Name: isolating intestinal stem cells from adult drosophila midguts by facs to study stem cell behavior during aging
Uploaded: 2014-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging at JoVE.com

We are grateful to Gabriele Allies for excellent technical assistance. We thank the University Ulm Medical Faculty for the use of the FACS Core Facility and the Institut f&#252;r Molekulare und Zellul&#228;re Anatomie for using the confocal microscope. We thank S. Hayashi for the esg-Gal4, UAS-GFP fly line. This project is funded by the Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Forschungskern SyStaR). A.T. is supported by SFB 1074 (Project A2). A.T. and G.A. are supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, FE578/3-1). H.M.T. is a member of the International Graduate School in Molecular Medicine Ulm (GSC 270).

ملاحظة: إذا تم استخدام هذا البروتوكول لأول مرة لعزل ISCS التي كتبها FAC الفرز، والضوابط التالية إلزامية من أجل وضع البداية المعلمات FACS بشكل صحيح: تنفصل الخلايا من النوع البري (على سبيل المثال ث 1118) midguts ذبابة الفاكهة دون Sytox. خلايا فصلها عن نوع البرية (على سبيل المثال ث 1118) midguts ذبابة الفاكهة مع Sytox (انظر الخطوة 3.6). تنفصل الخلايا من midguts من ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران دون Sytox. 1. إعداد الحلول وأطباق لغوت تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 4-6 قارورة تحتوي كل منها على 40 أنثى الذباب من ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من حل 10X PBS الأسهم إعداد 500 مل 1X PBS (1.8 ملي ناه 2 PO 4 · H 2 O، 8.4 ملي نا 2 هبو 4 · 2H 2 O، 175 مم كلوريد الصوديوم، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 3.5٪ محلول الاغاروز في برنامج تلفزيوني 1X (3.5 غرام الكهربائي الصف الاغاروز في 100 مل 1X PBS). إعداد لوحات تشريح بصب هذا الحل في أطباق بتري (قطر 8.5 سم) لتغطية الجزء السفلي. طبقة الاغاروز يمنع تضر نصائح من ملقط أثناء إجراء تشريح. بعد أن طدت هلام تخزين لوحات تشريح في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 300 مل من برنامج تلفزيوني 1X + 1٪ BSA الطازجة قبل تشريح ووضع زجاجة على الجليد أو على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل أجهزة الطرد المركزي وندعه يبرد إلى 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لهب نصائح من 2 الماصات الزجاج باستور لتنعيم الحواف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظيفة اثنين من أزواج من ملقط وشفرة حلاقة واحدة مع 70٪ من الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 05:56 1.5 مل أنابيب microcentrifuge لجمع midguts تشريح على الجليد. </li></ol> 2. إعداد الجهاز الهضمي المسالك وتشريح المعي المتوسط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الذباب من قارورة واحدة (40 الذباب) مع CO 2 على سرير ذبابة القياسية، وقطع رأس كلالذباب باستخدام شفرة حلاقة ونقلها إلى الطبق تشريح. صب الباردة 1X PBS الحل / 1٪ BSA في طبق تشريح لتغطية agarose هلام. سوف الذباب تطفو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على البطن الطاير مع زوج واحد من ملقط، في حين الضغط على الصدر مع الزوج الآخر من الملقط. فصل القفص الصدري من البطن. والقناة الهضمية تكون واضحة وعلى الأرجح لا يزال يتم توصيل المعي الأمامي / المحاصيل إلى القفص الصدري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على القناة الهضمية والخروج به من القفص الصدري. تتكشف القناة الهضمية، والاستيلاء على المحاصيل وسحب الأمعاء قليلا الأمامية بعيدا عن البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على نهاية الخلفي من البطن مع زوج واحد من ملقط وحافة بشرة المفتوحة الأمامية مع الزوج الآخر من الملقط. يجب الحرص على عدم تدمير الأنسجة الأمعاء جاحظ. سحب نهاية الخلفي بعيدا لكسر بشرة ومواصلة سحب الخلف بلطف شديد حتى تم سحب الأمعاء بأكمله من تجويف البطن. قد يكون المحصول المراد إزالتها مسبقا إذا كانت كبيرة جدا لاحتوائهمن خلال تجويف الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المعي الأمامي، الأنابيب مالبيغي، المعى المؤخر والمبايض وترك المعي المتوسط ​​العارية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الزجاج ماصة باستير، ونقل دفعة من midguts تشريح لmicrocentrifuge 1.5 مل أنبوب يحتوي الباردة برنامج تلفزيوني 1X / 1٪ محلول BSA والحفاظ على أنبوب على الجليد. يجب أن تتم معالجة العينات في غضون 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تشريح دفعة كاملة كاملة، شطف طبق تشريح مع الماء المقطر المزدوج ليغسل اليسار على الحطام. بدء تشريح الدفعة التالية من midguts (تكرار الخطوات 2،1-2،7). تشريح العديد من دفعات ممكن في غضون 2 ساعة، ثم انتقل إلى الخطوة 3.1. </li></ol> 3. الهضم من الأنسجة غوت إلى خلايا الحصاد لFAC الفرز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة / 1٪ الحل BSA برنامج تلفزيوني 1X من midguts وإضافة 500 ميكرولتر من 0.5٪ التربسين-EDTA حل لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة جيدا لمدة 20 ثانية واحتضان العينات بواسطة هزاز لطيف / الدورية في 20 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 25-30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة مرة أخرى بعد حوالي 30 دقيقة، والسماح للسليما بالوعة الأنسجة المعي المتوسط ​​إلى أسفل الأنبوب. بعناية إزالة الخلايا التي هي في تعليق مع ملتهب الزجاج ماصة باستير وتصفية لهم من خلال النايلون 35 ميكرومتر إلى شبكة الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الخلايا في أسفل 100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. من ملاحظة، عند البدء في هضم، وبيليه الخلية قد لا