يبحث مختبرنا في التنظيم المكاني والزماني ل AMP الدوري لفهم الظروف التي تؤدي إلى أحداث محددة في اتجاه مجرى النهر. لتقليد التنشيط تحت الخلوي وتثبيط إشارات AMP الدورية بشكل فعال ، نميز توزيع أداة بصرية وراثية تسمى bPAC-nanoluciferase. لاختبار صلاحية نماذج إشارات AMP الدورية الحالية ، قمنا بتطوير أدوات لتقييم إشارات AMP الدورية وتقليدها وحظرها من الأجزاء تحت الخلوية في الخلايا الحية.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحفيز وتقييم توزيع ووظيفة الأدوات البصرية الوراثية بطريقة منهجية. حسنا ، كان هدفنا هو اختبار ما إذا كانت عملية ضوء التركيز يمكن أن تنشط بدقة البروتينات البصرية الوراثية في مناطق خلوية معينة ، وبالتالي تجنب التأثير على البروتينات المحيطة. ستكون هذه الطريقة حيوية لدراسة البروتينات ذات التوزيعات المنتشرة أو إذا كان التأثير المقصود هو توليد زيادات موضعية في AMP الدوري أو جزيئات الإشارات الأخرى.
في التجارب البصرية الوراثية ، يتضمن النهج النموذجي تحفيز حقل كامل من الخلايا أو في بعض الأحيان مناطق مخصصة أصغر. ومع ذلك ، فإن اختيار هذه المنطقة وشدتها غالبا ما يكون تعسفيا. يمكن نهجنا المنهجي الباحثين من إجراء تجارب أكثر دقة ، مما يساعد على تقليد أنماط مسارات الإشارات.
في هذه الدراسة ، استخدم الخلايا المنقولة بشكل مشترك مع مستشعر AMP الدوري المستهدف نووي وبروتين بصري مستهدف نووية ، NLS-bPAC-nanoluciferase. استزراع ومعالجة الخلايا التي تعبر عن bPAC النووي في بيئة مظلمة. استخدم مصباح آمن أحمر لتجنب التعرض لأطوال موجية أقل من 500 نانومتر.
قم بإجراء تجارب التصوير في مجهر آلي ذو طابقين مزود بمحرك ضوئي متعدد LED ، وعجلة مرشح انبعاث ، ومرحلة XY آلية ، وكاميرا ORCA-Fusion Digital CMOS ، وهدف زيت تكبير 100x بفتحة عددية 1.4. لالتقاط الصور ، استخدم برنامج الفحص المجهري الرقمي. هذا الإعداد قادر على تحفيز الخلايا وإجراء قياسات FRET في وقت واحد باستخدام مسار ضوئي مستقل مزود بمرشح ثنائي اللون ZT458rdc.
بعد تشغيل النظام الجغرافي UGA-42 وليزر LDI-7 ، قم بتشغيل المجهر لإعداده بشكل مناسب للحصول على البيانات باستخدام مستشعر H208 FRET. بعد ذلك ، افتح برنامج التصوير وبرنامج SysCon الذي يتحكم في المجهر بالتتابع. لمعايرة النظام قبل كل استخدام، انتقل إلى نافذة الكاميرا وحدد علامة التبويب معايرة.
اضبط الطول الموجي لليزر المتوافق مع البروتين البصري الوراثي. اختر 445 نانومتر لتحفيز bPAC-nanoluciferase. حدد علامة التبويب الكاميرا وانقر فوق بدء الاستحواذ لبدء الاستحواذ من برنامج التصوير.
حدد علامة التبويب معايرة مرة أخرى. انقر فوق الزر بدء المعايرة. في القائمة المنسدلة التي تظهر، حدد وضع المعايرة المناسب.
اتبع خطوات المعايرة المشار إليها من قبل الشركة المصنعة. إذا لزم الأمر، قم بتغيير إعدادات برنامج التصوير لإجراء المعايرة المناسبة. تأكد من إجراء المعايرة على منطقة خالية من الخلايا من العينة.
بعد ذلك ، باستخدام برنامج التصوير ، احصل على صورة مضان واحدة. ستظهر خلايا الفلورسنت في نافذة عارض الصور. ضع الخلية التي سيتم تحفيزها باستخدام أدوات التحكم في المجهر XY داخل منطقة التأثير ، ويفضل أن يكون ذلك في مركزها.
قبل بدء التجربة الفعلية، استخدم وضع النقر وإطلاق النار لتقييم استجابة خلية فردية بسرعة. في نافذة المخطط الزمني، اضبط معلمات تحفيز الخلية، بما في ذلك مصدر الضوء ومدته وشدة المنبه. في نافذة عارض الصور ، انقر تقريبا على منتصف الخلية وقم بتقييم الاستجابة.
