يسمح لنا بروتوكولنا بدراسة كيفية تنظيم الأنسجة ، مثل العضلات الهيكلية ، لحجمها ، والذي لا يزال سؤالا رئيسيا في بيولوجيا الخلية والنمو مع آثار فسيولوجية وطبية مهمة. الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أنه يمكن ملاحظة النمو الخلوي وقياسه في الحيوانات الحية في الجسم الحي بدرجة عالية من الدقة المكانية والزمانية. يمكن أن يسلط التقدم في الفهم الأساسي لنمو العضلات المبكر الضوء على الأصول التنموية لمشاكل العضلات المبكرة ويؤدي إلى اكتشاف Novo Therapeutics للحماية من فقدان العضلات لدى كبار السن والمرضى الذين يعانون من اضطرابات هزال العضلات.
تحضير 1٪ LMA في أنبوب 1.5 ملليلتر والحفاظ عليه في كتلة حرارة 37 درجة مئوية للاستخدام المتكرر. حدد الأسماك المراد تركيبها وقم بتخدير كل سمكة بشكل عابر. لتجنب الصدمة الحرارية ، قم بإزالة aliquot LMA من كتلة الحرارة واتركه يبرد إلى أعلى الإعداد مباشرة.
خذ طبق بتري سعة 60 ملليلتر تم تغليفه بطبقة من 1٪ LMA وضعه على مسرح مجهر تشريح. انقل اليرقة باستخدام ماصة باستور بلاستيكية سعة ملليلتر واحد إلى طبق بتري مطلي بسعة 60 ملم وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط المنقول. بعد ذلك ، مع الاستمرار في استخدام ماصة باستور ، ضع بضع قطرات من LMA على الأسماك ووجه اليرقة بسرعة بالقرب من السطح العلوي ل LMA مع محورها الأمامي الخلفي والظهري البطني ضمن 10 درجات من الأفقي ، باستخدام ملقط أو إبرة زجاجية دقيقة مصقولة بالنار قبل أن تضبط LMA.
بدلا من ذلك ، استخدم ماصة باستور بلاستيكية ملليلتر واحدة. جمع اليرقات مع الحد الأدنى من وسط الأسماك ونقل اليرقات إلى aliquot من LMA المبردة. اسمح لليرقة بالغرق لمدة خمس ثوان لتصبح محاطة بالكامل ب LMA.
ثم استرجع اليرقة وانقلها في قطرة من LMA إلى طبق Petri المغطى بالأغاروس. ضع اليرقة بسرعة كما هو موضح سابقا. إذا لم يتم تركيب اليرقات بشكل صحيح أفقيا بالقرب من سطح قطرة الأغاروز وإزالتها وإعادة تضمينها ، يمكن استرداد اليرقات بسهولة عن طريق الشفط اللطيف باستخدام ماصة باستور البلاستيكية الملليلتر الواحد ويمكن إزالة LMA بلطف باستخدام مناديل كيميائية.
انتظر لمدة 10 دقائق تقريبا حتى يتم ضبط LMA. إغراق الطبق بحوالي 10 ملليلتر من وسط السمك المحتوي على تريكاين. لالتقاط أكوام متحدة البؤرة ، اترك الأسماك المثبتة ترتاح لمدة 10 دقائق على الأقل قبل المسح الضوئي ، حيث يحدث تورم الأغاروز.
قم بتحميل طبق العينة إلى مرحلة النظام البؤري. حدد موقع اليرقات وركز على السوميت المطلوب. يمكن اختيار Somite 17 بسبب سهولة توطينه بالقرب من فتحة الشرج وسهولة التصوير.
تحقق عن طريق عد السوميت من الأمام. لالتقاط صور YZ ، قم بالإعداد كما لو كنت تلتقط مكدس Z. ابدأ بتحديد النقاط العلوية والسفلية للأسماك.
يمكن التقاط كل من الجانبين الأيسر والأيمن حسب الرغبة ، مما يضمن أن جميع عمليات مسح YZ السريعة تلتقط المناطق المطلوبة. قم بتوجيه منطقة المسح الضوئي للأسماك حسب ما يسمح به برنامج confocal . ضع السمكة مع المحور الأمامي الخلفي ، بالتوازي مع محور dex للصورة والمحور الظهري البطني الموازي للمحور Y مع السوميت 17 في وسط الحقل.
ركز على مستوى متوسط المستوى في العضلة العلوية ، حيث يكون نصفي السوميت المحوري والمغناطيسي بالكامل ، جنبا إلى جنب مع العضلة الخيطية الرأسية والأفقية مرئية وتلتقط صورة XY عالية الدقة. قم بتسمية الملف واحفظ الصورة. لالتقاط صور YZ ، ارسم خطا ظهريا إلى بطنيا دقيقا عبر السوميت المختار ، عموديا على المحور الأمامي الخلفي للسمكة.
أضف موضعا أماميا خلفيا محددا، ثم قم بإجراء فحص خط مكدس Z. كرر فحص خط YZ ثلاث مرات في مواضع أمامية خلفية محددة على طول العضلة المحددة لالتقاط YZA و YZM و YZP. قم بتسمية هذه الصور وحفظها مع صورة XY ذات الصلة.