تكون مرئية في البداية ولكن سوف تصبح واضحة كما في الأنسجة هضم تقدم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية الحل التربسين إلى العينة أنبوب الأصلي تحتوي على ما تبقى من الأنسجة المعي المتوسط ​​سليمة. تجنب نقل عدد كبير جدا من الخلايا من بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف اعادة تعليق بيليه خلية في 400 ميكرولتر من البرد برنامج تلفزيوني 1X / 1٪ BSA. الحفاظ على أنابيب microcentrifuge تحتوي على خلايا نأت على الجليد وتغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم لحماية الخلايا من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة الحل التربسين التي تحتوي على ما تبقى من الأنسجة المعي المتوسط ​​سليمة مرة أخرى ووضع عيناتعلى الروك لمدة 30 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3.3 إلى 3.4.3 حتى كل من الأنسجة المعي المتوسط ​​تم هضمها. الجمع بين الخلايا فصلها عن جميع أنابيب microcentrifuge في واحدة أنبوب microcentrifuge. قد تتطلب هذه خطوة الطرد المركزي كما هو الحال في 3.4، منذ حجم كل تعليق خلية مجتمعة قد يتجاوز 1.5 مل. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد وحماية الخلايا من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الخلايا نأت إلى أسفل في 100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة بعناية أكبر قدر من طاف ممكن ترك حوالي 50-100 ميكرولتر من / 1٪ الحل BSA برنامج تلفزيوني 1X في أنبوب microcentrifuge. بلطف resuspend الخلايا فصل في 800 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X / 1٪ BSA تحتوي على Sytox (1: 20،000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى 5 مل جولة أسفل أنبوب فالكون من خلال تصفية الخلايا من خلال قبعة مبكرة مصفاة الخلية (35 ميكرومتر شبكة النايلون). دائما الاحتفاظ بعينات خلية على الجليد ومحمية من الضوء. الخلايا هي الآن جاهزة ليتم فرزها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 600 ميكرولتر من حل RNAlater في كل أنبوب microcentrifuge إلى التي سيتم فرز الخلايا لاحقة العزلة RNA. لتطبيقات المصب الأخرى الخلايا يمكن جمعها في حل مختلف، على سبيل المثال في برنامج تلفزيوني العقيمة. </li></ol> 4. FAC الفرز لعزل الخلايا الجذعية المعوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على الصك التدفق الخلوي ساعة واحدة على الأقل قبل الفرز. تأكد من أن نظام فلويديك خال من فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار 70 ميكرون حجم فوهة لحقن الخلايا في مجرى السائل غمد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط السعة للتيار السائل الأساسية بحيث يتوافق مع قيمة الفجوة إلى القيمة المرجعية (6-7، وعند استخدام فوهة 70 ميكرون). السماح للتيار السائل الأساسية تستقر قبل البدء في فرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتباع هذا النظام عندما وضع في البداية المعلمات للفرز: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الخلايا نأت تم الحصول عليها من الشجاعة نوع البرية. أولا، وضبط FSC وSSC الفولتيةلرسم الخلايا في وسط مؤامرة مبعثر. ثانيا، ضبط FITC (GFP) الجهد بحيث يتم رسم جميع الخلايا أقل من 10 2 على لوغاريتمي محور س. تعيين المعلمة FITC يحدد الحد الأقصى لتألق ذاتي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الخلايا نأت تم الحصول عليها من الشجاعة نوع البرية مع Sytox أضافت. ضبط قيمة الأزرق المحيط الهادئ الجهد وبوابة لتحديد وخلايا معيشة منفصلة من الخلايا الميتة Sytox إيجابية في الأزرق المحيط الهادئ مقابل FSC-A مؤامرة مبعثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الخلايا نأت تم الحصول عليها من ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران دون Sytox وضبط الجهد FITC للتأكد من أن كل الخلايا GFP إيجابية يتم رسم ضمن مؤامرة مبعثر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأضاف خط الطيران UAS GFP مع Sytox تحميل الخلايا نأت تم الحصول عليها من ESG -Gal4. ضبط قيمة الأزرق المحيط الهادئ الجهد وبوابة لتحديد وخلايا معيشة منفصلة من القتلى، وخلايا Sytox إيجابية (بوابة P1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين SSC-A وFSC-A بوابة للتعرف على GFP-خلايا إيجابية (على أساس المؤامرة الرسم البياني) على النحو الذي يحدده حجم وتحبب (بوابة P2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين بوابة FSC-H وFSC-W لتحديد واستبعاد الحلل خلية GFP إيجابي على أساس حجمها (بوابة P3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين SSC-H وبوابة SSC-W لتحديد واستبعاد الحلل خلية GFP إيجابية على أساس من تحبب (بوابة P4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البوابة P4 لتصوير الخلايا GFP إيجابية في مؤامرة رسم بياني يوضح عدد الخلايا (العدد) مقابل كثافة GFP. سوف قمتين متميزة من الخلايا GFP إيجابية تكون مرئية. إنشاء بوابة لكل الذروة (بوابات P5 وP6). يحتوي بوابة P5 السكان الخلية التي يتم تخصيبها للISCS ويمكن فرزها بشكل منفصل من الخلايا في بوابة P6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلفية البوابة في مؤامرة كفاف للتحقق من أن اثنين من السكان الخلية متميزة GFP إيجابية تحتوي على الخلايا الحية (قارن مع بوابة P1) والخلايا من الحجم الصحيح (مقارنة مع بوابة P2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرز خلايا في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل يحتوي على 600 &amp; #181؛ ل من حل RNAlater. ويتم الفرز في معدل تدفق منخفض (بحد أقصى 2.0، 70 ميكرون فوهة، 1،000 أحداث / ثانية، و 70 رطل) وتوظيف اتجاهين نقاء النوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اكتمال الفرز، دوامة فورا الخلايا مرتبة لفترة وجيزة والحفاظ على أنابيب microcentrifuge على الجليد حتى الشروع في العزلة RNA أو التطبيقات المصب الأخرى. </li></ol>

