פרוטוקול זה מציע שיטה מהירה יחסית וחסכונית, כמו גם רכישה וניתוח אוטומטיים ובכך מייצר סינון ברגישות נמוכה של 5-מתילציטוזין שהוא סמן ביולוגי אפיגנטי נפוץ. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בגמישות שהיא מציעה עיצוב ניסיוני שמשתמשים יכולים לייעל למודל שלהם ולשלב הפיתוח. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לזהות כיצד חשיפה כימית משנה את השפע היחסי של 5-מתילציטוזין בתוך אורגניזם מתפתח, שבדרך כלל ניתן היה לעשות זאת רק באמצעות שיטות יקרות של trpA גבוה כגון ריצוף.
שיטה זו שימושית לכל מחקר שמטרתו להשתמש בשיטות NCG כדי להבין שינויים אפיגנטיים של 5-מתילציטוזין בתגובה לגירויים סביבתיים. התחילו בהכנת פתרון חשיפה חדש בבוקר האיסוף. הוסיפו חמישה מיליליטר של מי מערכת נטולי חלקיקים לצלחת פטרי זכוכית בקוטר 60 מילימטר.
לאחר מכן השתמש בפיפטה זכוכית מיקרו נימי של 10 מיקרוליטר כדי להעביר 10 מיקרוליטרים של דימתיל סולפוקסיד או תמיסת מלאי כימית למי המערכת. סובבו את צלחת הפטרי מזכוכית כדי להבטיח שתמיסת המלאי תתפוגג. מוסיפים עוד חמישה מיליליטר של מי מערכת לצלחת פטרי הזכוכית ומערבבים את המנה כדי להפוך את תמיסת החשיפה להומוגנית.
מכסים את כלי הזכוכית במכסי זכוכית כדי למזער את האידוי. לאחר מכן, השתמש בבקבוק שפריץ מלא במים RO כדי להעביר את העוברים מרשת הדגים לצלחת של 100 מילימטר. מיין באופן אקראי 50 עוברים חיים בשעה 0.75 שעות לאחר ההפריה והסר עודפי מים RO.
לאחר שמשך החשיפה הסתיים, הוציאו את העוברים מהאינקובטור. העבירו את כל העוברים החיים לצינור מיקרו-צנטריפוגה בקוטר 1.5 מיליליטר. שאפו פתרון חשיפה שיורי מבלי לשאוף לעוברים כלשהם.
מוסיפים 500 מיקרוליטרים של 4% paraformaldehyde מקורר ומערבבים את העוברים על ידי היפוך מספר פעמים. אפשרו לעוברים לקבע ו-4% פרפורמלדהיד למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר תיקון העוברים שואפים את 4% paraformaldehyde, regrabs את העוברים ב 1X PBS, ומערבבים על ידי pipetting עדין במשך 30 שניות.
באמצעות פיפטה מזכוכית, העבירו בזהירות עוברים קבועים לצלחת זכוכית מלאה במים של RO. יש לסובב בעדינות במשך 30 שניות ולחזור על הכביסה פעם אחת. תחת מיקרוסקופ סטריאו שנקבע בהגדלה של פי חמישה העוברים באמצעות מחטי מזרק.
בעזרת קצה המחט, מנקבים את הכוריון ומקלפים אותו בעדינות הרחק מהחלמון וממסת התא. לאחר שהעוברים עוצבו, השתמשו בפיפטה מיקרו נימי זכוכית כדי להעביר עד 25 עוברים שלמים לסל אימונוהיסטוכימיה אחד. הכניסו את סלסלת IHC לצלחת של 24 בארות.
ואז לשאוף את המים מכל באר. להשעות את העוברים ב 500 microliters של חוצץ חוסם לכל באר, לעטוף את הצלחת עם paraform ונייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור. דגרו את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות על שייקר מסלולי ב-100 סל"ד.
לאחר הדגירה, שאפו את המאגר החוסם מכל באר. החלף אותו עם 500 microliters של פתרון נוגדנים ראשוני. זכור לדגור תת-קבוצה של עוברי בקרת רכב עם המאגר החוסם כדי לקחת בחשבון רעשי רקע.
יש לעטוף מחדש את הצלחת ואת רדיד האלומיניום ולאפשר לצלחת לדגור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה על שייקר מסלולי. למחרת הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית מכל באר והחלף אותה ב- PBST אחד. יש לשטוף כל באר שלוש פעמים עם PBST אחד במשך חמש דקות לכל שטיפה על שייקר מסלולי.
שאפו 1x PBST מכל באר והניחו את סל ה- IHC בצלחת פטרי זכוכית מלאה במי RO. תחת מיקרוסקופ סטריאו סטנדרטי מיין באופן אקראי עוברים שלמים לצלחת של 96 באר המבטיחה עובר אחד לכל באר. לאחר מכן הסר את כל מי RO מבארות בודדות והוסף 200 מיקרוליטר של 1x PBS.
צנטריפוגה של הצלחת במשך שלוש דקות ב- G.Image אחד את העוברים עם מטרה כפולה תחת אור מועבר ו- FITC. בחר מיקוד אוטומטי כדי להבטיח שהמיקוד של המצלמה נמצא בתחתית הלוח ומוסט על ידי העובי התחתון. בחר אורך גל FITC עם משך חשיפה של 100 אלפיות השנייה והגדר את המיקוד האוטומטי ללייזר עם היסט Z.
שימו לב ואשרו רכישת תמונה נכונה ומספר בארות לפני תחילת רכישת הלוחות. לאחר רכישת התמונה, בצע ניתוח נתונים באמצעות מערכת סינון התוכן הגבוהה והליך ניתוח תמונה אוטומטי מותאם אישית. בחר כל עובר על לוח 96 הבאר כדי לנתח את השטח הכולל ואת עוצמת הפלואורסצנציה המשולבת.
לאחר מכן טבל את נקודות הנתונים וייצא אותן ממערכת סינון התוכן הגבוהה על ידי מעבר למדידה ובחירה ביומן נתונים פתוח כדי לייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני. העלה את הגיליון האלקטרוני המיוצא לחבילת הפריסה כדי למיין ולסכם נתונים עבור כל באר ולסנן לפי מספר באר. לאחר מכן השתמש בחבילת Excel הנכונה כדי לייצא את הנתונים המסוכמים לגיליון אלקטרוני.
ההתפלגות והעוצמה המשולבת של 5-מתילציטוזין באזור הכולל הספציפי הוערכו עבור עוברי דגי זברה בשש שעות לאחר ההפריה. ציר ה-x מציג חשיפה ל-DMSO כרכב או ל-TDCIPP כבקרה החיובית. ציר ה-Y מציין פלואורסצנטיות יחסית.
ערכי הסף היו שונים באופן משמעותי מהעוברים שטופלו ברכב כפי שמוצג על ידי השטח הכולל של 5-מתילציטוזין שזוהה בתוך העוברים והעוצמה המשולבת באותו אזור המצביעה על יחס אות מרבי לרעש. חשוב מאוד לשמור על שלמות העול ומסת התא לצורך זיהוי IHC תקין. שיטה זו היא חסרת רגישות יחסית ומציעה רק שפע יחסי של נתוני RFU.
אם נדרש כימות ניתן להמשיך בגישה ממוקדת יותר.
