رنا المناعة جنبا إلى جنب متبوعا بالتسلسل، أو RIPiT-Seq، هو وسيلة لتحديد ما هي المناطق من الجيش الملكي النيبالي ملزمة بزوج معين من البروتينات ملزمة RNA. الميزة الأكثر فريدة من RIPiT هو قدرته على استهداف اثنين من البروتينات المختلفة في تنقية اثنين. وهذا يوفر وسيلة قوية لإثراء مركب بروتين الحمض النووي الريبي متميز من المجمعات الأخرى.
أيضا، RIPiT-Seq هو UV crosslinking مستقلة، ويمكن تطبيقها على العديد من البروتينات التي تعمل على RNA دون ربط مباشرة. في حين أن هذه الطريقة لا تمتد مباشرة نحو العلاج أو التشخيص، وقد ارتبطت البروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة ومعالجة الحمض النووي الريبي مع العديد من الأمراض مثل اعتلال الأعصاب والسرطان. RIPiT-Seq يوفر أداة لدراسة وظائف البروتينات المرتبطة بالأمراض الحمض النووي الريبي ملزمة.
RIPiT-Seq يتطلب نظام حيث يمكن التعبير عن البروتين الموسومة epitope. وقد تم اختباره فقط في خلايا HEK293، وهو الأكثر قابلية لثقافة الخلية. ومع ذلك، الآن مع قدرتنا على وضع علامة على البروتينات باستخدام CRISPR، RIPiT-Seq يمكن أن تكون قابلة للتطبيق على النظم الحديثة المتنوعة.
يعتمد نجاح RIPiT على اثنين من الاعوداد المناعية الفعالة ، لذلك سيكون من الضروري تحسين ظروف المناعة للجسم المضاد المستخدم. أيضا، العمل مع الجيش الملكي النيبالي يتطلب الاحتياطات المناسبة، لذلك ينبغي استخدام الكواشف الخالية من RNase أثناء وبعد استخراج الحمض النووي الريبي. إثبات الإجراء سيكون لورين وودوارد، طالبة دراسات عليا في مختبري.
ابدأ بغسل الخلايا أحادية الطبقة بلطف مع 15 ملليلتر من PBS المبردة لكل لوحة 15 سنتيمترًا. ثم كشط من الخلايا إلى 30 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وجمعها في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 400 غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، والتخلص من supernatant.
إضافة أربعة ملليلترات من الجليد الباردة العازلة تحلل تحلل واستخدام ماصة P1000 لإعادة تعليق الخلايا. نقل lysate إلى أنبوب خمسة ملليلتر واحتضان على الجليد لمدة 10 دقائق. ضع الليسات في حمام جليدي و sonicate وفقًا لاتجاهات المخطوطات.
ثم إضافة 108 ميكرولترات من خمسة كلوريد الصوديوم الضرس لضبط تركيز الملح إلى 150 ملليمولار. ثم، الطرد المركزي في 12،000 ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية، وجمع 20 ميكرولترات من عظمى لتحليل لطخة الغربية. قبل غسل الخرز العلم agarose وفقا لاتجاهات المخطوطات وتطبيق السوبر المتبقية إلى 750 ميكرولترات من الخرز في أنبوب خمسة ملليلتر.
احتضان الخرز agarose العلم مع استخراج الخلية لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات في أربع درجات مئوية مع خلط لطيف. بعد الحضانة، بيليه الخرز عن طريق الطرد المركزي في 400 غرام لمدة دقيقة واحدة في أربع درجات مئوية، وجمع 20 ميكرولترات من ااغض لتحليل لطخة الغربية. تجاهل الماخرة المتبقية وغسل الخرز عن طريق resuspending لهم في أربعة ملليلتر من العازلة غسل ايزو.
بيليه الخرز مرة أخرى وإزالة supernatant. تمييع RNase I في 750 ميكرولترات من مخزن الغسيل ISO وفقا لاتجاهات المخطوطات، وإضافته إلى الخرز agarose العلم. احتضان الخليط في أربع درجات مئوية مع خلط لطيف، ثم بيليه الخرز عن طريق الطرد المركزي.
جمع 20 ميكرولترات من supernatant لتحليل البقعة الغربية ، وتجاهل بقية. ثم، وغسل الخرز مع تخزين غسيل ISO كما هو موضح سابقا. المقبل، أداء elution تقارب بإضافة 375 ميكرولترات من عازلة elution إلى الخرز، وهز الخليط بلطف في أربع درجات مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين.
