Этот метод позволяет транскриптомный анализ редкой популяции клеток из Drosophila мужской аксессуар железы, называется вторичных клеток, и он раскрывает гены, которые делают их критически важными для репродуктивного успеха. В течение одного дня, этот метод позволяет сортировки вторичных клеток из различных генотипов и извлечения общей РНК для последующего секвенирования qPCR или РНК. Иногда проекты ограничиваются редкостью исходного материала.
Этот метод может стать основой для других групп, сталкиваются с проблемой работы с редкой популяцией клеток. Поскольку процедура должна накопить 40 желез, важно практиковать вскрытия. Подготовка самодельных пипетки советы также важно, и поэтому вы должны визуализировать его на видео, как сделать это и подготовить заранее.
Перед началом процедуры, вырезать и пламя круглый, широкий, 200-микролитер советы для обработки желез, и пройти кончик открытия нескольких 1000-микролитер советы возле пламени менее чем за одну секунду, чтобы сузить отверстия. Затем сортировать измененные советы от более узких до более широких в зависимости от их скорости устремления. Для вскрытия подъездной железы, место от 20 до 25 мужчин Drosophila в стеклянной тарелке на льду, и использовать миппы и микроскоп вскрытия для удаления репродуктивного тракта одного самца мухи.
Очистите пару аксессуарных желез от всех других тканей, включая яички и эякулятивную лампу, и перенесите аксессуарные железы на стеклянную пластину, содержащую сывороточный носитель при комнатной температуре. Когда 20 пар аксессуаров железы были собраны, мыть железы в блюдо PBS в течение одной-двух минут при комнатной температуре. В конце стирки перенесите железы в свежеприготовленный диссоциарный раствор и используйте острые щипцы под рассеченным микроскопом, чтобы прочно ущипнуть середину железистой доли.
Используя вторую пару типсов, вырезать ткани с острым кончиком, чтобы отделить проксимальной области соединительной железы и эякуляции протока от части железы, содержащей вторичные клетки. Вырезать желез так, что пептиды могут достичь клеток, которые в противном случае защищены внешним мышечным слоем и вязкой семенной жидкости в люмене железы. Затем используйте предварительно влажный, округлый пламенем, широкий, 200-микролитровый наконечник пипетки для передачи желез в 1,5-миллилитровую трубку.
Для пищеварения тканей поместите трубку в 37-градусный шейкер по Цельсию в течение 60 минут при 1000 вращениях в минуту. В конце инкубации, остановить пищеварение с одним миллилитр сыворотки дополнены среды, и использовать предварительно мокрый, пламя округлые, широкий, 1000-микролитр пипетки отзыв для передачи образцов на 24-хорошо пластины. Проверьте клетки на их выражение GFP под флуоресцентным микроскопом.
Большинство кончиков железы должны выглядеть нетронутыми, и несколько вторичных клеток должны быть отделены. Используйте округлые, узкие, 1000-микролитровый наконечник пипетки, чтобы мягко тритурировать клетки три-пять раз, чтобы нарушить ткани аксессуарной железы. Затем используйте очень узкую, округлую, 1000-микролитровую пипетку один-два раза, чтобы индивидуализировать клетки.
Дайте ячейкам осесть в течение 15 минут. Подтвердите, что клетки выглядят здоровыми под микроскопом, и удалите излишки среды. Затем перенесите клетки в новую 1,5-миллилитровую трубку и промойте колодцы свежей средой, чтобы восстановить оставшиеся клетки.
Конструкция Abd-B-GAL4 может быть использована в этих экспериментах для обозначения вторичных, но не основных ячеек с GFP. В этом исследовании, оба типа клеток были отсортированы из дикого типа и iab-6cocuD1 мутантных аксессуаров желез. Этому мутанту D1 не хватает экспрессии стенограмм Abd-B и MSA, которые влияют на развитие вторичных клеток, морфологию и функцию.
После диссоциации клеток FACS используется для выбора живых клеток на основе ДРАЗ7, а уровень флуоресценции GFP используется для изоляции вторичных клеток и основных клеток. РНК извлекается из каждой популяции клеток и регулируется до двух нанограммов на выборку для последующего RT-qPCR и секвенирования. Количественная оценка экспрессии специфических генов количественным ПЦР в режиме реального времени на основных и вторичных клеточных экстрактах дикого типа показывает, что вторичные клеточные гены Rab19 и MSA обнаруживаются только из вторичных клеточных экстрактов, в то время как основной пептид гена клетки обнаружен только из основных образцов клеток.
Основной анализ компонентов по данным РНК-секвенирования трех диких типов и трех мутантных репликаций показывает, что дикий тип реплицирует оба кластера близко друг к другу и далеко от образцов мутантов. Визуализация считывается в соответствие с конкретными генами показывает, что гены домашнего хозяйства, такие как актин 5C, и вторичные клеточные гены Rab19 и Dve выражены в обоих генотипах. Для MSA, однако, сильное выражение гена наблюдается в диких мух типа теряется в мутант штаммов.
Получение достаточного количества живых диссоциированных вторичных клеток имеет важное значение для успешной процедуры. Таким образом, провести проверку протокола вскрытия и диссоциации в мелкомасштабном эксперименте. Этот метод позволяет сортировки обоих клеток типа аксессуар железы из небольшого числа мух, что позволяет изучить, как эти клетки реагируют транскрипционно на несколько генетических или экологических условий.
Мужской репродуктивный успех, как известно, зависит от многих вещей, в том числе генотипа, возраста и брачного статуса. Простота этого метода должна позволить нам исследовать, как эти факторы влияют на транскрипцию аксессуаров.
