也将按比例降低。

5. 模具准备

1. 用最佳切割温度 （OCT） 化合物填充标记的模具大约 50%，使其扩散到模具的所有 4 个角。
2. 使用刷子，小心地将头部放在模具内的 OCT 表面上。将多个实验组放入同一个模具中时，请确保这些组在模具内分开，以防止混淆。
   注：重要的是要防止 OCT 化合物通过刷子被先前的蔗糖溶液污染而稀释。此外，使用刷子将 OCT 深处放置会在头部周围产生许多气泡。避免这些错误，以防止以后出现切片问题。
3. 使用镊子的尖端，慢慢地将每个头推到模具底部，眼睛朝向底部。选择此方向以切割冠状平面。
4. 在此过程中，避免将头部刺穿或压碎模具底部。在 X、Y 和 Z 维度上对齐所有头部，以便每个部分同时包含所有主题。确保缓慢浸没以减少气泡的形成。
5. 一旦所有头部都正确对齐，小心地将模具直接放入 -20 °C 中冷冻。
   注意：如果在切片过程中发现头部对齐明显偏差，请考虑使用干冰或液氮对模具进行初始快速冷冻。
6. 一旦模具大部分冻结，用 OCT 填充剩余的部分，让它冻结，然后在 - 80 °C 下长期储存。

6. 模具的冷冻切片

注意：通常建议在切割实验组模具之前准备并切割一个空白模具。这样可以确保在对组织进行切片之前，轮子、刀片和防卷玻璃的正常功能。

1. 将大量 OCT 涂抹在模具上，然后将钻头放在顶部，将其压平，将卡盘钻头连接到模具上。让它在低温恒温器中完全冻结，通常在 5 分钟内。
2. 从模具中取出钻头和 OCT 块并将其放入卡盘中，确保模具从上到下保持正确定向。拧紧卡盘键，直到钻头固定。
3. 使用调节旋钮和卡盘深度控制将缸体与刀片对齐。
4. 将截面宽度设置为 20 μm。以缓慢但一致的动作切割每一片，让防滚玻璃捕捉每一片。通过将切片触摸到切片的更近边缘并让切片上升到切片上，使用加热的切片捕获切片。如果间隔适当，标准尺寸的载玻片 （25 mm x 75 mm x 1mm） 最多可以安装八个部分。
   注意：在选择要收集的部分时，需要做出选择。由于嵌入方向，早期切片将来自头部的前部，而后期切片将来自头部的后部。因此，如果对一个特定区域的兴趣大于另一个特定区域，则可以相应地调整区域选择。或者，可以将所有切片收集在多个载玻片上，直到没有组织残留。
5. 让载玻片在室温下干燥至少 30 分钟，但不超过 1 小时。

7. 染色和 IHC

注：对于该方案，该方法将详细说明使用未偶联的一抗进行 IHC。如果要同时使用荧光染料偶联抗体或其他可以在单阶段进行的荧光染色，则应与二抗一起使用。

1. 干燥期结束后，立即使用剃须刀片去除载玻片边缘的 OCT，为疏水边界留出空间。使用记号笔在每张幻灯片上绘制疏水边界。让它干燥 5 分钟。
2. 通过在载玻片顶部轻轻移液，将所有载玻片洗涤 3 次，每次 5 分钟，每次用 PBS 清洗，尽可能避免直接在组织顶部移液。
   注意：1000 μL 移液器在这里最有用。带有组织的标准尺寸载玻片应完全覆盖 750 μL 的任何溶液。也可以使用玻片架和吊篮。
3. 洗涤载玻片后，将 TBS 封闭溶液中的 3% BSA 移液到载玻片上。孵育 30 分钟。
4. 丢弃封闭溶液，将一抗溶液移液到载玻片上。在这种情况下，将 SC-13521 ApoE 在 TBS 中的 3% BSA 中以 1：250 稀释。让抗体在 4 °C 下孵育过夜或在室温下孵育 1 小时。使用湿纸巾或纸巾防止溶液在一夜之间变干。
5. 弃去一抗，使用移液管，用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
6. 添加二抗溶液。在这种情况下，AF 750 山羊抗小鼠抗体的 1：500 稀释液以及 5 μg/mL 浓度的尼罗红，全部溶于 3% BSA 的 TBS 溶液中。在室温下孵育 1 小时。
   注：我们在同一缓冲液中同时孵育荧光染色剂和二抗，即 TBS 中的 3% BSA。只要两种试剂之间没有已知的冲突，这是首选。如果存在冲突，请单独孵育并在孵育之间额外进行 3 次洗涤。
7. 用 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。最后一次洗涤后，在载玻片上留下少量 PBS。

8. 成像的安装和准备

1. 使用 1000 μL 移液器，加入 3-5 滴含有 DAPI （0.9 μg/ml） 的硬化封固剂，均匀地滴在载玻片上，避免直接滴在组织上。
2. 将盖玻片放在载玻片上，避免形成任何气泡。
   注意：使用镊子可以帮助解决这个问题，方法是让盖玻片在最终释放之前滑到靠近载玻片表面的位置。
3. 小心处理新安装的玻片，并将其平放存放直至完全干燥。如果预计会长期储存，请使用指甲油密封载玻片。
4. 尽快捕获图像以避免荧光衰减。

