Diese Methode, CARIC, kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Posttranskription der Generholung zu beantworten, indem sie eine umfassende Zählung von RNA-bindenden Proteinen bereitstellt. Der Hauptvorteil von CARIC ist seine Fähigkeit, Proteine zu erfassen, die an verschiedene Arten von RNAs gebunden sind, wie z. B. mRNAs und nicht-kodierende RNAs. Diese Methode kann in verschiedenen Arten und dem Organismus verwendet werden, um die RNA-Protein-Interaktion bei der Arbeit zu untersuchen.
Erstens, Kultur HeLa Zellen in ergänztDMEM bei 37 Grad Celsius in einer fünf Prozent CO2-Atmosphäre. Wenn die Zellen etwa 80 Prozent Zusammenfluss erreichen, ersetzen Sie das Kulturmedium auf jedem Gericht durch 15 Milliliter vorgewärmtes, frisches Medium. Fügen Sie 15 Mikroliter 100 Millimolar EU zu jeder Schale zu einer endgültigen Konzentration von einem Millimolar hinzu.
Für experimentelle und keine UV-Kontrollproben fügen Sie 7,5 Mikroliter von 100 Millimolar vier SU zu jeder Schale. Bedecken Sie die Gerichte mit Folie und kulturdie Zellen für 16 Stunden unter den vorherigen Bedingungen. Danach die Hälfte der bisherigen EU-Menge und/oder vier SU zu den entsprechenden Platten hinzufügen und weitere zwei Stunden kultivieren.
Um mit der In-vivo-Vernetzung zu beginnen, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie jede Schale dreimal mit PBS mit fünf MilliliterPBS pro Wäsche. Entfernen Sie die Rest-PBS so weit wie möglich. Für die experimentellen und keine vier SU-Kontrollproben legen Sie die Teller auf Eis, wobei der Deckel entfernt wird.
Verwenden Sie einen UV-Verkreuzer, um die Zellen mit UV-Licht bei 365 Nanometern und bei zwei Jules pro Zentimeter quadratisch zu bestrahlen. Für die keine UV-Kontrollproben, legen Sie die Gerichte auf Eis und schützen Sie sie vor Licht. Als nächstes fügen Sie jedem Gericht einen Milliliter Prelysepuffer hinzu.
Verwenden Sie einen Gummizellenheber, um die Zellen zu kratzen und die Prelysesuspension in einem 15 Milliliter Rohr zu sammeln. Fügen Sie einen Prelysepuffer in ein Rohr ein, das die Suspension von zwei Schalen enthält, wodurch das Gesamtvolumen auf sechs Milliliter eingestellt wird. Fügen Sie dann ein gleiches Volumen des R-Lyse-Puffers hinzu.
Passieren Sie die Zelle mehrmals mit einer schmalen Nadel durch eine Spritze, bis das Lysat klar und homogen ist. Das Lysat bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation für eine Stunde inkubieren. Danach verdünnen Sie das Lysat in 20 Volumen des Verdünnungspuffers und teilen Sie es in 15 Milliliter-Fraktionen in 15 Milliliter-Untrafiltrationsröhren, molekulare Cutoff von 10 Kilodalton.
Mit einem schwingenden Schaufelrotator drehen Sie die Rohre bei 4000 mal G und vier Grad Celsius für etwa 15 Minuten, bis jede Fraktion auf ein Volumen von weniger als einem Milliliter konzentriert ist. Fügen Sie 14 Milliliter Verdünnungspuffer zu jeder konzentrierten Lysatfraktion hinzu und wiederholen Sie den Konzentrationsprozess. Dann die Fraktionen kombinieren und mit dem zuvor beschriebenen Konzentrationsprozess auf ein Volumen von sechs Millilitern konzentrieren.
Bereiten Sie zunächst den Reaktionsmix vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie diese Reaktionsmischung zu den sechs Millilitern vorgereinigten Lysats hinzu und mischen Sie sie gut. 162,5 Mikroliter Reduzierendes Reagenz hinzufügen und gut vermischen.
Inkubieren Sie bei Raumtemperatur auf einem Orbital-Shaker bei 800 Rpm für zwei Stunden. Nach diesem Löschen der Reaktion durch Zugabe von fünf Millimolaren EDTA und Inkubation auf dem Orbital-Shaker bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Als nächstes teilen Sie die Reaktionsmischung zwischen zwei 50-Milliliter-Röhren auf, die jeweils vier Volumina von vorgekühltem Methanol enthalten und 30 Minuten lang bei minus 30 Grad Celsius brüten.
Zentrifuge bei 4000 mal G und vier Grad Celsius für 15 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie zwischen einem und zwei Milliliter vorgekühltem Methanol in das Pellet. Pipetten Sie nach oben und unten, um das Pellet aufzubrechen, um sicherzustellen, dass das Pellet vollständig und ohne sichtbare Brocken aufgehängt wird.