<ol>
	<li>Jones, D. L., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+models+and+paradigms+for+stem+cells+ageing.">Emerging models and paradigms for stem cells ageing.</a> Nat. Cell Biol. 13 (5), 506-512 (2011).</li><li>Ot&#237;n, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+aging.">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).</li><li>Signer, R. A., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+stem+cell+aging+and+life+span.">Mechanisms that regulate stem cell aging and life span.</a> Cell Stem Cell. 12 (2), 152-165 (2013).</li><li>Iliadi, K. G., Knight, D., Boulianne, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+Aging+&#8211;+Insights+from+Drosophila.">Healthy Aging &#8211; Insights from Drosophila.</a> Front. Physiol. 3, 106 (2012).</li><li>Biteau, B., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+signaling+regulates+the+proliferation+of+intestinal+stem+cells+in+Drosophila.">EGF signaling regulates the proliferation of intestinal stem cells in Drosophila.</a> Development. 138 (6), 1045-1055 (2011).</li><li>Jasper, H., Jones, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+stem+cell+behavior+and+implications+for+aging.">Metabolic regulation of stem cell behavior and implications for aging.</a> Cell Metab. 12 (6), 561-565 (2010).</li><li>Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+tissue+homeostasis:+dynamic+control+of+somatic+stem+cell+activity.">Maintaining tissue homeostasis: dynamic control of somatic stem cell activity.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 402-411 (2011).</li><li>Wang, L., Jones, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+stem+cell+behavior+in+Drosophila.">The effects of aging on stem cell behavior in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 46 (5), 340-344 (2011).</li><li>Lucchetta, E. M., Ohlstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+midgut:+a+model+for+stem+cell+driven+tissue+regeneration.">The Drosophila midgut: a model for stem cell driven tissue regeneration.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (5), 781-788 (2012).</li><li>Ayyaz, A., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+inflammation+and+stem+cell+homeostasis+in+aging+Drosophila+melanogaster.">Intestinal inflammation and stem cell homeostasis in aging Drosophila melanogaster.</a> Front. Cell Infect. Microbiol. 3 (98), (2013).</li><li>Jiang, H., Patel, P. H., Kohlmaier, A., Grenley, M. O., McEwen, D. G., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine/Jak/Stat+Signaling+Mediates+Regeneration+and+Homeostasis+in+the+Drosophila+Midgut.">Cytokine/Jak/Stat Signaling Mediates Regeneration and Homeostasis in the Drosophila Midgut.</a> Cell. 137 (7), 1343-1355 (2009).</li><li>Ohlstein, B., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+Drosophila+posterior+midgut+is+maintained+by+pluripotent+stem+cells.">The adult Drosophila posterior midgut is maintained by pluripotent stem cells.</a> Nature. 439, 470-474 (2006).</li><li>Micchelli, C. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+stem+cells+reside+in+the+adult+Drosophila+midgut+epithelium.">Evidence that stem cells reside in the adult Drosophila midgut epithelium.</a> Nature. 439, 475-479 (2006).</li><li>Ohlstein, B., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+Drosophila+intestinal+stem+cells+specify+daughter+cell+fates+by+differential+notch+signaling.">Multipotent Drosophila intestinal stem cells specify daughter cell fates by differential notch signaling.</a> Science. 315 (5814), 988-992 (2007).</li><li>Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK+Activity+in+Somatic+Stem+Cells+Causes+Loss+of+Tissue+Homeostasis+in+the+Aging+Drosophila+Gut.">JNK Activity in Somatic Stem Cells Causes Loss of Tissue Homeostasis in the Aging Drosophila Gut.</a> Cell Stem Cell. 3 (4), 442-455 (2008).</li><li>Choi, N. H., Kim, J. G., Yang, D. J., Kim, Y. S., Yoo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+Drosophila+midgut+are+associated+with+PVF2,+a+PDGF/VEGF-like+growth+factor.">Age-related changes in Drosophila midgut are associated with PVF2, a PDGF/VEGF-like growth factor.</a> Aging Cell. 7, 318-334 (2008).</li><li>Park, J. S., Kim, Y. S., Yoo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+p38b+MAPK+in+age-related+modulation+of+intestinal+stem+cell+proliferation+and+differentiation+in+Drosophila.">The role of p38b MAPK in age-related modulation of intestinal stem cell proliferation and differentiation in Drosophila.</a> AGING. 1 (7), 637-651 (2009).</li><li>Berger, C., Harzer, H., Burkard, T. R., Steinmann, J., vander Horst, S., Laurenson, A. S., Novatchkova, M., Reichert, H., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+and+transcriptome+analysis+of+Drosophila+neural+stem+cells+reveals+a+role+for+Klumpfuss+in+self-renewal.">FACS purification and transcriptome analysis of Drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal.</a> Cell Rep. 2 (2), 407-418 (2012).</li><li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing.">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nat. Protoc. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li><li>Yagi, Y., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Drosophila+EGF+receptor+in+determination+of+the+dorsoventral+domains+of+escargot+expression+during+primary+neurogenesis.">Role of the Drosophila EGF receptor in determination of the dorsoventral domains of escargot expression during primary neurogenesis.</a> Genes Cells. 2 (1), 41-53 (1997).</li><li>Amcheslavsky, A., Ito, N., Jiang, J., Ip, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberous+sclerosis+complex+and+Myc+coordinate+the+growth+and+division+of+Drosophila+intestinal+stem+cells.">Tuberous sclerosis complex and Myc coordinate the growth and division of Drosophila intestinal stem cells.</a> J. Cell Biol. 193 (4), 695-710 (2011).</li><li>Dutta, D., Xiang, J., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+expression+profiling+from+FACS-isolated+cells+of+the+Drosophila+intestine.">RNA expression profiling from FACS-isolated cells of the Drosophila intestine.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 13 (27), (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