9. 图像采集

注：对于图像采集，将详细介绍 Olympus Cell Sense Dimensions 软件的使用。

1. 成像前，检查载玻片并使用 70% 乙醇水溶液擦拭。如果载玻片在封片后立即成像，请在清洁时格外小心，以免干扰盖玻片。成像前，让载玻片和盖玻片的表面干燥 5 分钟。
2. 选择每个需要捕获的通道，在本例中为 DAPI、Nile Red 和 AF 750 的通道。
   1. 如下所述选择所需的放大倍率。放大倍率的选择取决于实验;在这里，使用 10 倍放大倍率。
      注意：所有放大倍率均可用，包括油性镜头。如果需要，将浸油涂抹在载玻片表面。
   2. 对于每个通道，根据实验中最亮的荧光对象校准适当的曝光时间。避免过度曝光，同时生成尽可能明亮的图像。
      注意：一般来说，过程捕获不佳的两个主要决定因素是过度曝光，导致清晰度丢失，以及背景信号过多，很难与真实信号区分开来。此外，必须为所使用的每个唯一放大倍率单独设置曝光。
   3. 选择要保存的文件夹，并在菜单中为合并的图像命名。捕获后，所有图像都将位于此文件夹中，并带有此处定义的名称。
   4. 首先聚焦于通道中允许最佳焦点的主体，然后开始采集来捕捉图像。保持在同一通道中关注每个主题的程序，以实现整个实验的一致性。
   5. 捕获所有实验组，用于同一天的后续比较，以避免比较组之间的荧光衰减。

10. 定量

注：可以使用各种软件进行定量。这里引用了 Olympus CellSense Dimensions 的使用。

1. 在集合之后，查看图像。从 quantification 文件夹中删除具有缺陷或剖切伪影的截面。选择反映量化目标的图像。瑕疵的示例包括气泡、撕裂的切片、重叠的组织以及灰尘或碎屑。
   1. 要选择合适的图像，请确保使用所有以脑组织为特色的图像进行量化，以反映整个大脑的整体表达。或者，使用仅反映前脑、中脑或后脑的图像来深入了解这些区域的表达差异。
2. 在 count 和 measure 菜单中，确定感兴趣的参数及其边界，以便量化图像。
   1. 为了通过平均强度值比较来量化 ApoE 表达，请选择阈值，以便考虑该通道的所有像素（0-无穷大）。此外，使用可用的绘图工具勾勒出感兴趣区域的轮廓。
3. 对所有文件批量运行计数和测量，或单独对每个图像运行计数和测量。
   1. 对于批处理，请记录量化的设置和执行情况，然后选择要执行量化的文件夹。批量处理可通过宏管理器选项卡访问，并大大加快工作流程。
4. 将数据表导出到电子表格以进行绘图。为此，请使用 count and measure results 菜单，同时在批处理执行时自动打开或导出到表。这些数据表将包含在步骤 10.2 中选择的所有选定参数。
5. 对于统计分析和绘图，请直接使用电子表格或通过其他软件绘制数据。熟悉所选软件是准确表示实验结果的关键。在这里，将突变体大脑中 ApoE 表达的绝对强度值标准化为对照，然后使用 GraphPad Prism 绘制。

上述方法允许对成蝇大脑进行可靠的荧光成像，而无需繁琐的解剖。如图 1 所示，该方法简单明了，如果所有样品、设备和材料都可用，则可以快速执行。或者，在 OCT 模具阶段使用 -80 °C 储存，样品可以保存以备数周后使用。研究人员不需要经过长时间的培训即可学习简单的解剖和嵌入技术，这使得这种方法很容易上手。

使用这种方法进行的荧光显微镜检查的示例如图 2A-D 所示。抗体标签 （ApoE） 和荧光染色剂 （Nile Red） 的表达都非常明确。此外，还可以看到脑组织的高度完整性。可以使用常见的图像处理软件功能（如反卷积）进一步澄清图像，这也显示在面板图 2A'-D' 中。反卷积可用于提高清晰度和对比度以及减少杂色。

关于图像的量化，所有图像都可以根据标准参数进行量化，例如物体数量、平均物体面积、强度和面积分数。定量的局限性确实取决于所选软件，但通常，上面列出的参数允许进行充分的研究，并且在大多数应用中都可用。 图 3 展示了由多个图像的大脑区域内的平均强度值生成的直方图。这有助于可视化给定基因型的平均大脑强度。在本例中为 ELAV/+ 和 ELAV>ApoE4。

