Este protocolo ofrece un método relativamente rápido y rentable, así como una adquisición y análisis automatizados, lo que produce un cribado de baja sensibilidad de la 5-metilcitosina, que es un biomarcador epigenético común. La principal ventaja de esta técnica radica en la flexibilidad que ofrece un diseño experimental que los usuarios pueden optimizar a su modelo y etapa de desarrollo. Esta técnica se puede utilizar para detectar cómo la exposición química altera la abundancia relativa de 5-metilcitosina dentro de un organismo en desarrollo, lo que normalmente solo podría hacerse a través de costosos métodos de alta trpA, como la secuenciación.
Este método es útil para cualquier investigación que tenga como objetivo utilizar métodos NCG para comprender las alteraciones epigenéticas de la 5-metilcitosina en respuesta a estímulos ambientales. Comience preparando una solución de exposición fresca en la mañana de la recolección. Agregue cinco mililitros de agua libre de partículas al sistema a una placa de Petri de vidrio de 60 milímetros.
Luego use una pipeta de vidrio microcapilar de 10 microlitros para transferir 10 microlitros de dimetilsulfóxido o solución madre química al agua del sistema. Agite la placa de Petri de vidrio para asegurarse de que la solución madre se disipe. Agregue otros cinco mililitros de agua del sistema a la placa de Petri de vidrio y agite el plato para homogeneizar la solución de exposición.
Tapa los platos de vidrio con tapas de vidrio para minimizar la evaporación. A continuación, use una botella de chorro llena de agua RO para transferir los embriones de la red de pescado a un plato de 100 milímetros. Clasifique aleatoriamente 50 embriones vivos a las 0,75 horas posteriores a la fertilización y elimine el exceso de agua RO.
Una vez finalizada la duración de la exposición, retire los embriones de la incubadora. Transfiera todos los embriones vivos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Aspirar solución de exposición residual sin aspirar embriones.
Añadir 500 microlitros de paraformaldehído refrigerado al 4% y mezclar los embriones por inversión varias veces. Permita que los embriones se fijen y 4% de paraformaldehído durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de fijar los embriones, aspirar el 4% de paraformaldehído, volver a pasar los embriones en 1X PBS y mezclar con un pipeteo suave durante 30 segundos.
Usando una pipeta de vidrio, transfiera cuidadosamente los embriones fijos a un plato de vidrio lleno de agua RO. Agite suavemente durante 30 segundos y repita este lavado una vez. Bajo un microscopio estereoscópico configurado con un aumento cinco veces mayor, decorar los embriones con agujas de jeringa.
Con la punta de la aguja, perfore el corion y despéguelo suavemente de la yema y la masa celular. Después de que los embriones hayan sido decorados, use una pipeta microcapilar de vidrio para transferir hasta 25 embriones intactos a una cesta de inmunohistoquímica. Coloque la cesta IHC en una placa de 24 pocillos.
Luego aspire el agua de cada pozo. Resuspender los embriones en 500 microlitros de tampón de bloqueo por pozo, envolver la placa con paraforma y papel de aluminio para protegerla de la luz. Incubar la placa a cuatro grados centígrados durante cuatro horas en un agitador orbital a 100 rpm.
Después de la incubación, aspire el tampón de bloqueo de cada pocillo. Reemplácelo con 500 microlitros de solución de anticuerpos primarios. Recuerde incubar un subconjunto de embriones de control del vehículo con el búfer de bloqueo para tener en cuenta el ruido de fondo.
Vuelva a envolver la placa y la paraforma y el papel de aluminio y permita que la placa se incube a cuatro grados centígrados durante la noche en un agitador orbital. Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos primarios de cada pocillo y reemplácela con 1x PBST. Lave cada pozo tres veces con 1x PBST durante cinco minutos por lavado en una coctelera orbital.
Aspire 1x PBST de cada pocillo y coloque la canasta IHC en una placa de Petri de vidrio llena de agua RO. Bajo un microscopio estereoscópico estándar, clasifique aleatoriamente los embriones intactos en una placa de 96 pocillos asegurando un embrión por pocillo. Luego retire toda el agua RO de los pozos individuales y agregue 200 microlitros de 1x PBS.
Centrifugar la placa durante tres minutos a una G.Imagen de los embriones con un objetivo dos veces bajo luz transmitida y FITC. Seleccione el enfoque automático para asegurarse de que el enfoque de la cámara esté en la parte inferior de la placa y desplazado por el grosor inferior. Seleccione una longitud de onda FITC con una duración de exposición de 100 milisegundos y ajuste el enfoque automático al láser con un desplazamiento Z.
Observe y confirme la adquisición adecuada de imágenes y varios pozos antes de comenzar la adquisición de placas. Después de la adquisición de imágenes, realice análisis de datos utilizando el sistema de detección de alto contenido y un procedimiento de análisis de imágenes automatizado personalizado. Seleccione cada embrión en la placa de 96 pocillos para analizar el área total y la intensidad integrada de fluorescencia.
Luego tabule los puntos de datos y expórtelos desde el sistema de detección de alto contenido yendo a medir y seleccionando el registro de datos abierto para exportar los datos a una hoja de cálculo. Cargue la hoja de cálculo exportada en el paquete del implementador para ordenar y sumar los datos de cada pozo y filtrar por número de pozo. A continuación, utilice el paquete de Excel adecuado para exportar los datos sumados a una hoja de cálculo.
La distribución y la intensidad integrada del área total específica de 5-metilcitosina se evaluaron para embriones de pez cebra a las seis horas posteriores a la fertilización. El eje x muestra la exposición a DMSO como vehículo o TDCIPP como control positivo. El eje Y denota fluorescencia relativa.
Los umbrales fueron significativamente diferentes de los embriones tratados con vehículo, como lo demuestra el área total de 5-metilcitosina detectada dentro de los embriones y la intensidad integrada dentro de esa misma área que indica la relación señal / ruido máxima. Es extremadamente importante mantener la integridad del yugo y la masa celular para una detección adecuada de IHQ. Este método es relativamente insensible y solo ofrece datos RFU de abundancia relativa.
Si se requiere cuantificación, se puede hacer un seguimiento con un enfoque más específico.
