يقدم هذا البروتوكول طريقة سريعة نسبيا وفعالة من حيث التكلفة ، بالإضافة إلى اكتساب وتحليل آلي وبالتالي ينتج عنه فحص منخفض الحساسية ل 5-Methylcytosine وهو علامة حيوية جينية شائعة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي المرونة التي توفرها تصميما تجريبيا يمكن للمستخدمين تحسينه لنموذجهم ومرحلة التطوير. يمكن استخدام هذه التقنية للكشف عن كيفية تغيير التعرض الكيميائي للوفرة النسبية ل 5-Methylcytosine داخل كائن حي نام والذي لا يمكن القيام به عادة إلا من خلال طرق trpA عالية التكلفة مثل التسلسل.
هذه الطريقة مفيدة لأي بحث يهدف إلى استخدام طرق NCG لفهم التغيرات اللاجينية ل 5-Methylcytosine استجابة للمحفزات البيئية. ابدأ بإعداد محلول تعرض جديد في صباح يوم التجميع. أضف خمسة ملليلتر من ماء النظام الخالي من الجسيمات إلى طبق بتري زجاجي 60 ملم.
ثم استخدم ماصة زجاجية شعرية صغيرة سعة 10 ميكرولتر لنقل 10 ميكرولتر من محلول ثنائي ميثيل سلفوكسيد أو محلول مخزون كيميائي إلى مياه النظام. حرك طبق بتري الزجاجي لضمان تبدد محلول المخزون. أضف خمسة ملليلتر أخرى من ماء النظام إلى طبق بتري الزجاجي وقم بتدوير الطبق لتجانس محلول التعرض.
قم بتغطية الأطباق الزجاجية بأغطية زجاجية لتقليل التبخر. بعد ذلك ، استخدم زجاجة بخ مملوءة بالماء RO لنقل الأجنة من شبكة السمك إلى طبق 100 ملم. فرز 50 جنينا حيا بشكل عشوائي بعد 0.75 ساعة من الإخصاب وإزالة الماء الزائد من التناضح العكسي.
بعد انتهاء مدة التعرض ، قم بإزالة الأجنة من الحاضنة. نقل جميع الأجنة الحية إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر. نضح محلول التعرض المتبقي دون استنشاق أي أجنة.
أضف 500 ميكرولتر من بارافورمالدهيد المبرد بنسبة 4٪ واخلط الأجنة عن طريق الانقلاب عدة مرات. اسمح للأجنة بالإصلاح و 4٪ بارافورمالدهيد طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد تثبيت الأجنة ، قم بشفط 4٪ بارافورمالدهيد ، وأعد إنفاق الأجنة في 1X PBS ، واخلطها عن طريق ماصة لطيفة لمدة 30 ثانية.
باستخدام ماصة زجاجية ، انقل الأجنة الثابتة بعناية إلى طبق زجاجي مملوء بالماء RO. حرك بلطف لمدة 30 ثانية وكرر هذا الغسيل مرة واحدة. تحت المجهر ستيريو تعيين في خمس مرات التكبير تزيين الأجنة باستخدام الإبر حقنة.
باستخدام طرف الإبرة ، قم بثقب المشيم وقشره برفق بعيدا عن صفار البيض وكتلة الخلية. بعد تزيين الأجنة ، استخدم ماصة شعرية زجاجية دقيقة لنقل ما يصل إلى 25 جنينا سليما إلى سلة واحدة للكيمياء المناعية. ضع سلة IHC في طبق 24 بئر.
ثم استنشاق الماء من كل بئر. أعد تعليق الأجنة في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل بئر ، لف اللوحة بورق الألمنيوم ورقائق الألومنيوم لحمايتها من الضوء. احتضان اللوحة عند أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات على شاكر مداري عند 100 دورة في الدقيقة.
بعد الحضانة ، استنشاق المخزن المؤقت للحجب من كل بئر. استبدله ب 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي. تذكر أن تحتضن مجموعة فرعية من أجنة التحكم في السيارة باستخدام المخزن المؤقت للحجب لحساب ضوضاء الخلفية.
أعد لف اللوحة و paraform ورقائق الألومنيوم واترك اللوحة تحضن عند أربع درجات مئوية طوال الليل على شاكر مداري. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي من كل بئر واستبدله ب 1x PBST. اغسل كل بئر ثلاث مرات باستخدام 1x PBST لمدة خمس دقائق لكل غسلة على شاكر مدالي.
قم بشفط 1x PBST من كل بئر وضع سلة IHC في طبق بتري زجاجي مملوء بماء RO. تحت مجهر ستيريو قياسي ، قم بفرز الأجنة السليمة بشكل عشوائي في لوحة بئر 96 لضمان جنين واحد لكل بئر. ثم قم بإزالة جميع مياه RO من الآبار الفردية وأضف 200 ميكرولتر من 1x PBS.
الطرد المركزي لوحة لمدة ثلاث دقائق في واحد G.Image الأجنة مع هدف مرتين تحت الضوء المرسل و FITC. حدد التركيز البؤري التلقائي للتأكد من أن تركيز الكاميرا على الجزء السفلي من اللوحة ويقابله سمك القاع. حدد طولا موجيا ل FITC مع مدة تعريض تبلغ 100 مللي ثانية واضبط التركيز التلقائي على الليزر باستخدام إزاحة Z.
مراقبة وتأكيد الحصول على الصورة المناسبة والعديد من الآبار قبل البدء في الحصول على اللوحة. بعد الحصول على الصور ، قم بإجراء تحليل البيانات باستخدام نظام فحص المحتوى العالي وإجراء تحليل الصور الآلي المخصص. حدد كل جنين على لوحة البئر 96 ليتم تحليلها للمساحة الكلية والكثافة المتكاملة للتألق.
ثم قم بجدولة نقاط البيانات وتصديرها من نظام فحص المحتوى العالي بالانتقال إلى القياس وتحديد سجل البيانات المفتوح لتصدير البيانات إلى جدول بيانات. قم بتحميل جدول البيانات الذي تم تصديره إلى حزمة الموزع لفرز البيانات وتلخيصها لكل بئر والتصفية حسب رقم البئر. ثم استخدم حزمة Excel الصحيحة لتصدير البيانات المجمعة إلى جدول بيانات.
تم تقييم التوزيع والشدة المتكاملة للمنطقة الكلية المحددة ل 5-Methylcytosine لأجنة الزرد بعد ست ساعات من الإخصاب. يظهر المحور السيني التعرض إما ل DMSO كمركبة أو TDCIPP كعنصر تحكم إيجابي. يشير المحور Y إلى التألق النسبي.
كانت العتبات مختلفة بشكل كبير عن الأجنة المعالجة بالمركبة كما هو موضح في المساحة الإجمالية ل 5-Methylcytosine المكتشفة داخل الأجنة والشدة المتكاملة داخل نفس المنطقة التي تشير إلى أقصى نسبة إشارة إلى الضوضاء. من المهم للغاية الحفاظ على سلامة النير وكتلة الخلية للكشف السليم عن IHC. هذه الطريقة غير حساسة نسبيا ولا تقدم سوى وفرة نسبية لبيانات RFU.
إذا كان القياس الكمي مطلوبا ، فيمكن للمرء المتابعة بنهج أكثر استهدافا.
