أهمية طريقتنا هي تعدد الاستخدامات والفعالية. وهو يسمح للباحثين بالسيطرة القوية على التعبير الجيني الداخلي بطرق كانت صعبة لتحقيق استخدام الأساليب القائمة. وهو يسمح للباحثين بالتحقيق في وظيفة الجين على مستويات التعبير المختلفة وبطريقة ملعقة زمنية.
وبالتالي فإنه يسمح لاختبار عكس النمط الظاهري، وهو أمر مفيد عند دراسة الجينات المتعلقة بالمرض. لإنجاز القمع، تم تصميم الجين المستهدف intron لاحتواء repron R، الذي يحتوي على 12 مشغلي لاك متماثل. عندما يتم التعبير عن مكبوت LacIGY من المروج الأنسجة المطلوبة محددة، يتم قمع الجين الهدف.
يمكن عكس قمع الجين المستهدف أو تعديله إلى مستوى التعبير المطلوب من خلال إدارة IPTG ، وهو خصم من مكاغ LacIGY. لإنجاز رفع التنظيم، تم تصميم المروج الجيني الهدف لاحتواء أربعة أو أكثر من مشغلي تات، T، كمواقع ملزمة لـ rtTA-M2 المنشطات. عندما يتم التعبير عن المنشط من المروج الأنسجة المطلوبة في وجود doxycycline, يتم حث الجين الهدف.
يمكن عكس أو تعديل التراكم للجين المستهدف إلى مستوى التعبير المرغوب عن طريق سحب أو تغيير تركيز الداكسيسيكلين. لإنجاز كل من القمع والتنشيط، يمكن الجمع بين أنظمة لاكبوتور وتات المنشط. لتعديل الجين من الفائدة للقمع، intron خامل النسخ نحو نهاية خمسة رئيس من الجين من الفائدة ينبغي تحديد لإدراج تسلسل repron.
للحصول على التسلسل الجينومي للجينة ذات الاهتمام، انتقل إلى متصفح الجينوم UCSC وحدد أحدث مسودة لجينوم الماوس تحت علامة التبويب الجينوم. أدخل اسم أو رمز الجين الذي يهمك في شريط البحث لعرض النصوص الخاصة بالجين ثم انقر فوق الانتقال. ثم، حدد البديل النص المطلوب للجين من الفائدة وانقر على رمز الجينات بجانب البديل نسخة من الفائدة.
بعد ذلك، ضمن التسلسل والارتباطات إلى أدوات وقواعد البيانات بانر، انقر فوق ارتباط تسلسل الجينوم. للحصول على خيارات منطقة استرداد التسلسل، حدد exons فقط و introns وسجل FASTA الافتراضي لكل جين. لخيارات تنسيق التسلسل، حدد exons في الحالة العليا، كل شيء آخر في حالة أقل وقناع يكرر لN.Then، انقر فوق إرسال.
وأخيراً، حفظ هذا التسلسل، مع الحفاظ على التنسيقات الأحرف الكبيرة والصغيرة في مستند أو برنامج يمكن أن يكون مشروحاً. لتجنب انقطاع جزر Cpg ، حدد إظهار لمسار جزر Cpg تحت شعار التعبير والتنظيم لمتصفح الجينوم UCSC وانقر فوق تحديث. التكبير في على introns رئيس الوزراء خمسة، انقر على كل جزيرة CpG هو مبين باللون الأخضر، وحدد عرض الحمض النووي لهذه الميزة.
بعد تحديد قناع يكرر لN، انقر فوق الحصول على الحمض النووي للحصول على تسلسل جزر Cpg. وأخيراً، تراكب هذه التسلسلات مع ملف التسلسل الأصلي، و تعليق توضيحي هذه كـ مناطق intronic لتجنب. لتجنب المناطق intronic مع التواقيع محسن في الأنسجة من الفائدة، انتقل إلى قاعدة البيانات ENCODE وحدد أيقونة التجارب.
بالنسبة لنوع المقايسة، حدد ChiP-seq أو DNase-seq وقم بملء الفئات الأخرى وفقًا للخلايا التي سيتم هندستها. بعد تحديد الميزة، حدد معظم الرسوم التوضيحية اليسرى باللون الأزرق، حيث تظهر نتائج العرض كقائمة. ثم، حدد مجموعات البيانات لأهداف h3k4 أحادية الوميتيل، h3k27 أسيتيل، DNase 1، و CTCF التي تطابقت مع الخلايا التي سيتم هندستها.