يصف بروتوكول المعروضة طريقة لعزل ISCS من الشباب والكبار القديم midguts ذبابة الفاكهة، والتي يمكن أن تستخدم لاحقا لمزيد من التحليلات الجزيئية مثل الجيل القادم التسلسل. FAC الفرز من السكان خلية GFP إيجابية من ESG -Gal4، تم تحقيق-UAS GFP خط الطيران بالفعل من قبل العديد من الجماعات 21،22. ولكن، حتى الآن وجود اثنين من القمم متميزة من الخلايا GFP إيجابية تم إما التغاضي أو مقومة بأقل من قيمتها. وتبين لنا أن هذا الفصل لا يمثل سوى اثنين مجموعات مختلفة من أنواع الخلايا (ISCS وEBS)، ولكن أيضا أن اثنين من قمم خلايا GFP إيجابية تبقى منفصلة بوضوح أثناء الشيخوخة. هذه الملاحظة هي ذات أهمية كبيرة وقيمة للباحثين المهتمين في دراسة الخلايا الجذعية أو السلف أثناء الشيخوخة. وقد أعاق عزل ISCS من midguts القديمة من حقيقة أنه لا يوجد مزيج الواسمات الجزيئية لتحديد ISCS في المعي المتوسط ​​العمر. العلامة الوحيدة التي شيحدد nambiguously ISCS في المعي المتوسط ​​القديم هو الفوسفات-histone3 (PH3)، منذ ISCS هي تقسيم الخلايا فقط في المعي المتوسط ​​12،13. ومع ذلك، PH3 هو علامة غير مناسبة لعزل ISCS منذ عدد من تقسيم الخلايا الجذعية في أي نقطة زمنية معينة منخفض جدا من أجل الحصول على مبلغ محترم من ISCS للتحليلات لاحقة. وESG خط الطيران -Gal4، UAS-GFP هو خط الطيران الأكثر شيوعا التي يستخدمها الباحثون الذين يدرسون ISC وظيفة والصيانة والتمايز. ويستند معرفتنا الحالية بشأن تنظيم الجزيئي للISCS التوازن على الدراسات التي تم التلاعب بها جزيئات محددة ومسارات إشارات (استعراضها في 7). بالتالي، لا يزال يفتقرون إلى المعرفة عن التغيرات الجزيئية الداخلية التي تحدث أثناء الشيخوخة. طريقة هنا وصف يغلق هذه الفجوة، ويستند على حقيقة أن ISCS يمكن عزل بناء على حجمها وتحبب وGFP كثافة من midguts الكبار في أي نقطة زمنية أثناء الشيخوخة. في حينإنشاء وتحسين هذه الطريقة وجدنا الخطوات التالية لتكون حاسمة لتحقيق نتائج يمكن الاعتماد عليها. تحتاج ما يقرب من 200 الشجاعة أن تشريح من أجل الحصول على كمية جيدة من ISCS لFAC الفرز. سرعة تشريح أمر بالغ الأهمية ويعتمد على ممارسة الفرد. ويمكن للفرد مدربين تشريح 40 الشجاعة في غضون 20-30 دقيقة. منذ يتم التعبير عن GFP أيضا في الأنابيب مالبيغي في ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران، فمن الضروري لإزالة الأنابيب مالبيغي تماما من المعي المتوسط. يجب أن تظل midguts تشريح في بيئة باردة لتجنب تدهور الأنسجة وتقليل النشاط ريبونوكلياز في الأنسجة. ولذلك، يجب نقل midguts تشريح من الطبق تشريح في أنابيب microcentrifuge تحتوي الباردة 1X PBS الحل / 1٪ BSA بعد كحد أقصى من 20-30 دقيقة، وأبقى على الجليد. ومع ذلك، لا ينبغي أن يترك لتشريح midguts على الجليد لمدة أكثر من 2 ساعة قبل بدء تفكك الأنسجة مع التربسين. الأكثر efficiنهج الأنف والحنجرة هو تشريح العديد من دفعات من الذباب ممكن داخل هذه الساعة 2، ثم تبدأ التربسين هضم لهذه دفعات. إذا هناك حاجة لمزيد midguts، ويمكن تشريح خلال الأوقات حضانة التربسين هضم. وعلى الرغم من التربسين هو انزيم قوية جدا، ويمكن أن يكون لها آثار ضارة على خلايا، ما زلنا الحصول عليها ما يكفي من المعيشة، الخلايا السليمة لاحق FAC الفرز. الخطوة الرئيسية الداخلي في أن يسمح لعزل خلايا سليمة هي أن تتم إزالة الخلايا فصلها من الحل التربسين كل 30 دقيقة. إذا حضنت midguts تشريح لمدة 2 ½ ساعة في التربسين التي تحتوي على الحل في درجة حرارة الغرفة، لاحظنا زيادة 20-30٪ في الخلايا الميتة، Sytox إيجابية. وتجدر الإشارة إلى أن الحل التربسين التي نستخدمها يحتوي على EDTA. وجود EDTA ربما يسهل تفكك الأنسجة التي كتبها مخلبية أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم اللازمة للوظيفة المناسبة من جزيئات المصفوفة خارج الخلية. </P&gt; أهم الخطوات الحاسمة بنجاح لنوع ISCS من الشجاعة الصغار والكبار هي الإعدادات الأولية المناسبة للFACS والمعلمات النابضة باستخدام عناصر التحكم وصفها وبعد تسلسل هرمي محدد الفرز. نحن إجراء FAC فرز على II تدفق عداد الكريات ARIA (البرمجيات FACSDiva). من المهم أن يتم تشغيل الأداة على ساعة واحدة على الأقل قبل الفرز في عملية الاحماء الليزر. من ملاحظة، عندما يتم تنفيذ FAC فرز ISCS لأول مرة، والمعلمات للفرز وضرورة التعويض الواجب تعيين باستخدام ضوابط المذكورة أعلاه: (1) فصل الخلايا من النوع البري (على سبيل المثال ث 1118) midguts ذبابة الفاكهة دون إضافة Sytox - تحديد هذه المعلمة (الخطوة 4.4.1) يمنع فرز الخلايا استنادا تألق ذاتي لهم. (2) فصل الخلايا من النوع البري (على سبيل المثال ث 1118) midguts ذبابة الفاكهة مع Sytox وأضاف - وضع هذه المعلمة(الخطوة 4.4.2) تتيح فصل القتلى من الخلايا الحية (الخلايا الميتة لها تألق ذاتي عالية، ويمكن تلوث الخلايا GFP إيجابية مرتبة)؛ (3) فصل الخلايا من midguts من ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران دون Sytox - وضع هذه المعلمة (الخطوة 4.4.3) يضمن أن جميع الخلايا GFP إيجابية يتم رسم ضمن مؤامرة مبعثر. إذا لم يتم تعيين هذه المعلمات بشكل صحيح، من المرجح أن تحتوي على السكان الخلية فرزها الخلايا الميتة والحطام (الشكل 5B، C)، العديد من الخلايا GFP إيجابية سيفتقد (الشكل 5D) واثنين من القمم متميزة للخلايا GFP إيجابية كما ينظر في المؤامرة الرسم البياني لن يتم الكشف عن (الشكل 2E والشكل 3E). مرة واحدة وقد تم تعيين FACS والمعلمات النابضة، يتم معايرة الصك وعلى استعداد لفرز الخلايا من ESG -GAL4،-UAS GFP خط الطيران. وبما أن هذه المعايير يمكن انقاذه، وكلها المستقبل الفرز جلسات لISCS وEBS من ESG -GAL4، UAS-GFP خط الطيران يمكن أن تبدأ من الخطوة 4.5. وعلى الرغم من اختيار وضع &quot;الطهارة&quot; وأداء نقاء اتجاهين نوع يقلل من عدد الخلايا مرتبة، فإنه يسمح لصرامة فرز أعلى (الخطوة 4.6 و الشكل 4B، C). من المذكرة، والاستفادة من استخدام Sytox بدلا من يوديد propidium لتسمية الخلايا الميتة هي أنه لا يوجد سوى امتداد منخفض في FITC (GFP) القناة، مما يجعل من السهل للتعويض عن غير المباشرة. لدينا وسيلة لإثراء لISCS وEBS، على التوالي، تقوم على فرز الخلايا وفقا لمختلف المستويات GFP التعبير. ومن المحتمل أن يكون خلال الشيخوخة misdifferentiated EBS أيضا عن GFP على مستوى أدنى، ويمكن أن يكون مخطئا كما ISCS. ومع ذلك، منذ الخلايا مرتبة تختلف أيضا من حيث الحجم وتحبب، فإننا نعتقد أن استراتيجية الفرز لدينا هو الأكثر مناسبة لهذا التاريخ لإثراء لISCS وEBS. أيضا، فمن المعروف أن الخلايا في المعي المتوسط ​​الشيخوخة الاحتفاظ بالهوية ISC لديها نواة صغيرة 15. للحصول على مزيد من الوضوح بشأن هوية الخلايا فرزها، يمكن للمرء أن فرز الخلايا من خط المعدلة وراثيا ذبابة الذي يحمل ESG ​​-GAL4، UAS-GFP والشق يشير مراسل التحوير. منذ وقد تبين الشق أن تكون نشطة فقط في EBS 12،13، معزولة ISCS من المعي المتوسط ​​الشباب ستكون سلبية لمراسل الشق، في حين أن EBS ستكون إيجابية لمراسل الشق. ومع ذلك، أثناء الشيخوخة الشق يشير يصبح الشاذة في النسيج المعى المتوسط. لذلك، لا بد من اختبار ما إذا كان هذا التجريبية انشاء هو في الواقع أكثر موثوقية للتمييز بين ISCS وEBS معزولة من المعي المتوسط ​​القديم. لقد استخدمنا بالفعل هذا النهج لتحليل مقارن لTranscriptome على ISCS من midguts الصغار والكبار وحددت عددا من العوامل التي يتم تنظيمها بشكل مختلف خلال الشيخوخة (unpub. observ). بالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الأسلوب لتحليل الاختلافات في التعبير الجيني بين ISCS وEBS. هذا التحقيقالصورة ستوفر نظرة ثاقبة على التغيرات الجزيئية الأولية التي تحدث كما يدخل خلية عملية التمايز. أيضا، فإن العزلة من خلال EBS الشيخوخة واللاحقة التحليلات تسليط الضوء على التغيرات الجزيئية التي يسببها سن misdifferentiation. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن دمجها مع أدوات الوراثية الأخرى المستخدمة في ذبابة الفاكهة لدراسة وظيفة الجين. وباختصار، هذا الأسلوب يوفر نهج غير متحيز للتحقيق في الخصائص الجزيئية والتغيرات في ISCS وEBS أثناء الشيخوخة. هذا هو أداة قيمة من شأنها أن تسهل استكشاف آليات الشيخوخة في الخلايا الجذعية والسلف الكبار.

