Bu yöntem, CARIC, RNA bağlayıcı proteinlerin kapsamlı bir nüfus sayımı sağlayarak gen rekreasyon post-transkripsiyon alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. CARIC'in en büyük avantajı, mRNA'lar ve kodlamayan RNA'lar gibi çeşitli RNA türlerine bağlı proteinleri yakalayabilme yeteneğidir. Bu yöntem çeşitli tiplerde ve organizmada rna protein etkileşimini iş yerinde incelemek için kullanılabilir.
İlk olarak, kültür HeLa hücreleri destekli DMEM 37 santigrat derece bir yüzde beş CO2 atmosferinde. Hücreler yaklaşık yüzde 80 birleştiğinde her çanak üzerinde kültür ortamı yerine 15 mililitre önceden ısıtılmış, taze ortam. Bir milimolar son konsantrasyoniçin her çanağa 100 milimolar AB 15 mikrolitre ekleyin.
Deneysel ve uv kontrol numuneleri için her çanağa 7,5 mikrolitre 100 milimolar dört SU ekleyin. Önceki koşulları kullanarak 16 saat boyunca folyo ve kültür hücreleri ile bulaşıkları kaplayın. Bundan sonra, uygun plakalara önceki AB ve/veya dört SU miktarının yarısını ekleyin ve iki saat daha ekmeye devam edin.
Vivo çapraz bağlama başlamak için, kültür ortamı nı çıkarın ve yıkama başına beş mililitre PBS kullanarak PBS ile her yemeği üç kez yıkayın. Kalan PBS'yi mümkün olduğunca çıkarın. Deneysel ve dört SU kontrol numunesi için, kapakları çıkarılmış buz üzerine yerleştirin.
Hücreleri 365 nanometre de UV ışığıyla ve santimetre karesi iki jules'a ışınlamak için uv çapraz bağlantı cihazı kullanın. UV kontrol numuneleri olmadan bulaşıkları buza yerleştirin ve ışıktan koruyun. Sonra, her çanağa bir mililitre prelysis tamponekleyin.
Hücreleri kazımak ve 15 mililitrelik bir tüp içinde prelyz süspansiyon toplamak için bir kauçuk hücre kaldırıcı kullanın. Toplam hacmi altı mililitreye ayarlayan iki tabaktan süspansiyon içeren bir tüpe prelyzis tamponu ekleyin. Sonra Eşit hacimli R lysis arabelleği ekleyin.
Lysate açık ve homojen olana kadar hücre lisatını dar bir iğne ile birkaç kez şırıngadan geçirin. Lysate'yi bir saat boyunca hafif bir dönüşle dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bundan sonra seyreltme 20 hacimli seyreltme tampon ve 15 mililitre untrafiltration tüpleri 15 mililitre fraksiyonları, 10 kilodaltonmoleküler kesme bölün.
Sallanan bir kova rotator kullanarak, her fraksiyon bir mililitreden daha az bir hacme yoğunlaşana kadar tüpleri 4000 kez G ve dört santigrat derecede yaklaşık 15 dakika döndürün. Her konsantre lysate fraksiyonuna 14 mililitre seyreltme tamponu ekleyin ve konsantrasyon işlemini tekrarlayın. Daha sonra kesirleri birleştirin ve daha önce açıklanan konsantrasyon işlemini kullanarak altı mililitrelik bir hacimde yoğunlaştırın.
Önce metin protokolünde belirtildiği gibi reaksiyon karışımını hazırlayın. Bu reaksiyon karışımını altı mililitre önceden temizlenmiş lysate'ye ekleyin ve iyice karıştırın. Reaktifi azaltmak için 162,5 mikrolitre ekleyin ve iyice karıştırın.
İki saat boyunca 800 rpm'de bir orbital shaker üzerinde oda sıcaklığında kuluçka. Bu beş milimolar EDTA ekleyerek ve beş dakika oda sıcaklığında orbital shaker inkübünle reaksiyon söndürmek sonra. Daha sonra, reaksiyon karışımını her biri önceden soğutulmuş metanol ve 30 dakika boyunca negatif 30 santigrat derecede inkübün içeren iki adet 50 mililitrelik tüp arasında bölün.
4000 kez G ve 15 dakika boyunca 4 santigrat derece santrifüj. Supernatant atın ve pelet için önceden soğutulmuş metanol bir ve iki mililitre arasında ekleyin. Peletin görünür parçalar olmadan tamamen askıya alınmasından emin olmak için peleti parçalamak için yukarı ve aşağı borular.
Santrifüj ve resuspension işlemini iki kez tekrarlayın. Bundan sonra, dikkatle pelet rahatsız değil emin olmak için mümkün olduğunca artık metanol dışarı çekin. 10 mililitre yeniden yapılanma tamponu ekleyin ve peleti eritmek için yukarı ve aşağı borular.