في نافذة عارض الصور ، حدد الرمز الدائري في شريط الأدوات الموجود على اليسار ، وفي القائمة المنسدلة ، انقر فوق مملوءة لرسم كائنات تحفيز دائرية مملوءة. كرر هذه الخطوة لإنشاء دوائر متطابقة متعددة وتوزيعها بالتساوي ، مما يضمن تغطية متجانسة للسيتوبلازم الكامل للخلية المراد تحفيزها. في نافذة عارض الصور، انقر فوق أيقونة مؤشر الماوس على اليسار، ثم انقر بزر الماوس الأيمن فوق أحد كائنات التحفيز للتحقق من خصائصه وتحريرها.
بدلا من ذلك، حدد جميع كائنات التحفيز المرسومة، ثم انقر بزر الماوس الأيمن لتحرير خصائص جميع كائنات التحفيز المحددة معا. في النافذة الفرعية عرض، انقر فوق الزر Snap to Grid. يمكن أن تساعد هذه الشبكة في الحفاظ على تباعد ومحاذاة الدوائر بشكل متساو لتشكيل مصفوفة أو مصفوفة مناسبة.
بالإضافة إلى ذلك ، قم بتخصيص خصائص الشبكة باستخدام زر تعيين الشبكة. وزع كائنات التحفيز بالتساوي بمساعدة الشبكة. أضف المزيد من كائنات التحفيز إذا لزم الأمر لتغطية الخلية بأكملها.
تأكد من أن جميعها لها نفس الخصائص. سيكون كل كائن تحفيز تم إنشاؤه مسبقا في نافذة Image Viewer موجودا في نافذة المخطط الزمني ، حيث يمكن للمرء تحرير مجموعة مختلفة من الخصائص ، بما في ذلك وقت البدء والمدة والتأخير والكثافة والمزيد. لتصور كائنات التحفيز بشكل صحيح ، قم أولا بتوسيع نافذة المخطط الزمني.
الآن ، يمكن للمرء أن يرى الخصائص الزمنية لكائنات التحفيز في نافذة المخطط الزمني. حدد جميع كائنات التحفيز وقم بتحرير تأخيرها ومدتها في النافذة الفرعية توقيت الكائن. في النافذة الفرعية Lightsource، قم بتكوين الأطوال الموجية للكائن وشدته.
ضمان الطول الموجي والشدة المتطابقين للجميع. لمنع فرض تأثير اثنين أو أكثر من التحفيز ، قم بتعيين أوقات بدء مختلفة لكل كائن أو قم بتغيير التأخير بينهما اعتمادا على النتيجة المتوقعة. بعد ذلك ، في نافذة المخطط الزمني ، قم بتغيير التسلسل الذي سيتم فيه تنشيط كل كائن تحفيز إذا لزم الأمر.
قم بتكوين تسلسل المحفزات بنمط منتظم أو عشوائي حسب التجربة. بعد تحميل التسلسل إلى النظام ، قم بتكوين عدد دورات التسلسل أو عمليات التشغيل التي سيقوم بها النظام في النافذة الفرعية للتسلسل. لقياس التغيرات الفلورية للخلية المحفزة ، ضع مناطق الاهتمام في برنامج التصوير في المواضع المطلوبة.
ابدأ في الحصول على صور الفلورة. أخيرا ، اضغط على تشغيل في نافذة UGA-42 لبدء تحفيز الخلايا. راقب حزم التحفيز الفعلية التي يمكن أن تلتقطها الكاميرا أيضا وارتباطها بكائنات التحفيز.
لاحظ التغير في شدة التتبع الأخضر فقط ، والذي يوضح الزيادة في تركيز AMP الدوري الذي يقاس بواسطة المستشعر. يحدث هذا على وجه التحديد عندما يصل الشعاع إلى جزء من الخلية بأقل قدر من bPAC-nanoluciferase. تم استخدام مضان YFP ل H208 لتحديد موضع النواة.
تم استخدام منطقة ذات أهمية تغطي النواة بأكملها لقياس التغيرات في نسبة FRET لمستشعر H208 بسبب التحفيز في البقع الزرقاء المشار إليها. كشف هذا أن الزيادات العابرة في AMP الدوري حدثت فقط عندما تم توجيه الضوء الأزرق إلى المناطق التي تحتوي على bPAC-nanoluciferase. وأكد ذلك أن bPAC-nanoluciferase المستهدف نوويا تم التعبير عنه حصريا في الحجرة النووية لخلايا HC-1.