بعد الحضانة، بيليه الخرز وجمع 15 ميكرولتر aliquot من elution لتحليل لطخة الغربية. بينما هو جار elution تقارب، أداء الخرز المغناطيسي المضاد للجسم. تبدأ عن طريق غسل 50 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي في ملليلتر واحد من ايزو غسل العازلة.
resuspend الخرز في 100 ميكرولترات من العازلة اقتران وإضافة كمية مناسبة من الأجسام المضادة. ثم، احتضان الخرز لمدة 10 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة. غسل الخرز المغناطيسي مرتين مع العازلة اقتران وإعادة ربط الخرز في 375 ميكرولترات من العازلة التخفيف RIPiT.
تخزين الخرز على الجليد حتى المناعة. تطبيق elution تقارب العلم إلى الخرز المغناطيسي المضادة- مقترنة واحتضان مع خلط لطيف لمدة ساعة إلى ساعتين في أربع درجات مئوية. التقاط الخرز المغناطيسي مع المغناطيس وجمع 15 ميكرولترات من عظمى لتحليل البقعة الغربية.
ثم، وغسل الخرز سبع مرات مع تخزين غسيل ايزو. المضي قدما في denaturing elution عن طريق إعادة حبات المغناطيسي في 100 ميكرولترات من عازل عينة واضحة وتحتضن التعليق على الجليد لمدة 10 دقائق. أثناء الاحتضان، نفض الغبار دوريا الخرز لإعادة تعليق لهم.
التقاط الخرز المغناطيسي على المغناطيس وجمع 15 ميكرولترات من elution لتحليل البقعة الغربية. نقل elution المتبقية إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. لاستخراج الحمض النووي الريبي، إضافة 320 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase و 400 ميكرولترات من الكحول ايساميل الفينول الكلوروفورم إلى elution RIPiT.
دوامة الخليط ومن ثم الطرد المركزي في 12،000 غرام لمدة خمس دقائق. جمع 350 ميكرولترات من المرحلة مائي في أنبوب منفصل. إضافة خلات الصوديوم، كلوريد المغنيسيوم، الجليكوجين، والإيثانول إلى العينة التي تم جمعها وتحتضن الخليط بين عشية وضحاها في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية.
في اليوم التالي, بيليه الجيش الملكي النيبالي من قبل الطرد المركزي في 12, 000 غرام لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية وغسلها في 70٪ الإيثانول. بعد غسل الإيثانول، تعامل مع الحمض النووي الريبي T4 مع كيناز متعدد النوى، أو PNK، دون أي ATP، وإجراء تنقية الفينول الكلوروفورم وفقا لاتجاهات المخطوطات. Resuspend RNA نظيفة في 4.5 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase.
لتحديد العائد RNA، radiolabel الجيش الملكي النيبالي مع PNK و 32P المسمى ATPs وفقا لتوجيهات المخطوطات. استخدام سلم الحمض النووي المدى المنخفض و 20 إلى 40 نيوكليوتيدات الاصطناعية oligo لحجم وكمية المعايير. حل الحمض النووي الريبي المسمى على 26٪ من هلام اليوريا بولياكريلاميد.
جفف الجل وفقًا لاتجاهات المخطوطة وتعرّض الجل إلى phosphoscreen حتى يتم اكتشاف إشارة كافية. وقد استخدمت هذه التقنية للتحقيق في التفاعلات بين مجمع مفرق إكسون أو EJC. تحليل البقعة الغربية من البروتينات تنقية من كل خطوة رئيسية في الإجراء RIPiT تبين أن EJC تنقية يحتوي على كل من EIF4A3 و MAGOH.
لم يتم الكشف عن التحكم السلبي، HNRNPA1، في elution. قوة إشارة البصمة الرنا يرتبط مع كمية تفاعل البروتين RNA. لوحظ وجود بصمة أقوى عندما تم تنفيذ RIPiT على الخلايا المعالجة بالبوروميسين ، مما يزيد من إشغال EJC على الحمض النووي الريبي.
لضمان أن RIPiT قد تم فعالة، من المهم لاختبار كفاءة الملكية الفكرية من قبل لطخة الغربية. من المهم أيضًا تقييم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي قبل المضي في التسلسل العميق. في عام 2018 ، استخدم مختبر سينغ هذه التقنية بنجاح لتنقية نوعين من الاختلافات المتميزة من مجمع تقاطع exon وتحديد أنماط ربط الحمض النووي الريبي.
إذا اختار الباحثون الكشف عن آثار الحمض النووي الريبي مع التصوير الذاتي، ينبغي اتباع جميع إجراءات السلامة الإشعاعية المناسبة والبروتوكولات.
