تسمح هذه الطريقة بتحليل نسخي لتجمُّع خلايا نادرة من غدة إكسسوارات ذكورية Drosophila، تسمى الخلايا الثانوية، وتكشف عن الجينات التي تجعلها حاسمة لنجاح الإنجاب. في غضون يوم واحد، وهذا الأسلوب يسمح فرز الخلايا الثانوية من نوع وراثي مختلف واستخراج الجيش الملكي النيبالي الكلي لتسلسل qPCR لاحق أو الجيش الملكي النيبالي. في بعض الأحيان تكون المشاريع محدودة بسبب ندرة المواد الأولية.
يمكن أن يوفر هذا الأسلوب الأساس لمجموعات أخرى تواجه التحدي المتمثل في العمل مع مجموعة خلايا نادرة. لأن الإجراء يحتاج إلى تراكم 40 الغدد, من المهم لممارسة التشريح. إعداد نصائح الماصات محلية الصنع مهم أيضا، ولذا يجب تصور ذلك على الفيديو كيفية جعله وإعداد مقدما.
قبل البدء في الإجراء، وقطع والشعلة الجولة، واسعة، نصائح 200 ميكرولتر للتعامل مع الغدد، وتمرير فتح طرف من نصائح متعددة 1، 000 microliter بالقرب من لهب لأقل من ثانية واحدة لتضييق الفتحات. ثم، فرز النصائح المعدلة من أضيق إلى أوسع استناداً إلى سرعة الطموح. لتشريح الغدة الوصول، مكان 20 إلى 25 الذكور Drosophila في طبق زجاجي على الجليد، واستخدام ملقط ومجهر تشريح لإزالة الجهاز التناسلي لذبابة ذكر واحد.
مسح الزوج غدة ملحق من جميع الأنسجة الأخرى, بما في ذلك الخصيات ومصباح القذف, ونقل الغدد الملحقات إلى لوحة زجاجية تحتوي على مصل الملحقة المتوسطة في درجة حرارة الغرفة. عندما تم جمع 20 زوجا من الغدد الملحقة، وغسل الغدد في طبق من برنامج تلفزيوني لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الغسيل، نقل الغدد إلى حل الانفصام الطازجة المعدة، واستخدام ملقط حادة تحت مجهر تشريح لقرصة بحزم منتصف الفص غدي.
باستخدام زوج من ملقط الثانية، وقطع الأنسجة مع طرف حاد لفصل المنطقة القريبة من الغدة الملحقية والقناة القذفية من جزء من الغدة التي تحتوي على خلايا ثانوية. قطع الغدد بحيث يمكن أن تصل الببتيداسيس الخلايا التي هي محمية خلاف ذلك من قبل طبقة العضلات الخارجية والسائل المنوي اللزوج في تجويف الغدة. ثم، استخدم تلميح ماصة 200 ميكرولتر قبل الرطب، لهب مدورة، واسعة، لنقل الغدد إلى أنبوب 1.5 ملليلتر.
بالنسبة لهضم الأنسجة، ضع الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة بمعدل 1000 دوران في الدقيقة. في نهاية الحضانة، ووقف الهضم مع ملليلتر واحد من مصل تكمل المتوسطة، واستخدام قبل الرطب، لهب مدورة، واسعة، 1، 000 ميكرولتر ماصة تلميح لنقل العينات إلى لوحة 24-جيدا. تحقق من الخلايا لمعرفة تعبير GFP تحت مجهر فلوري.
يجب أن تبدو معظم النصائح الغدة سليمة, وينبغي أن تكون منفصلة عدد قليل من الخلايا الثانوية. استخدام مدورة، ضيقة، 1، 000 ميكرولتر ماصات تلميح لخلايا بلطف ثلاث إلى خمس مرات لتعطيل الأنسجة الغدة الملحقة. ثم، استخدام ضيقة جدا، مدورة، 1، 000 ميكرولتر ماص تلميح مرة واحدة إلى مرتين لإضفاء الطابع الفردي على الخلايا.
السماح للخلايا لتسوية لمدة 15 دقيقة. تأكد من أن الخلايا تبدو صحية تحت المجهر، وإزالة الوسط الزائد. ثم، نقل الخلايا إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر، وشطف الآبار مع المتوسطة الطازجة لاسترداد أي الخلايا المتبقية.
يمكن استخدام بناء Abd-B-GAL4 في هذه التجارب لتسمية الخلايا الثانوية ولكن ليس الرئيسية مع GFP. في هذه الدراسة، تم فرز كلا النوعين من الخلايا من النوع البري والغدد الملحقات iab-6cocuD1 متحولة. هذا D1 متحولة تفتقر إلى التعبير عن عبد B وMSA النصوص، والتي تؤثر على تطوير الخلايا الثانوية، مورفولوجيا، والوظيفة.
بعد تفكك الخلية، يتم استخدام FACS لتحديد الخلايا الحية على أساس DRAQ7، ويستخدم مستوى الفلورس GFP لعزل الخلايا الثانوية والخلايا الرئيسية. يتم استخراج RNA من كل مجموعة خلايا ويتم تعديلها إلى اثنين من نانوغرام لكل عينة لRT-qPCR اللاحقة والتسلسل. ويكشف القياس الكمي للتعبير عن جينات محددة عن طريق PCR الكمية في الوقت الحقيقي على مستخلصات الخلايا الرئيسية والثانوية من النوع البري أن جينات الخلايا الثانوية Rab19 وMSA يتم اكتشافها من مستخلصات الخلايا الثانوية فقط، في حين يتم الكشف عن ببتيد الجنس الجيني الرئيسي للخلايا فقط من عينات الخلايا الرئيسية.
ويكشف التحليل الرئيسي للمكونات على بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي من ثلاثة أنواع برية وثلاثة نسخ متماثلة متحولة أن النوع البري يكرر كلا من الكتلة قريبة من بعضها البعض وبعيدة عن العينات المتحولة. يظهر تصور القراءات المنحازة إلى جينات معينة أن جينات التدبير المنزلي مثل actin 5C ، والجينات الثانوية الخاصة بالخلايا Rab19 وDve يتم التعبير عنها في كلا النوعين الجينيين. أما بالنسبة لـ MSA، فإن التعبير القوي عن الجين الملاحظ في الذباب من النوع البري يضيع في السلالات المتحولة.
الحصول على ما يكفي من الخلايا الثانوية المنفصلة الحية مهم لإجراء ناجح. وهكذا، تحقق من تشريح وتفكك البروتوكول في تجربة صغيرة النطاق. تسمح هذه الطريقة بفرز كلا النوع الخلوي من الغدة الملحقة من عدد قليل من الذباب، مما يتيح دراسة كيفية تفاعل تلك الخلايا بشكل مستنسخ مع الظروف الوراثية أو البيئية المتعددة.
ومن المعروف أن نجاح الذكور الإنجابية يتأثر بأشياء كثيرة، بما في ذلك النمط الجيني، والعمر، وحالة التزاوج. وينبغي أن سهولة هذه الطريقة تسمح لنا للتحقيق في كيفية تأثير هذه العوامل على النسخ الغدة الملحقة.