وقد أطلق على هذا البروتوكول اسم طريقة الشرائح الأربع ويمكن تحليل الصور باستخدام برنامج Zen أو ImageJ. لإنشاء غرفة تحفيز ، خذ صفيحة بئر بطول ستة × 35 ملم وقم بإنشاء فتحتين صغيرتين قطرهما أقل من خمسة ملليمترات ، بفارق سنتيمتر واحد على كل جانب من جوانب كل بئر باستخدام حديد لحام ضيق. بمجرد إنشائها ، يمكن إعادة استخدام غرفة التحفيز.
خيط زوجا من الأسلاك الفضية أو البلاتينية من خلال فتحات كل بئر. يمكن تطبيق المادة اللاصقة القابلة لإعادة الاستخدام بالقرب من الفتحات للحفاظ على الأسلاك في مكانها وضمان فصل سنتيمتر واحد بين الأسلاك. في ثلاثة أيام بعد الإخصاب ، قسم الأسماك إلى ثلاثة شروط ، التحكم في الأسماك المتوسطة ، غير النشطة وغير النشطة بالإضافة إلى الجذعية.
بالنسبة للمجموعات غير النشطة وغير النشطة بالإضافة إلى الجذعية ، قم بتخدير اليرقات في 72 ساعة بعد الإخصاب باستخدام 0.6 ملليمولار تريكاين. بالنسبة للأسماك متوسطة التحكم ، اتركها دون تخدير. تحضير 60 ملليلتر من 2 ٪ من الأغاروز في وسط الأسماك.
قم بإذابته جيدا باستخدام الميكروويف واتركه يبرد. ثم أضف التريكاين وصب ما لا يقل عن أربعة ملليلترات في كل بئر من غرفة التحفيز. أضف على الفور أمشاط مخصصة وأربعة آبار بين الأقطاب الكهربائية.
اتركي 10 دقائق حتى يضبط الجل. إزالة الأمشاط بعناية لإنشاء أربعة آبار مستطيلة. املأ كل بئر بماء تريكاين وضع يرقة واحدة مخدرة وغير نشطة بالإضافة إلى الساق في كل بئر باستخدام ماصة صغيرة ، مع وصولها الأمامي الخلفي عموديا على الأقطاب الكهربائية.
تحقق تحت المجهر الفلورسنت تشريح ما إذا كانت كل سمكة مخدرة بالكامل داخل كل غرفة جيدا. قم بتوصيل محفز كهروفسيولوجي قابل للتعديل يولد النمط بالغرفة من خلال وحدة تحكم قطبية ، باستخدام مقاطع التماسيح المتصلة بكل قطب كهربائي على جانب واحد من الغرفة. ثم تحفيز الأسماك كما هو موضح في مخطوطة النص.
تحقق بانتظام تحت المجهر للتأكد من تحفيز الأسماك. يجب أن يحفز الحافز الكهربائي انكماشا ثنائيا مرئيا وحركة طفيفة مرة واحدة كل خمس ثوان بعد المعلمات الموصوفة. بعد التحفيز ، قم بإزالة الأسماك بعناية من كل بئر عن طريق تنظيفها بلطف باستخدام ماصة بلاستيكية والعودة إلى الحاضنة في وسط أسماك طازج يحتوي على تريكاين.
صب ماء التريكاين من داخل الغرفة واستخدم الملقط لقطع وإزالة الأغاروز من كل بئر ، وشطف الآبار بماء الصنبور واتركها تجف. لتحليل حجم العضلات ، وتسمى طريقة الشرائح الأربع ، تم الحصول على صور XY و YZ لعضلة يرقات الزرد وتم حساب حجم السوميت. لوحظ وجود علاقة قوية بين طرق الشرائح الأربع والمكدس الكامل ، على الرغم من أن طريقة الشرائح الأربع أعطت تقديرا أكبر قليلا للحجم.
كشف التحليل الحجمي للعضل المجاور للسوميت 16 و 18 أن كل سوميت كان أكبر بنحو 7٪ من السوميت الذي خلفه. وكشف مزيد من التحقيق أن طريقة الشريحتين، التي تتطلب قياس YZ واحد فقط، أعطت تقديرا دقيقا بشكل معقول لحجم العضل. نمت العضلة بشكل ملحوظ في الطول ومنطقة المقطع العرضي بين يومين وخمسة أيام بعد الإخصاب ، مما أدى إلى زيادة مطردة في الحجم.
العضلات التي أصبحت غير نشطة عن طريق التريكاين المخدر بين اليوم الثالث والرابع بعد الإخصاب قد خفضت الحجم بشكل كبير ، مما يشير إلى أن نمو العضلات اليرقية كان يعتمد على النشاط. ولوحظ تباين أكبر في تقليل حجم العضل عند قياس حجم العضل في أربعة أيام بعد الإخصاب، مقارنة بقياس كل سمكة على حدة في ثلاثة وأربعة أيام بعد الإخصاب. ومع ذلك ، لم يلاحظ أي فرق كبير في حجم myotome بين طريقتي قياسات myotome.
كشف قياس عدد الألياف داخل العضلة ، وكذلك متوسط حجم الألياف ، أن النشاط يتحكم في كل من الجوانب الخلوية للنمو. تأكد من تخدير اليرقات بالكامل باستخدام التريكاين الطازج. التخدير الجزئي سيؤدي إلى نتيجة متغيرة.
كما نعلم ، تستجيب اليرقات بقوة أكبر للتحفيز الكهربائي. وقد كشفت هذه الطريقة، جنبا إلى جنب مع النسخ النهائي والتجارب الدوائية، رؤى جديدة حول كيفية تحفيز استشعار القوة للنمو في العضلات الهيكلية.
