Cette méthode permet une analyse transcriptomique d’une population cellulaire rare de la glande accessoire mâle Drosophila, appelée cellules secondaires, et elle découvre les gènes qui les rendent critiques pour le succès reproducteur. Au cours d’une journée, cette technique permet le tri des cellules secondaires de différents génotypes et l’extraction de l’ARN total pour le séquençage qPCR ou ARN ultérieur. Parfois, les projets sont limités par la rareté du matériel de démarrage.
Cette méthode peut fournir la base pour d’autres groupes confrontés au défi de travailler avec une population de cellules rares. Parce que la procédure doit accumuler 40 glandes, il est important de pratiquer les dissections. La préparation des pointes de pipette maison est également importante, et ainsi vous devriez le visualiser sur la vidéo comment le faire et préparer à l’avance.
Avant de commencer la procédure, coupez et flambez autour, larges, 200 microlitres conseils pour manipuler les glandes, et passer l’ouverture de pointe de multiples pointes de 1000 microlitres près d’une flamme pendant moins d’une seconde pour rétrécir les ouvertures. Ensuite, trier les pointes modifiées de plus étroite à plus large en fonction de leur vitesse d’aspiration. Pour la dissection des glandes accessoires, placez 20 à 25 drosophiles mâles dans un plat en verre sur la glace, et utilisez des forceps et un microscope à dissection pour enlever l’appareil reproducteur d’une mouche mâle.
Effacer la paire de glandes accessoires de tous les autres tissus, y compris les testicules et l’ampoule éjaculatoire, et transférer les glandes accessoires à une plaque de verre contenant du sérum complété milieu à température ambiante. Lorsque 20 paires de glandes accessoires ont été recueillies, laver les glandes dans un plat de PBS pendant une à deux minutes à température ambiante. À la fin du lavage, transférer les glandes à la solution de dissociation fraîchement préparée, et utiliser des forceps pointus sous un microscope disséquant pour pincer fermement le milieu d’un lobe glandulaire.
À l’aide d’une deuxième paire de forceps, couper le tissu avec la pointe pointue pour séparer la région proximale de la glande accessoire et le conduit éjaculatoire de la partie de la glande contenant des cellules secondaires. Coupez les glandes de sorte que les peptidases puissent atteindre les cellules qui sont autrement protégées par la couche musculaire externe et par le fluide séminal visqueux dans le lumen de la glande. Ensuite, utilisez une pointe de pipette pré-humide, arrondie par la flamme, large et de 200 microlitres pour transférer les glandes dans un tube de 1,5 millilitre.
Pour la digestion des tissus, placez le tube dans un shaker de 37 degrés Celsius pendant 60 minutes à 1000 rotations par minute. À la fin de l’incubation, arrêter la digestion avec un millilitre de milieu complété par sérum, et utiliser une pointe de pipette pré-humide, arrondie par la flamme, large, 1000 microlitres pour transférer les échantillons dans une assiette de 24 puits. Vérifiez l’expression de leur GFP par les cellules au microscope fluorescent.
La plupart des extrémités de glande devraient sembler intactes, et quelques cellules secondaires devraient être détachées. Utilisez une pointe de pipette arrondie, étroite, de 1000 microlitres pour triturer doucement les cellules trois à cinq fois pour perturber le tissu accessoire de la glande. Ensuite, utilisez une pipette très étroite, arrondie, de 1000 microlitres pointe une à deux fois pour individualiser les cellules.
Laisser les cellules se contenter de 15 minutes. Confirmez que les cellules semblent saines au microscope et retirez l’excès de milieu. Ensuite, transférez les cellules dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et rincez les puits avec un milieu frais pour récupérer les cellules restantes.
La construction Abd-B-GAL4 peut être utilisée dans ces expériences pour étiqueter les cellules secondaires mais non principales avec GFP. Dans cette étude, les deux types de cellules ont été triés à partir de type sauvage et iab-6cocuD1 glandes accessoires mutantes. Ce mutant D1 n’a pas l’expression des transcriptions Abd-B et MSA, qui affectent le développement des cellules secondaires, la morphologie et la fonction.
Après la dissociation cellulaire, facs est utilisé pour sélectionner les cellules vivantes basées sur DRAQ7, et le niveau de fluorescence GFP est utilisé pour isoler les cellules secondaires et les cellules principales. L’ARN est extrait de chaque population cellulaire et ajusté à deux nanogrammes par échantillon pour le RT-qPCR et le séquençage ultérieurs. La quantification de l’expression de gènes spécifiques par PCR quantitatif en temps réel sur des extraits de cellules principales et secondaires de type sauvage révèle que les gènes des cellules secondaires Rab19 et MSA ne sont détectés qu’à partir d’extraits cellulaires secondaires, tandis que le peptide sexuel du gène cellulaire principal n’est détecté qu’à partir d’échantillons de cellules principales.
L’analyse principale des composants sur les données de séquençage de l’ARN de trois types sauvages et de trois répliques mutantes révèle que le type sauvage reproduit à la fois l’amas près l’un de l’autre et loin des échantillons mutants. La visualisation des lues alignées sur des gènes particuliers montre que les gènes d’entretien ménager tels que l’actine 5C et les gènes secondaires spécifiques aux cellules Rab19 et Dve sont exprimés dans les deux génotypes. Pour msa, cependant, la forte expression du gène observé chez les mouches de type sauvage est perdue dans les souches mutantes.
L’obtention de suffisamment de cellules secondaires dissociées vivantes est importante pour une procédure réussie. Ainsi, vérifiez le protocole de dissection et de dissociation dans l’expérience à petite échelle. Cette méthode permet le tri des deux cellules type de glande accessoire à partir d’un petit nombre de mouches, permettant l’étude de la façon dont ces cellules réagissent transcriptionnellement à de multiples conditions génétiques ou environnementales.
Le succès reproducteur masculin est connu pour être affecté par beaucoup de choses, y compris le génotype, l’âge, et le statut d’accouplement. La facilité de cette méthode devrait nous permettre d’étudier comment ces facteurs affectent la transcription des glandes accessoires.
