Этот протокол предлагает относительно быстрый и экономически эффективный метод, а также автоматизированный сбор и анализ, что обеспечивает низкочувствительный скрининг 5-метилцитозина, который является распространенным эпигенетическим биомаркером. Основным преимуществом этой техники является гибкость, которую она предлагает экспериментальному дизайну, который пользователи могут оптимизировать под свою модель и стадию разработки. Этот метод может быть использован для обнаружения того, как химическое воздействие изменяет относительное содержание 5-метилцитозина в развивающемся организме, что обычно может быть сделано только с помощью дорогостоящих методов с высоким trpA, таких как секвенирование.
Этот метод полезен для любых исследований, направленных на использование методов NCG для понимания эпигенетических изменений 5-метилцитозина в ответ на стимулы окружающей среды. Начните с приготовления свежего экспозиционного раствора утром сбора. Добавьте пять миллилитров воды без частиц в 60-миллиметровую стеклянную чашку Петри.
Затем используйте 10-микролитровую микрокапиллярную стеклянную пипетку для переноса 10 микролитров диметилсульфоксида или химического раствора в системную воду. Закрутите стеклянную чашку Петри, чтобы убедиться, что запас раствора рассеивается. Добавьте еще пять миллилитров системной воды в стеклянную чашку Петри и закрутите чашку, чтобы гомогенизировать экспозиционный раствор.
Закройте стеклянную посуду стеклянными крышками, чтобы свести к минимуму испарение. Затем используйте наполненную водой бутылку для брызг, чтобы перенести эмбрионы из рыбьей сети в 100-миллиметровую посуду. Случайным образом отсортируйте 50 живых эмбрионов через 0,75 часа после оплодотворения и удалите избыток воды RO.
После того, как продолжительность воздействия закончится, удалите эмбрионы из инкубатора. Перенесите все живые эмбрионы в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. Раствор остаточного воздействия аспирата без аспирации каких-либо эмбрионов.
Добавьте 500 микролитров охлажденного 4%-го параформальдегида и несколько раз перемешайте эмбрионы путем инверсии. Дайте эмбрионам зафиксироваться и 4% параформальдегида в течение ночи при четырех градусах Цельсия. После фиксации эмбрионов аспирируют 4%-ный параформальдегид, повторно откладывают эмбрионы в 1X PBS и перемешивают путем мягкого пипетирования в течение 30 секунд.
Используя стеклянную пипетку, аккуратно перенесите неподвижные эмбрионы в стеклянную посуду, наполненную водой. Осторожно покрутите в течение 30 секунд и повторите эту стирку один раз. Под стереомикроскопом, установленным на пятикратное увеличение, декорируют эмбрионы с помощью шприцевых игл.
С помощью кончика иглы проколите хорион и аккуратно отклейте его от желтка и клеточной массы. После того, как эмбрионы были декорированы, используйте стеклянную микрокапиллярную пипетку для переноса до 25 неповрежденных эмбрионов в одну иммуногистохимическую корзину. Поместите корзину IHC в тарелку из 24 лунок.
Затем аспирируйте воду из каждой скважины. Повторно суспендируйте эмбрионы в 500 микролитрах блокирующего буфера на лунку, оберните пластину параформой и алюминиевой фольгой для защиты от света. Инкубируйте пластину при четырех градусах Цельсия в течение четырех часов на орбитальном шейкере при 100 оборотах в минуту.
После инкубации аспирируйте блокирующий буфер из каждой лунки. Замените его 500 микролитрами раствора первичного антитела. Не забудьте инкубировать подмножество эмбрионов контроля транспортного средства с блокирующим буфером для учета фонового шума.
Переверните пластину и параформу и алюминиевую фольгу и дайте пластине инкубироваться при четырех градусах Цельсия в течение ночи на орбитальном шейкере. На следующий день удаляют раствор первичного антитела из каждой лунки и заменяют его 1x PBST. Промывайте каждую лунку трижды с 1x PBST в течение пяти минут на одну промывку на орбитальном шейкере.
Аспирируйте 1x PBST из каждого колодца и поместите корзину IHC в стеклянную чашку Петри, наполненную водой обратного осмоса. Под стандартным стереомикроскопом случайным образом сортируйте неповрежденные эмбрионы в пластину из 96 лунок, обеспечивая один эмбрион на лунку. Затем удалите всю воду обратного осмоса из отдельных скважин и добавьте 200 микролитров 1x PBS.
Центрифугируйте пластину в течение трех минут на одном G.Image эмбрионы с двукратным объективом под пропускаемым светом и FITC. Выберите автофокус, чтобы убедиться, что фокус камеры находится в нижней части пластины и смещен толщиной дна. Выберите длину волны FITC с длительностью экспозиции 100 миллисекунд и установите автофокус на лазер со смещением Z.
Наблюдайте и подтверждайте правильное получение изображения и несколько скважин до начала сбора плит. После получения изображения выполните анализ данных с использованием системы скрининга высокого содержания и пользовательской автоматизированной процедуры анализа изображений. Выберите каждый эмбрион на пластине 96 скважин для анализа общей площади и интегральной интенсивности флуоресценции.
Затем сведите точки данных в таблицу и экспортируйте их из системы скрининга высокого содержания, перейдя к измерению и выбрав открытый журнал данных для экспорта данных в электронную таблицу. Загрузите экспортированную электронную таблицу в пакет deployer для сортировки и суммирования данных для каждой скважины и фильтрации по номеру скважины. Затем используйте правильный пакет Excel для экспорта суммированных данных в электронную таблицу.
Распределение и интегрированная интенсивность 5-метилцитозина удельной общей площади оценивались для эмбрионов рыбок данио через шесть часов после оплодотворения. Ось X показывает воздействие либо DMSO в качестве транспортного средства, либо TDCIPP в качестве положительного элемента управления. Ось Y обозначает относительную флуоресценцию.
Пороговые значения значительно отличались от эмбрионов, обработанных транспортным средством, о чем свидетельствует общая площадь 5-метилцитозина, обнаруженная в эмбрионах, и интегрированная интенсивность в той же области, указывающая на максимальное отношение сигнал/шум. Крайне важно поддерживать целостность хомута и клеточной массы для правильного обнаружения IHC. Этот метод относительно нечувствителен и предлагает только данные об относительном изобилии РФС.
Если требуется количественная оценка, можно использовать более целенаправленный подход.