داخل كل مجموعة بيانات ذات صلة، قم بالتمرير إلى قسم الملف، وتحقق من تحديد MM10 و UCSC، ثم انقر فوق الزر Visualize. الآن ، في متصفح الجينوم UCSC ، قم بالتكبير على خمسة introns رئيس الوزراء وانقر على كل قمة في مسارات الذروة المشروحة. الحصول على تسلسل الحمض النووي لكل منطقة الذروة عن طريق النقر على إحداثيات الكروموسومات لكل قمة.
في القائمة المنسدلة طريقة العرض، حدد DNA، وانقر فوق قناع يكرر إلى N.Finally، تراكب هذه التسلسلات مع ملف التسلسل الأصلي و تعليق توضيحي هذه المناطق intronic لتجنب. لتحديد sgRNA في المناطق intronic المتبقية مع خصوصية عالية ودرجات الكفاءة المتوقعة، انتقل إلى أداة تصميم sgRNA على الانترنت من الاختيار، مثل CRISPOR. أدخل تسلسل منطقة إينترونيكس من الفائدة ، وتحديد الجينوم المرجعي ذات الصلة ، واختيار الزخرج المرغوب في protospacer المجاورة.
ثم، انقر فوق إرسال. المقبل ، وفرز sgRNA المتوقعة من قبل درجة التحديد واختيار واحد أو أكثر من sgRNA التي لديها أيضا درجة عالية من الكفاءة المتوقعة. وأخيرا، تصميم قالب الحمض النووي يحتوي على تسلسل منصة الهبوط PITT يحيط بها على كلا الجانبين من قبل 60 قاعدة homology الأسلحة التي تتوافق مع موقع قطع sgRNA.
لعكس الهدف من قمع الجينات ، وإدارة IPTG في مياه الشرب من الفئران ولدت homozygous مع أليل المعدلة من الفائدة عن طريق حل كامل المبلغ المطلوب من IPTG في الماء المقطر العقيمة في يوم الإدارة. التفاف زجاجة مع احباط وإدارة المياه IPTG في زجاجة محمية خفيفة إلى الفئران من النمط الجيني المناسب والضوابط لمدة أسبوع واحد على الأقل. المضي قدما في تحليل التعبير عن جين الاهتمام في الأنسجة المستهدفة.
للحث على رفع مستوى الجين ، وإدارة الدوكسيسيكلين في النظام الغذائي لمدة أسبوع والمضي قدما في تحليل التعبير عن جينة الاهتمام في الأنسجة المستهدفة. qRT PCR anaylisis أظهرت أن تم قمع التعبير DNMT1 إلى 15٪ من المستويات غير المنظمة باستخدام النهج القائم على المروج. تم عكس القمع بطريقة تعتمد على الجرعة من خلال علاج الفئران بكميات متفاوتة من IPTG.
تم التحقق من صحة القمع DNMT1 الملاحظ وعكس القمع DNMT1 من قبل العلاج IPTG على مستوى البروتين عن طريق المناعة. qRT PCR تحليل التعبير mKate2 أظهرت أن النهج القائم على intron حققت أكثر من 90٪ القمع من مشغلي تقع عدة كيلوباسس أسفل المصب من موقع بدء النسخ عن طريق تخفيف الاستطالة النسخ. صور كونفوكال للتعبير mKate2 في intenstine الصغيرة من الفئران مع أو بدون مكبوت LacIGY التحقق من صحة النهج القائم على intron.
تم تحقيق رفع تنظيم قوي وتحريج التعبير DNMT1 في الخلايا الجذعية الجنينية التي تحتوي على أليل DNMT1 الذاتية المعدلة مع تسلسلات المشغل تات ولاك. وكانت كل من اللوائح قابلة للعكس تماما وغير قابلة للدمج من قبل العلاج IPTG و Dox. لوحظ رفع قوي من DNMT1 من الكبد والطحال والكلى.
ومع ذلك، لم يلاحظ أي تراكم يمكن اكتشافه في القلب، مما يشير إلى أن نمط التعبير المعتمد على دورة الخلية لـ DMNT1 وندرة الخلايا التكاثرية في القلب قد يكونا وراء هذه الملاحظة. دراسة وظيفة في الجسم الحي من الجينات الحرجة عن طريق التلاعب التعبير عنه في كثير من الأحيان تحديا بسبب الفتك. طريقة لدينا سمح لنا للتغلب على النمط الظاهري القاتل لجين اهتمامنا ومكننا من دراسة دورها في تكوين الأورام في الجسم الحي.
وبالمثل، فإن هذه التكنولوجيا سوف تمكن من التحقيق في الجينات الأساسية الأخرى التي كان من الصعب دراستها.