Wiederholen Sie den Zentrifugations- und Resuspensionsprozess zweimal. Ziehen Sie danach das Restmethanol so weit wie möglich heraus, um sicherzustellen, dass das Pellet nicht gestört wird. Fügen Sie 10 Milliliter Rekonstitutionspuffer und Pipetten nach oben und unten hinzu, um das Pellet aufzulösen.
Zentrifuge bei 4000 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Dann übertragen Sie den Überstand auf ein neues Rohr, um sicherzustellen, dass 20 Mikroliter der Probe für die Qualitätskontrolle zu sammeln. Die gereinigte und rekonstituierte Probe auf die vorbereiteten Streptavidin-Agarose-Perlen übertragen.
Bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation über Nacht inkubieren. Drehen Sie die Perlen bei 4000 mal G für fünf Minuten. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues Rohr, um sicherzustellen, dass 20 Mikroliter der Probe für die Qualitätskontrolle gesammelt werden.
Waschen Sie die Perlen mit 10 Milliliter Waschpuffer A.Inkubieren Mit sanfter Rotation bei 12 Umdrehungen bei 12 Umdrehungen und bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann drehen Sie die Perlen bei 4000 mal G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Wasch- und Zentrifugationsprozess erneut.
Wiederholen Sie diesen Waschvorgang für Waschpuffer B und Waschpuffer C, wie im Textprotokoll beschrieben. Danach die Perlen mit 10 Milliliter50 Millimolar Tris Hydrochlorid waschen. Drehen Sie die Perlen bei 4000 mal G für fünf Minuten nach unten.
Entfernen Sie den Überstand und teilen Sie die Perlen gleichmäßig zwischen zwei 1,5 Mikrozentrifugenrohren. Um den gefangenen RNPs auszublenden, fügen Sie 400 Mikroliter vorbereiteten Biotin-Elutionspuffers zu 400 Mikrolitergewaschenen, abgesetzten Perlen hinzu. Inkubieren Sie auf einem Orbital-Shaker bei 1500 Rpm bei Raumtemperatur für 20 Minuten.
Dann auf einem Orbital-Shaker mit einem Wärmeblock bei 1500 Rpm und 65 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 7800 mal G für eine Minute und sammeln Sie die ausentgangene RNP. 400 Mikroliter frischer Biotin-Elutionspuffer zu den Perlen geben.
Wiederholen Sie den Inkubations- und Zentrifugationsprozess, um eine zweite Elute zu sammeln und die beiden Elues in einem einzigen 15-Milliliter-Rohr zu kombinieren. Als nächstes fügen Sie den kombinierten RNP-Elues drei Volumen des Verdünnungspuffers hinzu, um die Konzentration von SDS zu verringern. Konzentrieren Sie die Probe mit einem 0,5-Milliliter-Ultrafiltrationsrohr auf etwa 40 Mikroliter, wie im Textprotokoll beschrieben.
Fügen Sie 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter RNase A hinzu und brüten Sie bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden, um RBPs von der vernetzten RNase zu befreien. Sammeln Sie zwei Mikroliter RBPs für die Qualitätskontrolle. Bei der Optimierung von CARIC-Protokollen sind Qualitätskontrollschritte von entscheidender Bedeutung.
Die repräsentative Qualitätskontrolle der klickbeschriftten Proben erfolgt über In-Gel-Fluoreszenzanalysen. Nur die doppelt beschriftete Probe zeigt ein starkes Abstrichband bei dem hohen Molekulargewicht, das das Signal vernetzter RNPs darstellt. Das RNP-Signal wird abgeschafft, indem entweder die vier SU oder die EU weggelassen werden. Es kann auch durch Verdauung mit RNase abgeschafft werden A.In einige Fälle wird ein starkes verschmiertes Band in der Nr. 4 SU-Kontrollprobe beobachtet.
Dieses Band stellt die beschriftete unvernetzte RNase dar, die sich während der Wärmeinnaturierung in den meisten Fällen verschlechtern wird. Die Qualitätskontrolle der Affinitäts-Umfragedatenwirdin wird durch Western-Blot-Analyse bewertet, die die Biotinsignale in den Proben sowohl vor dem Pulldown als auch nach dem Pulldown zeigt. Eine Silberfärbungsanalyse der erfassten RBPs zeigt, dass bei HeLa-Zellen die Gesamterfassungseffizienz zwischen 0,05 und 0,1 Prozent der Eingabeproteine liegt.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die RNase empfindlich auf Ribonukleasen reagiert. Halten Sie die experimentelle Umgebung so sauber wie möglich, um die Entmagnetisierung von RNase zu reduzieren. Nach diesem Verfahren kann die Protein-Almake-Identifikation mittels Massenspektrometrie vorgeformt werden, um die eisenbindenden Proteine zu enthüllen.
Nach ihrer Entwicklung wird die CARIC-Technik den Weg für ein umfassenderes Verständnis der Posttranskriptions-OT-Verordnung am Arbeitsplatz ebnen.
