هذه الطريقة، CARIC، يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ما بعد النسخ من الترفيه الجيني من خلال توفير تعداد شامل للبروتينات RNA ملزمة. والميزة الرئيسية لـ CARIC هي قدرته على التقاط البروتينات المرتبطة بأنواع مختلفة من الرنا رنا مثل الرنا ونات غير الترميز. يمكن استخدام هذه الطريقة في أنواع مختلفة والكائنات الحية لدراسة تفاعل البروتين RNA في العمل.
أولاً، الخلايا الهيلا الثقافة في DMEM تكمل في 37 درجة مئوية في جو CO2 خمسة في المئة. عندما تصل الخلايا إلى حوالي 80 في المئة التقاء استبدال الوسط الثقافة على كل طبق مع 15 ملليلتر من قبل الدفء، والمتوسطة الطازجة. إضافة 15 ميكرولترات من الاتحاد الأوروبي 100 ملليمولار إلى كل طبق إلى تركيز النهائي من ملليمتر واحد.
للتجارب ولا عينات التحكم الأشعة فوق البنفسجية إضافة 7.5 ميكرولترات من 100 ميليمولار أربع SU إلى كل طبق. تغطية الأطباق مع احباط وثقافة الخلايا لمدة 16 ساعة باستخدام الشروط السابقة. بعد ذلك، إضافة نصف المبلغ السابق للاتحاد الأوروبي و / أو أربع SU إلى لوحات المناسبة ومواصلة زراعة لمدة ساعتين أخرى.
لتبدأ في الربط عبر الجسم الحي، وإزالة المتوسطة الثقافة وغسل كل طبق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني باستخدام خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل غسل. إزالة برنامج تلفزيوني المتبقية قدر الإمكان. بالنسبة للعينات التجريبية ولا توجد أربع عينات تحكم SU ، ضع الأطباق على الجليد مع إزالة الغطاء.
استخدام الأشعة فوق البنفسجية عبر الرابط لتشعيع الخلايا مع الأشعة فوق البنفسجية في 365 نانومتر وعلى اثنين جول لكل سنتيمتر مربع. للحصول على عينات من الأشعة فوق البنفسجية لا تحكم، وضع الأطباق على الجليد وحمايتها من الضوء. بعد ذلك، إضافة ملليلتر واحد من العازلة قبل التحلل إلى كل طبق.
استخدم رافع الخلايا المطاطية لكشط الخلايا وجمع تعليق ما قبل التحلل في أنبوب 15 ملليلتر. إضافة العازلة قبل تحلل إلى أنبوب يحتوي على تعليق من اثنين من الأطباق ضبط الحجم الكلي إلى ستة ملليلتر. ثم إضافة وحدة تخزين متساوية من R lysis المخزن المؤقت.
تمرير الخلية من خلال حقنة مع إبرة ضيقة عدة مرات حتى lysate واضحة ومتجانسة. احتضان ال ليسات في أربع درجات مئوية مع تناوب لطيف لمدة ساعة واحدة. بعد هذا تمييع lysate في 20 مجلدا من العازلة التخفيف وتقسيمه إلى 15 ملليلتر الكسور في 15 ملليلتر أنابيب untrafiltration، قطع الجزيئية من 10 كيلودالتون.
باستخدام دوار دلو يتأرجح، تدور الأنابيب في 4000 مرات G وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا حتى يتم تركيز كل جزء إلى حجم أقل من ملليلتر واحد. إضافة 14 ملليلتر من تخفيف العازلة إلى كل جزء lysate المركزة وتكرار عملية التركيز. ثم الجمع بين الكسور وتركيزها على حجم من ستة ملليلتر باستخدام عملية التركيز الموصوفة سابقا.
أولاً إعداد مزيج رد الفعل كما هو موضح في بروتوكول النص. إضافة هذا المزيج رد فعل إلى ستة ملليلتر من مسح مسبق lysate وخلط جيدا. إضافة 162.5 microliters من الحد من الكاشف ويخلط جيدا.
احتضان في درجة حرارة الغرفة على شاكر المدارية في 800 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين. بعد هذا يروّي التفاعل بإضافة خمسة ملليمتر EDTA واحتضان على شاكر المدارية في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، تقسيم خليط التفاعل بين أنبوبين 50 ملليلتر، كل منها يحتوي على أربعة مجلدات من الميثانول المبردة مسبقاً واحتضان في درجة حرارة سالبة 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
جهاز طرد مركزي في 4000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. تجاهل السوبر و إضافة بين ملليلتر واحد واثنين من الميثانول قبل المبردة إلى بيليه. Pipet صعودا وهبوطا لتفريق بيليه التأكد من أن بيليه ينتهي علقت تماما مع عدم وجود قطع مرئية.