图 1：果蝇脑切片和成像的工作流程。 1. 果蝇头部是用细剪刀斩首收集的。2. 固定后，将收集的头部用 OCT 包埋在模具中并冷冻切片以获得薄脑切片。3. 脑切片用一抗或荧光染色进行免疫组织化学 （IHC） 染色。4. 染色后，用盖玻片封片，并在 4 °C 下避光储存以保持荧光完整性。5. 使用荧光显微镜观察脑切片以研究目标蛋白质或细胞结构。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：冷冻切片头的免疫组织化学和荧光染色。（A-D）7 周龄雌性苍蝇头的代表性图像，用于 ApoE 表达、脂质（尼罗红）和 DAPI 染色。这些图像显示了人 ApoE4 （Elav>ApoE4） 的表达，而对照果蝇 Elav/+ 缺乏这种 ApoE 表达。用尼罗红（Elav>ApoE4 和 Elav/+）进行脂质染色。使用这种方法的脑组织完整性也在这里得到证明。（A'-D'）这些表示反卷积后的 A、B、C 和 D。请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：ApoE 的相对定量。 显示了 7 周龄 果蝇 大脑中 ApoE 蛋白表达的定量结果。收集 Elav/+ 和 Elav>ApoE4 突变受试者的强度绝对值，然后归一化为 Elav/+。Elav>ApoE4 和 Elav/+ 之间的统计学显著性是显而易见的。 请单击此处查看此图的较大版本。

在这里，我们提出了一种对冷冻切片 果蝇 头部进行精确荧光成像的方案。这是一种简单的方法，但有几个重要的优点。也就是说，这些方法非常简单，任何接受过基本实验室安全培训的人都可以完成，它们适用于测量存在高质量抗体的任何蛋白质的表达，并且它们允许精确测量目标蛋白质的表达量以及该表达在整个头部的位置。如果组织和图像质量足够高，则有可能允许对整个 果蝇 头部的表达进行 3D 映射。

与分离大脑进行成像结合共聚焦显微镜的技术挑战性方法相比，该方案允许对整个果蝇头部进行成像，而不仅仅是大脑。鉴于果蝇视觉系统是神经元功能的重要模型²¹，但其中一些结构可能会在大脑隔离期间丢失，这一点尤其重要。它还提供切片内对照组织，例如喙的肌肉，以确定目标蛋白质的表达是否对某些细胞类型或组织类型具有特异性²²。这允许在组织之间进行直接比较，而不是使用可能受到条件细微差异影响的单独切片。该协议使用果蝇作为模型系统的另一个优势是苍蝇头非常小^19,20，因此可以进行相对高含量的荧光成像。我们已经能够在一个区块中放置超过 50 个头。由于可以将 8 个切片放置在行业标准尺寸的载玻片上，因此 1 张载玻片每个载玻片可以包含 8 个独特的切片，总共有 400 个独特的切片。重要的是，所有切片都经过相同的实验条件和时间点，以便在组间比较时实现高度的完整性。此外，该协议只需要使用标准荧光显微镜而不是共聚焦显微镜，这对于缺乏高额财政支持并允许更广泛地获得这种成像的实验室或机构来说可能成本高昂。

该方案的一个关键限制是免疫染色固有的，即在优化抗体时使用高质量抗体和适当的对照很重要。验证抗体是否具有选择性和对目标蛋白质敏感至关重要，因为经常存在脱靶染色，这可能导致难以确定荧光信号是否真实。为此，请同时检测一抗和二抗。幸运的是，由于 果蝇中很容易获得的遗传工具，因此这样做很简单。为了验证一抗的质量，我们建议使用野生型果蝇和实验果蝇以及过表达目标蛋白的阳性对照果蝇和基因敲除或敲低的阴性对照果蝇来完成实验步骤。这些对照组将确定表达水平范围和预期荧光，作为评估实验果蝇在该光谱中的位置的参考点。测试一抗的多个稀释度至关重要，因为太少会导致染色质量差，在存在蛋白质的地方不会导致在背景之上发出荧光，而抗体过多会导致在没有蛋白质的地方出现脱靶染色。这种多重稀释方法应包括一个没有一抗的组，这将验证二抗的质量，因为只有当有背景荧光时，该组才会有荧光，并提供额外的阴性对照组，显示二抗的荧光检测限。如果需要，使用不同的孵育条件，即时间或温度，以最大限度地提高最终图像的信噪比。我们重申，高质量的抗体以及高质量的组织对于高质量的免疫荧光成像至关重要。

总而言之，免疫荧光成像是更广泛地研究生物学和更具体地研究神经科学的强大工具。这与 果蝇 中强大的遗传工具相结合，有可能揭示蛋白质如何影响健康和疾病的重要知识。果蝇脑对于发现人脑如何运作非常重要，并将继续这样做。由于我们在此处描述的方案的适应性，几乎任何蛋白质（或脂质）在头部中的作用都可以在任何疾病或病症的背景下进行研究，仅受抗体质量的限制。因此，免疫荧光成像对于未来研究大脑的工作原理可能至关重要，并将对人类健康和治疗发展产生重大影响。

作者没有什么可披露的。

我们感谢 Melkani 实验室的成员为制定方案提供的宝贵反馈。苍蝇库存 Elav-Gal4 （BL#458） 和 UAS-ApoE4 （BL#76607） 购自布卢明顿果蝇库存中心（美国印第安纳州布卢明顿）。这项工作得到了美国国立卫生研究院 （NIH） 对 G.C.M AG065992 和 RF1NS133378 的资助。这项工作也得到了 UAB Startup funds 3123226 and 3123227 to G.C.M. 的支持。