وهي نتيجة لا مفر منها لتقدم السن هي القدرة تقليل من الأنسجة والأعضاء على البقاء وظيفية. الخلايا الجذعية البالغة ضرورية للحفاظ على توازن الأنسجة وظائف الجهاز، ولكن كما من الكائنات العمر، والخلايا الجذعية أيضا تشهد انخفاضا في السلوك البيولوجية. هذا هو ضار بشكل خاص إلى الأنسجة التي لديها معدل دوران عالية، مثل ظهارة الأمعاء. وتشمل السمات المميزة للخلايا الجذعية الذين تتراوح أعمارهم بين الضرر الجيني، وآليات إصلاح المتضررة، وضعف تنظيم دورة الخلية ومسارات الإشارات misregulated، وكلها تؤثر على سلوك الخلايا الجذعية العادي (استعراضها في 1-3). عن طريق التلاعب مسارات إشارات محددة أو هدمت جينات معينة، لقد اكتسبت نظرة ثاقبة دورهم في تنظيم والحفاظ على سلوك الخلايا الجذعية العادي. لأن معظم هذه التجارب من النهج جزيء مرشح، لدينا القليل جدا من المعرفة حول التغييرات الجزيئية الداخلية التي تحدث في الخلايا الجذعية خلالالشيخوخة. طريقة واحدة لنهج هذا السؤال هو لمقارنة Transcriptome على من الشباب مقابل الخلايا الجذعية القديمة لتحديد الجزيئات التي تتغير بشكل ملحوظ خلال الشيخوخة الملف الشخصي التعبير. للأسف، أعاقت التحديات البيولوجية والتقنية تقدمنا ​​بشأن هذا النهج حتى الآن. ذبابة الفاكهة البطن هو كائن نموذج مناسب للغاية لدراسة الشيخوخة لأنه لديه لمدة قصيرة (حوالي 60-70 يوما) والمعارض الشيخوخة الظواهر (استعراضها في 4). وعلاوة على ذلك، يمكن تسريع عملية الشيخوخة في ذبابة الفاكهة في درجة الحرارة. عندما الحفاظ على الذباب في 29 ° C، وهو النمط الظاهري العمر في الأنسجة المعوية يمكن بالفعل لوحظ بعد 15 يوما 5. وعلاوة على ذلك، ذبابة الفاكهة غير قابلة لعدد كبير من التلاعب الجيني. على وجه الخصوص، برزت المعي المتوسط ​​ذبابة الفاكهة كنظام نموذجا ممتازا لدراسة تأثير مسارات الإشارات المختلفة والتحديات البيئية علىبيولوجيا الخلايا الجذعية المعوية (ISCS) أثناء الشيخوخة (استعراضها في 6-10). ظهارة الأمعاء ذبابة الفاكهة لديها نسبة دوران عالية، وجددت كل أسبوعين في الإناث وعن مرة واحدة في الشهر في الذكور 11. ISCS المقيمين في المعي المتوسط ​​ذبابة الفاكهة لديها القدرة على الانقسام وإنتاج ISC-متجدد النفس وخلية السلف ما بعد الإنقسامية يسمى enteroblast (EB) 12،13. وEB يفرق في إما خلية معوية الاستيعابية أو خلية enteroendocrine إفرازية. لهذا التاريخ، والجمع علامة الوحيدة التي تصف بشكل لا لبس فيه لتكاليف الدعم غير المباشر هو تعبير عن نزهة عامل النسخ (ESG) ويجند الشق دلتا (DL) 14. ومع ذلك، وهذا ينطبق على القناة الهضمية من الشباب والأصحاء فقط. أثناء الشيخوخة، يتميز ظهارة المعي المتوسط ​​زيادة في انتشار ISC 15-17. بالإضافة إلى ذلك، يشير الشاذة الشق يعطل قرار مصير الخلايا الوليدة ISCويدفع misdifferentiation من EBS 15. وهذا يؤدي إلى تراكم الخلايا التي تنشط لإشارات الشق وشارك في التعبير عن ESG ودل، مما جعل دل التعبير غير كافية لتحديد بحسن نية الخلايا الجذعية في المعي المتوسط ​​العمر. صعوبة في تحديد ISCS الحقيقية قد أعاق القدرة على دراسة التغيرات المحلية في ISCS الشيخوخة حتى الآن. لقد تناولت هذه القضية من خلال الاستفادة من ESG -Gal4، UAS-GFP خط الطيران المعدلة وراثيا في أي مستوى من التعبير GFP في ISCS وEBS مختلفة بطبيعتها ويبقى مختلف أنحاء الشيخوخة. وقد وصفت نهج مماثل لعزل neuroblasts اليرقات والخلايا العصبية 18،19. تم تشريح Midguts من الشباب وESG -Gal4 القديمة، الذباب، UAS GFP وفصلها إلى خلايا واحدة. ثم تم فرز الخلايا لخلايا GFP إيجابية باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS). ومن المثير للاهتمام، وفرز GFP إيجابية جells موزعة على اثنين من قمم مختلفة تعتمد على كثافة GFP مضان (GFP عالية ومنخفضة GFP). وعلاوة على ذلك، فإن توزيع الخلايا GFP إيجابية في اثنين من القمم المترابطة أيضا مع حجم الخلية: كانت الخلايا التي عرضت منخفضة الكثافة GFP صغير وكانت أقل الحبيبية في حين أن الخلايا مع كثافة عالية GFP أكبر وأكثر الحبيبية. وتشير هذه الملاحظة أن ISCS أصغر يمكن تمييزها عن EBS أكبر باستخدام FACS على أساس كثافة GFP واختيار المناسب مبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) الإعدادات. يثير الاهتمام والفضول، ظلت قمم اثنين من فصل واضح أثناء الشيخوخة. وعلاوة على ذلك، تغيرت نسبة من قمم اثنين في الطريقة التي يعكس بصمات المذكورة أعلاه midguts الشيخوخة: وهي أن عدد كبير، misdifferentiated زيادات EBS مع مرور الوقت. من هذه النتائج فإننا نستنتج أنه من خلال الفرز للخلايا GFP إيجابية باستخدام إعدادات المعلمة FACS المناسبة يمكننا إثراء لISCS وEBS في أي وقت نقطة دخلال شهر الشيخوخة. وخلاصة القول، ونحن نقدم استراتيجية FACS التي تمكن الباحثين لإثراء لمدة السكان الخلية مختلفة، ISCS وEBS، من midguts ذبابة الفاكهة في أي عمر وعزل هذه الخلايا لمزيد من التحليل، مثل الجيل القادم التسلسل. يسمح هذا سيلة قوية لدراسة الآليات الجزيئية الذاتية التي هي ملازمة لالشيخوخة في سكان المخصب من الخلايا الجذعية أو السلف. فإن البيانات التي تم الحصول عليها من هذه الدراسات تسهيل مما لا شك فيه تحديد جزيئات المحفوظة والتي تكون مهمة في الشيخوخة عبر الأنواع.