4000 kez G ve 10 dakika boyunca 4 santigrat derece santrifüj. Daha sonra supernatant'ı yeni bir tüpe aktarın ve kalite kontrolü için numunenin 20 mikrolitresini topladığızdan emin olun. Temizlenmiş ve yeniden oluşturulmuş numuneyi hazırlanan streptavidin agarose boncuklara aktarın.
Bir gecede hafif bir dönüşle dört santigrat derecede kuluçkaya yat. Boncukları 4000 kez G'de beş dakika boyunca aşağı çevirin. Supernatant'ı yeni bir tüpe aktarın ve kalite kontrolü için numunenin 20 mikrolitresini topladığız dan emin olun.
10 mililitre yıkama tamponu A.Incubate ile boncukları 12 rpm'de ve oda sıcaklığında 10 dakika hafif bir dönüşle yıkayın. Sonra boncukları 4000 kez G'de beş dakika boyunca aşağı çevirin. Supernatant çıkarın ve yıkama ve santrifüj işlemini bir kez daha tekrarlayın.
Bu yıkama işlemini, metin protokolünde belirtildiği gibi yıkama tamponu B ve yıkama tamponu C için tekrarlayın. Bundan sonra, 50 milimolar Tris hidroklorür 10 mililitre ile boncuk yıkayın. Boncukları 4000 kez G'de beş dakika boyunca aşağı çevirin.
Supernatant çıkarın ve iki 1,5 mikrosantrifüj tüpler arasında eşit boncuk bölün. Yakalanan RNP'lerden sıyrılmaya başlamak için, 400 mikrolitre yıkanmış, yerleşmiş boncuklara 400 mikrolitre hazırlanmış biotin elüsyon tamponu ekleyin. 1500 rpm'de oda sıcaklığında 20 dakika boyunca orbital shaker'da kuluçkaya yat.
Sonra 1500 rpm ve 65 santigrat derece 10 dakika boyunca bir ısı bloğu ile bir yörünge shaker inkübate. Bir dakika için 7800 kez G boncuk santrifüj ve kaçan RNP toplamak. Boncuklar taze biotin elüsyon tampon 400 mikrolitre ekleyin.
İkinci bir elute toplamak ve tek bir 15 mililitrelik tüp iki elutes birleştirmek için kuluçka ve santrifüj işlemi tekrarlayın. Daha sonra, SDS konsantrasyonu azaltmak için kombine RNP eutes seyreltme tampon üç cilt ekleyin. 0,5 mililitrelik ultra filtrasyon tüpü kullanarak, örneği metin protokolünde belirtildiği gibi yaklaşık 40 mikrolitreye yoğunlaştırın.
Mikrolitre RNase A başına 0,5 mikrogram ekleyin ve çapraz bağlı RNase'den RbPs'i serbest bırakmak için iki saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kalite kontrol için iki mikrolitre RP toplayın. CARIC protokolleri optimize edilirken, kalite kontrol adımları çok önemlidir.
Tıklama etiketli numunelerin temsili kalite kontrolü jel floresan analizleri ile gerçekleştirilir. Sadece iki katı etiketli örnek çapraz bağlı RNP sinyalini temsil eden yüksek molekül ağırlığında güçlü bir yayma bandı gösterir. RNP sinyali dört SU veya AB'yi atlayarak kaldırılır. Ayrıca rnase ile sindirim ile kaldırılabilir A.In bazı durumlarda güçlü bir bulaşmış bant hiçbir dört SU kontrol örneğinde gözlenir.
Bu bant, çoğu durumda ısı yalıtımı sırasında bozulacak olan çapraz olmayan RNase etiketli temsil eder. Yakınlık anketi verifisinin kalite kontrolü, numunelerde hem aşağı çekmeden önce hem de aşağı çekildikten sonra biyotin sinyallerini gösteren batı leke analizi ile değerlendirilir. Yakalanan RP'lerin gümüş boyama analizi, HeLa hücreleri için toplam yakalama veriminin giriş proteinlerinin yüzde 0,05 ila yüzde 0,1'i arasında olduğunu ortaya koymaktadır.
Bu prosedürü denerken RNase ribonükleazduyarlı olduğunu hatırlamak önemlidir. RNase'nin bozulmasını azaltmak için deneysel ortamı mümkün olduğunca temiz tutun. Bu işlemden sonra, kütle spektrometresi kullanılarak protein tanımlaması, demire bağlı proteinleri ortaya çıkarmak için önceden oluşturulabilir.
Geliştirilmesinden sonra, CARIC tekniği iş yerinde posta transkripsiyon OT yönetmelik daha kapsamlı bir anlayış için önünü açacaktır.