كرر عملية الطرد المركزي وإعادة التبجين مرتين. بعد هذا، استخلاص بعناية من الميثانول المتبقية قدر الإمكان التأكد من عدم إزعاج بيليه. إضافة 10 ملليلتر من العازلة إعادة تشكيل و pipet صعودا وهبوطا إلى حل بيليه.
جهاز طرد مركزي في 4000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم نقل supernatant إلى أنبوب جديد مع التأكد من جمع 20 ميكرولترات من العينة لمراقبة الجودة. نقل تنظيف وإعادة تشكيل العينة إلى الخرز agarose streptavidin المعدة.
احتضان في أربع درجات مئوية مع تناوب لطيف بين عشية وضحاها. تدور أسفل الخرز في 4000 مرة G لمدة خمس دقائق. نقل المابير إلى أنبوب جديد مع التأكد من جمع 20 ميكرولترات من العينة لمراقبة الجودة.
اغسل الخرز بـ 10 ملليلتر من عازل الغسيل A.Incubate مع دوران لطيف عند 12 دورة في الدقيقة وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم تدور أسفل الخرز في 4000 مرة G لمدة خمس دقائق. إزالة اابر وكرر عملية الغسيل والطرد المركزي مرة أخرى.
كرر عملية الغسيل هذه لغسيل العازلة B وغسل العازلة C كما هو مبين في بروتوكول النص. بعد ذلك، قم بغسل الخرز بـ 10 ملليلتر من هيدروكلوريد 50 ملليمولار تريس. تدور حبات أسفل في 4000 مرات G لمدة خمس دقائق.
إزالة supernatant وتقسيم الخرز بالتساوي بين اثنين من أنابيب microcentrifuge 1.5. للبدء في الاستخفاف RNPs القبض ، إضافة 400 ميكرولترات من عازلة elution الحيوية المعدة إلى 400 ميكرولترات من الخرز غسلها ، واستقر. احتضان على شاكر المدارية في 1500 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
ثم احتضان على شاكر المدارية مع كتلة الحرارة في 1500 دورة في الدقيقة و 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الطرد المركزي الخرز في 7800 مرات G لمدة دقيقة واحدة وجمع RNP مراوغة. إضافة 400 ميكرولترات من عازلة التن الحيوي الطازجة إلى الخرز.
كرر عملية الحضانة والطرد المركزي لجمع elute الثانية والجمع بين elutes اثنين في أنبوب واحد 15 ملليلتر. بعد ذلك، إضافة ثلاثة مجلدات من العازلة التخفيف إلى elutes RNP مجتمعة لتقليل تركيز SDS. باستخدام أنبوب الترشيح فائقة 0.5 ملليلتر، تركز العينة إلى حوالي 40 ميكرولترات كما هو مبين في بروتوكول النص.
إضافة 0.5 ميكروغرام لكل ميكروليتر RNase A واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين للافراج عن RBPs من RNase عبر المرتبطة. جمع اثنين microliters من RBPs لمراقبة الجودة. عند تحسين بروتوكولات CARIC، تكون خطوات ضبط الجودة أمرًا بالغ الأهمية.
يتم تنفيذ مراقبة الجودة التمثيلية للعينات التي تحمل علامة النقرة عن طريق تحليلات الفلورس في الجل. فقط العينة ذات المسمى مضاعف يظهر عصابة تشويه قوية في الوزن الجزيئي العالي الذي يمثل إشارة RNPs عبر المرتبطة. يتم إلغاء إشارة RNP عن طريق حذف إما الوحدة الخاصة الأربعة أو الاتحاد الأوروبي. ويمكن أيضا أن يتم إلغاؤها عن طريق الهضم مع RNase A.In بعض الحالات لوحظ وجود شريط لطخة قوية في أي عينة مراقبة SU أربعة.
يمثل هذا النطاق RNase غير المرتبط بـ "غير متقاطع" والذي سوف يتحلل أثناء التثاب الحراري في معظم الحالات. يتم تقييم مراقبة الجودة من بيانات استطلاع تقارب من خلال تحليل لطخة الغربية التي تظهر إشارات البيوتين في العينات على حد سواء قبل الانسحاب وبعد الانسحاب. ويكشف تحليل تلطيخ الفضة من RBPs القبض على أن لخلايا هيلا، والكفاءة الإجمالية التقاط العام هو بين 0.05 و 0.1 في المئة من البروتينات المدخلات.
أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن RNase حساسة لريبونوكليس. الحفاظ على بيئة تجريبية نظيفة قدر الإمكان للحد من الخفض من RNase. بعد هذا الإجراء، يمكن تحديد ألمك البروتين باستخدام قياس الطيف الشامل preformed للكشف عن البروتينات التي تحد الحديد.
بعد تطويرها ، فإن تقنية CARIC تمهد الطريق لفهم أكثر شمولا لتنظيم النسخ البريدي OT في العمل.