<table><tbody><tr><td>Forceps: Dumont, Inox Biologie #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>SefarNitex 03-150um/38 (35 &amp;micro;m nylon mesh)</td><td>Sefar</td><td>3A03-0150-102-00</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Polymax 1040</td><td>Heidolph</td><td>543-42210-00</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.</td></tr><tr><td>SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Stabilization Solution</td><td>Life Technologies</td><td>AM7023</td><td>Other solutions, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Trizol can be used for subsequent RNA isolation</td></tr><tr><td>FACSAria II cell sorter</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Turn on one hour prior to sorting</td></tr></tbody></table>

isolating intestinal stem cells from adult drosophila midguts by facs to study stem cell behavior during aging

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells&#8217; (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.

للحصول بين 50،000-100،000 الخلايا من FAC الفرز، بين 160 و 200 midguts تحتاج إلى تشريح. ومن الواضح أن هذا هو الأكثر تستغرق وقتا طويلا خطوة من الإجراء بأكمله. الرسوم المتحركة هو مبين في الشكل 1A يوضح الخطوات الرئيسية لتشريح امعاء، والتي وصفها بالتفصيل في بروتوكول المقدمة هنا. هذا الإجراء يمكن تعديلها بشكل فردي. ويرد تشريح والجهاز الهضمى كله في الشكل 1B. عندما تكون كافة الأنسجة المعي المتوسط ​​تم هضمها، والاستمرار على الفور مع FAC الفرز. بعد استراتيجية النابضة موضح في البروتوكول يسمح لتحديد نجاح والفرز من السكان الخلية المخصب لISCS وEBS من الشباب (الشكل 2) ومن midguts القديمة (الشكل 3). يتم تعيين بوابة P1 لتشمل الخلايا السليمة الحية وفقط لبوابة الخروج الخلايا الميتة. الخلايا التي رسم فوق 10 3 على وغاريتمي Y-الفأسوعند استخدام قناة الأزرق المحيط الهادئ والذي يعرف بأنه الخلايا الميتة. ويستثنى من النقاط التي مؤامرة أقل من 40 على محور س (FSC-A) هي في معظمها الحطام وبالتالي أيضا (الشكل 2A). في المؤامرة مبعثر من SSC-A مقابل FSC-A ويتم توزيع الخلايا على أساس حجمها وتحبب. للحصول على قرار الأمثل، ويتم وضع الخلايا في مؤامرة مبعثر كما هو مبين في الشكل 2B عن طريق ضبط أنبوب مضخم (PMT) الجهد. في المؤامرات مبعثر FSC-H مقابل FSC-W وSSC-H مقابل SSC-W يتم فصل الخلايا واحد من وحدات العمل والحلل على أساس حجم (الشكل 2C) وبناء على تحبب (الشكل 2D). عندما تصور الخلايا المدرجة في بوابة P4 في مؤامرة الرسم البياني، وفصل واضح للGFP سلبية، GFP منخفض (بوابة P5) وعالية (بوابة P6) خلايا GFP غير مرئية (الشكل 2E). الخلايا العارضة أقل كثافة GFP صغيرة وأقل الحبيبية وتمثل ISCS. الخلايا العارضة العالي GFP كثافة العملياتensity تكون أكبر وأكثر تفصيلا وتمثل EBS. عكس الناسخ (RT) -PCR لدل على كدنا] توليفها من RNA من خلايا كل السكان GFP إيجابية (بوابات P5، P6) كشفت أن إشارة دل هي في الواقع أقوى في الخلايا منخفضة GFP أصغر مما كانت عليه في أكبر، GFP عالية الخلايا (الشكل 2H). الخلايا ثم تم backgated وصفت في المؤامرات كفاف للتأكد من أن GFP منخفض (بوابة P5) وGFP عالية (بوابة P6) الخلايا تختلف من حيث الحجم وتحبب (الشكل 2F) ومازالت على قيد الحياة (الشكل 2G). وتجدر الإشارة، يمكن أن اثنين من قمم GFP إيجابية الخلايا (منخفض GFP وGFP عالية) يكون فقط حاليا بشكل جيد إذا تم معايرة FITC (GFP) قناة باستخدام صحيح الضوابط المبينة في البروتوكول. استخدمت استراتيجية النابضة نفسها عندما يكون الترتيب ISCS المستمدة من الشجاعة القديمة (الشكل 3). المؤامرات مبعثر (شملت رقمالبريد 3A-D)، والرسم البياني (الشكل 3E) والمؤامرات كفاف (الشكل 3F، G) هي مشابهة لتلك التي هو موضح في الشكل (2). وكما ذكر أعلاه، وليس هناك علامة حسنة النية لتحديد ISCS في midguts القديمة، وبالتالي لم يتم تقديم البيانات RT-PCR هنا. ومع ذلك، فإن الملاحظة المثيرة للاهتمام هنا هو أن قمم اثنين تحتوي على GFP منخفض (بوابة P5) أو عالية (بوابة P6) خلايا GFP مفصولين بوضوح أثناء الشيخوخة. وعلاوة على ذلك، فإن عدد الخلايا في عالية (بوابة P6) ذروة GFP يزيد بشكل ملحوظ خلال الشيخوخة، والذي يحاكي بشكل واضح تراكم معروفة من EBS misdifferentiated مع التقدم في السن. ويمكن أيضا أن ينظر إلى التغير في نسبة السكان الخلية اثنين في المؤامرات مبعثر (قارن الشكل 3A-D مع الشكل 2A-D) والمؤامرات كفاف (قارن الشكل 3F، G مع الشكل 2F، G). من هذه النتائج فإننا نستنتج أنه من خلال فرز لGFPخلايا -positive باستخدام FACS نحن يمكن أن تثري لISCS وEBS في midguts الصغار والكبار. للتحقق من صحة نقاء ISCS معزولة وEBS، تم إجراء تحليل نوع آخر (الشكل 4). المؤامرات الرسم البياني للISCS وEBS بعد فرز (الشكل 4B، C) تصور درجات نقاء تتراوح بين 95٪ و 98٪. إذا تم اتباع التسلسل الهرمي للتعيين المعلمات FACS على النحو المبين أعلاه بدقة، وهما السكان خلية مختلفة (GFP منخفضة، وصغيرة وGFP عالية، وأكبر) يمكن بالفعل تمييز في مؤامرة مبعثر GFP مقابل FSC-A (الشكل 5A). هؤلاء السكان الخلية اثنين لا يمكن تمييزها إذا تم تجاهل هذا التسلسل الهرمي (الشكل 5B-D). <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig1highres.jpg" /> الشكل (1): (A) والتخطيطي من الخطوات الرئيسية لديسcting الأمعاء الطاير. أولا، يتم إزالة الرأس (إزالة أجنحة اختيارية)، يليه الفصل بين الصدر والبطن لفضح القناة الهضمية. يتم تحرير القناة الهضمية في وقت لاحق من تجويف الجسم في الخطوات التالية. وتبين الأسهم السوداء تطور تشريح، في حين أن السهام الحمراء الداكنة تدل على الاتجاه سحب. الخطوط الحمراء في الصورة الأخيرة تشير إلى الأمامية والخلفية حدود المعي المتوسط. (B) صورة المجهر الخفيفة من الأمعاء ذبابة الكبار. وصفت المناطق الرئيسية والميزات التشريحية. خطوط حمراء علامة حدود المعي المتوسط. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig2highres.jpg" /> ويسلط الضوء FAC فرز استراتيجية لتحديد وعزل ISCS وEBS من الشباب (7 أيام) midguts لأفضل تصور، والخلايا التي تمثل ISCS باللون الأحمر وأبرزت خلايا تمثل EBS: الرقم 2.باللون الأزرق في المؤامرات مبعثر (AD) والمؤامرات كفاف (F، G). ومن المقرر (A) بوابة P1 لاستبعاد الخلايا الميتة Sytox إيجابية تآمر فوق 10 3 على وغاريتمي المحور ص. يتم تعيين عتبة FSC-A في 40 أيضا لاستبعاد الخلايا الميتة والحطام. وبوابات (B) خلايا لFSC-A وSSC-A لتحديد الخلايا وفقا لحجم وتحبب (بوابة P2). تم استخدام مؤامرة الرسم البياني (E) بالتوازي مع تحديد الخلايا GFP إيجابي في FSC-A مقابل SSC-A مؤامرة مبعثر (B). (C، D) والمؤامرات مبعثر FSC-H مقابل FSC-W و SSC-H مقابل SSC-W تعمل على إزالة الركام والحلل وحدد لفانلات (بوابة P3 في C وبوابة P4 في D). (E) معارض المؤامرة الرسم البياني عدد الخلايا وكثافة GFP بهم. اثنين من القمم، GFP منخفض (بوابة P5) وGFP عالية (بوابة P6) يمكن تمييزها. (F، G) خلايا وبوابات العودة في مؤامرة كفاف للتحقق من أن الخلايا GFP إيجابية متميزة اثنين populatالأيونات هي من الحجم الصحيح (F) وتحتوي على الخلايا الحية (G). (H) الناسخ العكسي (RT) -PCR لدل على كدنا] توليفها من RNA معزولة عن الخلايا الموجودة في الذروة الأولى (بوابة P5) وفي الذروة الثانية (بوابة P6)، على التوالي. يمكن أن يتم الكشف عن المزيد من التعبير DL في الخلايا الموجودة في البوابة P5 مقابل بوابة P6. خدم تويولين كعنصر تحكم التحميل. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52223/52223fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig3highres.jpg" /> الشكل 3: FAC فرز استراتيجية لتحديد وعزل ISCS وEBS من العمر (60 يوما) midguts لأفضل تصور، ويسلط الضوء على الخلايا التي تمثل ISCS باللون الأحمر وأبرز خلايا تمثل EBS باللون الأزرق في المؤامرات مبعثر (AD) وفي. المؤامرات كفاف (F، G). (A) يتم تعيين بوابة P1 لاستبعاد الخلايا الميتة Sytox إيجابية تآمر فوق 10 3 على وغاريتمي المحور ص. يتم تعيين عتبة FSC-A في 40 أيضا لاستبعاد الخلايا الميتة والحطام. من المذكرة، والزيادة التي تعتمد على العمر في الخلايا GFP إيجابية الأكبر هي بالفعل واضحة في هذه المؤامرة. تم بوابات (B) خلايا لFSC-A وSSC-A لتحديد الخلايا وفقا لحجم وتحبب (بوابة P2). تم استخدام مؤامرة الرسم البياني (E) بالتوازي مع تحديد الخلايا GFP إيجابي في FSC-A مقابل SSC-A مؤامرة مبعثر (B). (C، D) والمؤامرات مبعثر FSC-H مقابل FSC-W و SSC-H مقابل SSC-W تعمل على إزالة الركام والحلل وحدد لفانلات (بوابة P3 في C وبوابة P4 في D). (E) معارض المؤامرة الرسم البياني عدد الخلايا وكثافة GFP بهم. اثنين من القمم، GFP منخفض (بوابة P5) وGFP عالية (بوابة P6) يمكن تمييزها. من المذكرة، وارتفاع خلية GFP السكان تحتوي على خلايا أكبر زاد طوكان عدد ن خلال الشيخوخة. (F، G) خلايا بوابات العودة في مؤامرة كفاف للتحقق من أن اثنين من السكان الخلية متميزة GFP إيجابية هم من الحجم الصحيح (F) وتحتوي على الخلايا الحية (G). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52223/52223fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig4highres.jpg" /> كانت أجري تحليل آخر لتحديد نوع نقاء ISCS معزولة وEBS خلايا (A) GFP إيجابية من الشباب (7 أيام) وعمره (60 يوما) midguts FAC فرزها وتظهر المؤامرات الرسم البياني توزيعها: الشكل 4. في قمتين على أساس كثافة GFP. (B) يوضح تحليل آخر نوع نقاء ISCS معزولة من midguts الصغار والكبار وهو&gt; 97٪. (C) تحليل آخر نوع من فرزها Eبكالوريوس من midguts الصغار والكبار يظهر نقاء&gt; 95٪. الشوائب طفيفة قد تنجم عن تبريد مضان أو التالفة ميكانيكيا GFP معربا عن الخلايا التي تسببها إعادة الفرز الخلايا. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52223/52223fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig5highres.jpg" /> الشكل 5: أمثلة من المؤامرات مبعثر التي تظهر البيانات FACS دون المستوى الأمثل، الذي ينظر إليه عندما يتم تعيين المعلمات FACS بشكل صحيح (A) لمحة الممثل FACS من كل الخلايا عندما تم تعيين معلمات FACS بشكل صحيح على أساس الضوابط المبينة في البروتوكول. وحلقت السكان الخلية التي تحتوي ISCS باللون الأحمر وحلقت السكان الخلية التي تحتوي EBS باللون الأزرق. الخلايا دائري باللون الأخضر هي الخلايا الميتة التي لديها تألق ذاتي أقوى مقارنةالخلايا الحية، والتي يتم رسم أقل من 10 3 على وغاريتمي المحور ص. (B) مؤامرة مبعثر تصور نتيجة نموذجية تم الحصول عليها عندما لم يكن معايرة الصك FACS. لم يتم اكتشاف خلايا GFP إيجابية. (C) إذا لم يتم تعيين FSC بشكل صحيح، لا يتم الكشف عن مختلف السكان الخلية GFP إيجابية. (D) إذا لم يتم ضبط FITC (GFP) القناة بشكل صحيح، فإن غالبية GFP- خلايا الإيجابية التي يمكن فرزها لا يتم رسم في المؤامرة مبعثر بل على طول الحافة العليا من هذه المؤامرة. أيضا، في المؤامرة هو موضح هنا، لم يكن تعديل الحد الأقصى لتألق ذاتي، وبالتالي الخلايا التي مؤامرة فوق 10 2 على المحور Y-لوغاريتمي هي autofluorescent في الواقع، ويمكن أن يكون مخطئا كما GFP إيجابية الخلايا.

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging at JoVE.com

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.

عزل الخلايا الجذعية المعوية من الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; Midguts بواسطة FACS لدراسة سلوك الخلية الجذعية خلال الشيخوخة

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly ...

isolating-intestinal-stem-cells-from-adult-drosophila-midguts-facs-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

20.1K Views.  Universität Ulm. Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging. 

Video: Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Cancer Research

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of individual cell populations often makes it difficult to obtain enough material for molecular studies. For example, the accessory gland of the Drosophila male reproductive system contains two distinct secretory cell types. The main cells make up 96% of the secretory cells of the gland, while the secondary cells (SC) make up the remaining 4% of cells (about 80 cells per male). Although both cell types produce important components of the seminal fluid, only a few genes are known to be specific to the SCs. The rarity of SCs has, thus far, hindered transcriptomic analysis study of this important cell type. Here, a method is presented that allows for the purification of SCs for RNA extraction and sequencing. The protocol consists in first dissecting glands from flies expressing a SC-specific GFP reporter and then subjecting these glands to protease digestion and mechanical dissociation to obtain individual cells. Following these steps, individual, living, GFP-marked cells are sorted using a fluorescent activated cell sorter (FACS) for RNA purification. This procedure yields SC-specific RNAs from ~40 males per condition for downstream RT-qPCR and/or RNA sequencing in the course of one day. The rapidity and simplicity of the procedure allows for the transcriptomes of many different flies, from different genotypes or environmental conditions, to be determined in a short period of time.

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Here, we present a protocol to dissociate and sort a specific cell population from the Drosophila male accessory glands (secondary cells) for RNA sequencing and RT-qPCR. Cell isolation is accomplished through FACS purification of GFP-expressing secondary cells after a multistep-dissociation process requiring dissection, proteases digestion and mechanical dispersion.

بروتوكول يستند إلى FACS لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الثانوية للغدد التبعي الذكور Drosophila

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Genetics

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

أساليب للأس الهيدروجيني "التصوير داخل الخلايا" من "سلالة الخلايا الجذعية جريب" في "أنسجة المبيض" المورفولوجية لايف

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Developmental Biology

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

تشريح وتلطيخ المبايض المورفولوجية الخوادر

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

التصوير والتحليل لاتجاهات الأنسجة وديناميات النمو في الظهارة الهوائية النامية Drosophila خلال مراحل البوبال

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

تشريح وتصوير حي للغدد التناسلية ذبابة الفاكهة الجنينية المتأخرة

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

تشريح وتلون ذبابة الفاكهة اليرقات المبايض

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

فيفو السابقين الثقافة من ذبابة الفاكهة العذراء خصية واحدة ذكر الخراجات جرثومة خط: تشريح، التصوير، والمعالجة الدوائية

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these mechanisms is crucial for developing neural regenerative therapies. Drosophila melanogaster is a leading model for studies of neural development but historically has not been exploited to investigate adult brain regeneration. This is primarily because the adult brain exhibits very low mitotic activity. Nonetheless, penetrating traumatic brain injury (PTBI) to the adult Drosophila central brain triggers the generation of new neurons and new glia. The powerful genetic tools available in Drosophila combined with the simple but rigorous injury protocol described here now make adult Drosophila brain a robust model for neural regeneration research. Provided here are detailed instructions for (1) penetrating injuries to the adult central brain and (2) dissection, immunohistochemistry, and imaging post-injury. These protocols yield highly reproducible results and will facilitate additional studies to dissect mechanisms underlying neural regeneration.

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

This article provides detailed protocols for inflicting Penetrating Traumatic Brain Injury (PTBI) to adult Drosophila and examining the resulting neurogenesis.

تحفيز وتحليل تكوين الأعصاب للبالغين في الدماغ المركزي Drosophila

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these ...

عزل الخلايا الجذعية المعوية من الكبار

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ال